专利名称：冬虫夏草核糖核苷酸还原酶、编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的参与二磷酸嘧啶核苷出发合成代谢脱氧二磷酸喃唳核苷的核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase,class II)，编码这个酶的基因及其应用。
背景技术：
冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。天然虫草具有严格的寄生性以及特殊的生态环境，故其产量很低，价格高昂。野生冬虫夏草由于受生长环境等因素制约，资源匮乏。由于近几年在人工栽培上进展不大，野生冬虫夏草代用品研究多 集中在液体发酵上。利用液体深层发酵培养冬虫夏草菌丝体、提取物或发酵液，是解决冬虫夏草药源的一种有效途径。虫草发酵生产虫草替代品，既可有效保护虫草这一珍贵资源，又不受气候、地理环境和虫草寄生条件严格的限制，适合于工业化大规模生产。生产出的替代品如菌丝体其成分和药效也与天然虫草相似，因而国内外一直致力于虫草菌丝体的发酵培养。人工发酵培养冬虫夏草中国被毛孢得到的菌丝，经毒理、药理、植化研究，证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，可代替天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺，通过对发酵条件的优化，菌丝体生物量和代谢产物的量均有明显提闻。近年来，随着天然产物化学和现代色谱技术的飞速发展，在对虫草产品研发中已逐步由虫草原料或粗提物的直接利用转向更深层次的功能性代谢产物研究。国内外已对虫草代谢产物做了大量的研究，代谢产物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等几大类化合物，其中嘌呤类核苷、虫草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代谢产物在生物合成、药理作用等方面的研究初见成效。核苷类是虫草最主要的活性物质之一，其中嘧啶类核苷包括胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷。尿喃唳核苷(uracil riboside)又称尿苷(ulidine),别称由雪核糖苷、二氢喃唳核苷、1-β-D-喃核糖基尿喃唳。胞喃唳核苷(cytosine riboside)又名胞苷(cytidine)、胞啶、l-β -D-呋喃核苷胞嘧啶。嘧啶核苷是多用途的核苷，可作为保健品和食品的添加剂。它作为美容和抗紫外辐射化妆品也逐渐成为人们生活的必需品，作为药物，已临床应用于中枢神经、泌尿、代谢和心血管等多方面的疾病，在美国，核酸类药品近年来在抗病毒、抗肿瘤方面显示了不可替代的作用。由于嘧啶核苷及其类似物的重要生理作用，国内外有关微生物生产嘧啶类核苷已有很多研究。然而作为重要合成代谢嘧啶类核苷的冬虫夏草菌，还只停留在代谢产物成分分析和功效的研究上，对冬虫夏草菌嘧啶类核苷合成代谢途径中相关基因和蛋白的研究还很少见。
发明内容
本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢二磷酸嘧啶核苷的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与二磷酸嘧啶核苷出发合成代谢脱氧二磷酸嘧啶核苷的酶、编码基因及其应用。
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本发明采用的技术方案是本发明涉及一种来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与二磷酸嘧啶核苷出发合成代谢脱氧二磷酸嘧啶核苷的核糖核苷酸还原酶，所述酶具有SEQ ID No.1或SEQ IDNo. 3所示氨基酸序列90%以上同源性，优选其序列为SEQ ID No.1的pynN2蛋白或序列为SEQ ID No. 3的pynN3蛋白；该酶可催化二磷酸嘧啶核苷制备脱氧二磷酸嘧啶核苷。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID No.1或SEQ ID No. 3所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。由二磷酸嘧啶核苷合成代谢获得脱氧二磷酸嘧啶核苷的路径如下
权利要求
1.一种冬虫夏草核糖核苷酸还原酶，其特征在于所述酶具有SEQ ID No.1或SEQ IDNo. 3所示氨基酸序列90%以上同源性。
2.如权利要求1所述冬虫夏草核糖核苷酸还原酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1 或 SEQ ID No. 3 所示。
3.如权利要求1所述冬虫夏草核糖核苷酸还原酶在生物催化二磷酸嘧啶核苷制备脱氧二磷酸嘧啶核苷中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为以含冬虫夏草核糖核苷酸还原酶菌体发酵培养获得的湿菌体经细胞破碎后的破碎混合液为催化剂，以二磷酸嘧啶核苷为底物，于PH为6. 5^8. 5的缓冲溶液构成的转化体系中，在30°C、150rpm条件下转化反应2 3h，反应结束后，将反应液过滤，取滤液即为含脱氧二磷酸嘧啶核苷的粗品，所述粗品分离纯化获得脱氧二磷酸嘧啶核苷。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的初始浓度为10g/L，所述催化剂的体积用量为100mL/g底物，所述催化剂的干菌体浓度为6. 7mg/mL。
6.一种编码权利要求1所述酶的基因。
7.如权利要求6所述基因，其特征在于所述基因具有SEQID No. 2或SEQ ID No. 4所示核苷酸序列90%以上同源性。
8.如权利要求6所述基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQID No. 2或SEQID No. 4 所示。
9.如权利要求6 8之一所述基因在构建能够生物催化二磷酸嘧啶核苷制备脱氧二磷酸嘧啶核苷的基因工程菌中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的应用为构建含有所述冬虫夏草核糖核苷酸还原酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有冬虫夏草核糖核苷酸还原酶的菌体细胞。
全文摘要
本发明涉及一种来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与二磷酸嘧啶核苷出发合成代谢脱氧二磷酸嘧啶核苷的核糖核苷酸还原酶，编码这个酶的基因及其应用，所述核糖核苷酸还原酶具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列90%以上同源性，其编码基因分别具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列90%以上同源性；本发明从原理上对二磷酸嘧啶核苷合成脱氧二磷酸嘧啶核苷的代谢途径进行了详细研究，包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节脱氧二磷酸嘧啶核苷生物合成基因的表达，赋予宿主脱氧二磷酸嘧啶核苷的高表达性，为扩大脱氧二磷酸嘧啶核苷的产量提供了有效途径，具有重大应用前景。
文档编号C12N15/70GK103045548SQ201210535250
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者郑裕国, 柳志强, 吴晖, 李邦良, 许静, 吴玲芳, 许峰, 薛亚平, 袁水金, 王鸿艳 申请人:浙江工业大学, 杭州中美华东制药有限公司