专利名称：一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法
技术领域：
本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBRGreen I荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
猪增生性肠炎(porcine proliferative enteritis, PPE)是由猪胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis,LI)引起的猪的接触性传染病。胞内劳森氏菌是一种弯曲的专性胞内寄生菌，主要寄生在猪以及其他动物的回肠、结肠、盲肠部位，造成未成熟的肠道上皮细胞腺瘤样增生。目前，该病已呈全球性流行，隐性感染猪较多，损失易被忽视，亚洲地区的中国、日本、韩国及台湾地区近年来多次发生猪增生性肠炎，猪感染率后，导致顽固性·腹泻，造成猪只生长发育迟缓，严重降低饲料报酬率。另外该病经常存在混合感染其它病毒和细菌性疾病，致使临床症状表现更加复杂化，很难做出准确判断，特别是不易与仔猪副伤寒、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪流行性腹泻(PEDV)腹泻性疾病相区别等。因此，建立有效的鉴别诊断方法和检测系统成为进行其他研究的前提条件。荧光染料定量PCR技术是在反应管中加入荧光染料，这种染料可嵌入双链DNA，并且只有在嵌入到DNA后才能被激发产生荧光。随着扩增反应的延伸，荧光信号会因为DNA产物的增加而增加，因此SYBR Green I荧光信号的积累与扩增出的双链DNA的数量成正相关。目前将该方法应用到猪增生性肠炎胞内劳森氏菌检测上的尝试还不多见，本发明旨在建立针对猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的荧光定量PCR快速检测诊断方法，为该病的早期诊断防制及流行病学调查提供技术支持，同时为PPE的分子检测试剂盒的研制打下良好的基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，该方法具有操作简便，敏感性高，重复性好，污染少，用时短和可自动定量分析等优点，能够检测出常规PCR无法检测的病料，同时也免去了 DNA水平电泳的步骤，更加省时，为该病的早期诊断防制及流行病学调查提供技术支持。本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的(I)将回肠或盲肠等病料剪碎后，加入5ml的PBS进行研磨，加入浓度均是1000U/ml的青、链霉素各lml，将组织悬液放入-20°C条件下，反复冻融3次，融化后于12000 rpm离心5111；[11,取上清,加入505、蛋白酶1(混勻，501€下裂解1.511,加入体积比酹:氯仿为1:1的酚和氯仿，使病料组织变性，利于DNA的释放，取下层抽提，取上清液加体积比氯仿异戊醇为1:1的氯仿和异戊醇，提取和纯化DNA，去除其它杂质，再抽提I次，取上清液加1/10体积3M/L的NaAc, 2倍体积无水乙醇，于-20°C下沉淀lh,4°C下12000rpm,离心IOmin,弃上清液，沉淀即为DNA，用75%乙醇冲洗2次，缓慢倒出乙醇，将沉淀室温晾干，加入适量ddH20溶解DNA，于_20°C保存或立即做PCR检测。(2)根据GenBank中的LI aspA基因(AY280626)，设计一对特异性引物，引物序列如下PPE-1-F 5—TAT, GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG-3PPE-1-R 5—TGA, AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC-3其中PPE-1-F / R预期扩增片段为227bp。(3)加入 PCR Mix 12. 5 μ L, 10 ρΜ 上、下游引物各 I μ L，Rnase Free water 8.5μ L，DNA模板或重组质粒2. O μ L，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增94°C 5min ；94°C30s,55°C 30s,72°C 40s，共35个循环；72°C延伸10 min，反应结束后，取5μ PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，将扩增的PCR产物经2%的凝胶电泳分析并回收、纯化。 (4)将回收纯化后的PCR产物连接到pMD18- T Vector上，转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑取单个菌落接种至培养液中过夜振荡培养，提取重组质粒，以提取的质粒DNA作为模板进行PCR鉴定，并将重组质粒进行测序鉴定。(5)提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍系列稀释，共做6个稀释度IO2, IO3, IO4, IO5, IO6, 107，将其作为标准质粒模板。(6)取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，获得扩增动力学曲线及标准曲线。(7)分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌、LI阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC。验证本发明方法的特异性。(8)将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释，选取ΙΟ'ΙΟ-'ΙΟ'ΙΟ—12、10_13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测，以此确定出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，验证本发明方法的敏感性。(9)将已知的标准品分别进行批内、批间重复性试验，验证本发明中方法的稳定性和重复性。(10)对采自山东省内疑似PPE发病猪的盲肠、回肠组织样品及粪便样品处理后，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR扩增，同时设阳性标准对照和阴性对照，用于对比本发明方法的优良之处。其中本发明所述步骤6-10中，所述的荧光定量PCR反应体系如下总反应体积25uL，其中 ddH20 10. 5ul，上游引物 0. 5ul，下游引物 0. 5ul，2X0ne Step SYBR Green IPremix预混酶12. 5ul,质粒模板Iul ;突光定量PCR反应条件如下94°C预变性3 min ；940C 30 s，56°C30s，72°C30s，同时在72°C延伸过程中收集荧光信号，40个循环，同时设溶解曲线反应循环参数为95°C 15 s，60°C 30 s，95°C 15 S。其中将提取的质粒经紫外分光光度计量，标准质粒以10倍梯度稀释为1.75X IO9-L 75X 104拷贝/ uL的阳性质粒模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。其中本发明中Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现出良好的线性关系，相关系数为为R2=O. 9979，斜率为-4. 0055，截距为41. 1919，从而可以得出拷贝数x与Ct值之间的线性关系曲线方程式Ct = -4. 0055X IgX +41. 1919，而待测样品的Ct值可以从实验结果中直接读取；把待测样品的Ct值代入表达式就可以计算出其初始拷贝数(X)。其中在反应结束后进行溶解曲线分析，扩增产物的溶解温度Tm为85. 0-85. 3°C,无非特异性产物和引物二聚体的峰值出现，标准品均一稳定。其中分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌、PPE阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC。这2次扩增PEE质粒模板均出现特异性的扩增动力学曲线，而TGEV、RV、PEDV、大肠杆菌、沙门氏菌均未出现出相应的扩增动力学曲线，表明该方法具有较好的特异性。其中分别进行批内、批间重复试验。批内重复实验验的变异系数CV值平均为
O.76%，批间重复实验的变异系数CV值平均为1. 41%，表明建立荧光定量检测方法具有很好的稳定性。批内重复实验的变异系数均远小于小于3.0%，批间重复性试验CV值均小于4. 0%，试验误差极小，符合统计学规律，充分证实该检测方法具有良好的重复性，这就为PPE在动物体内分布规律即组织嗜性研究、致病机制、PPE早期感染的准确定量研究提供了 一种精确、简便、可靠的研究方法另外PPE荧光定量PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。在20份疑似PPE病料中，常规PCR检出率为35%，而荧光定量PCR检出率为60%以上，检出率大大高于常规PCR。
图1为PPE质粒标准品荧光PCR扩增动力学曲线。图2为PPE荧光定量PCR标准曲线。图3为扩增产物的溶解曲线分析。图4为PPE、TGEV, RV、PEDV荧光定量PCR特异性实验扩增动力学曲线。图5为PPE、大肠杆菌、沙门氏菌荧光定量PCR特异性实验扩增动力学曲线。
具体实施例方式为了使本发明的技术方案更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例(I)引物设计根据根据GenBank登录的LI aspA基因(AY280626)，使用Primer5. O分子生物学软件设计I对引物，送上海生工生物工程公司合成。引物序列如下PPE-1-F 5—TAT, GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG-3PPE-1-R 5—TGA, AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC-3其中PPE-1-F / R预期扩增片段为227bp。(2) DNA模板的提取将回肠或盲肠等病料剪碎后，加入适量的PBS进行研磨，加入抗生素(双抗)将组织悬液放入_20°C反复冻融3次，融化后12000 rpm离心5min。取上清进行DNA的提取；取上清537 μ L，加入60 μ LlO% SDS至浓度为I %，加入3 μ L20mg/mL蛋白酶K至浓度为100 μ g/mL,将其混匀，总体积为600 μ L，50°C，裂解1. 5h ;加入等体积(600 μ L)酚氯仿(取下层)抽提12000rpm,5min ;取上清加等体积氯仿异戍醇再抽提I次；取上清加1/10体积3M/L似4(，2倍体积无水乙醇，沉淀0嫩-201，1.011 ;4°C、12000rpm，离心IOmin,弃上清，沉淀即为DNA，用75%乙醇冲洗2次，(注意缓慢倒出乙醇，勿将DNA倒掉)室温晾干；加入适量ddH20溶解DNA，_20°C保存或立即做PCR检测。(3) RNA模板的提取分别取300μ I的猪流行性腹泻 病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)病毒液，置于无RNA酶的1. 5mlEP管中；在无RNA酶的1. 5mlEP管中，加入800 μ ITrizol裂解液，混匀，静置5min ;加入200 μ I氯仿，振荡混匀，静置15min, 4°C, 12000rpm离心15min ;管内液体分为三层，取上清550μ 1，加入等量预冷的异丙醇(_20°C)，混匀后_20°C放置30min，12000rpm离心lOmin，弃去所有液体；加入1000 μ I 75%乙醇(预冷)洗涤I 一 2次，40C 8000rpm离心5min ;弃上清(离心管在吸水纸上控干)，加入20 μ I DEPC水溶解RNA，_70°C保存或立即使用。(4)猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的aspA基因PCR扩增PPE PCR扩增采用25 PL反应体系，其组份如下PCR Mix 12.5 μ L，10 ρΜ上、下游引物各I μ L, Rnase Free water 8. 5 μ L，DNA模板或重组质粒2. O μ L，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增94°C 5min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C 40s，共35个循环；72°C延伸10 min。反应结束后，取5PL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。(5)猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的aspA基因的克隆与鉴定①将回收纯化的PCR产物与pMD18- T Vector载体相连，连接反应体系为
2 X buffer5. Oul
纯化PCR产物3.Oul
pMD18- T Vector0.5ul
ddH^O0.5ul
T'4 DNA Ligase10 ul将上述反应体系混合均匀后于4°C连接过夜，连接后的产物直接用于转化。②取50μ 感受态细胞，加入连接产物5μ ，冰浴30 min,42°C热休克90_120s，冰浴15 min，加入950μ 不含抗生素的LB液体培养基，37°C 250rpm振荡培养45 min至I h，使菌液复苏并表达抗性，8 OOOrpm离心5 min，弃上清液，加入20()μ 液体培养基重悬沉淀，再加入4PL IPTG (200mg/mL的异丙基硫代一 β -D半乳糖苷)和20μ X_gal (20mg/mL)，混匀，均匀涂布于含5(^g/mL Amp的LB固体平板上，37°C培养14_16h。③上述转化培养的平板中挑取白色单菌落，接种于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜，取1.5 mL菌液12 OOOrpm离心30s，弃上清液，收集菌体，按质粒提取与回收试剂盒说明书进行质粒的提取，质粒命名为PMD18- T-PPE。(6)标准品模板的制备阳性质粒(命名为pMD18- T-PPE)，由上海生物工程有限公司测序鉴定。用碱裂解法提取质粒DNA。用蛋白核酸定量仪测定质粒浓度，参照以下公式计算拷贝数
权利要求
1.一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，其特征在于其检测方法的具体步骤如下(1)提取猪胞内劳森氏菌的DNA，制备检测液；(2)根据GenBank中的LIaspA基因(AY280626),设计一对特异性引物，引物序列如下PPE-1-F 5—TAT, GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG-3PPE-1-R 5—TGA, AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC-3其中PPE-1-F / R预期扩增片段为227bp ；(3)加入PCRMix 12. 5 μ L, 10 ρΜ上、下游引物各 I μ L，Rnase Free water 8.5 μ L, DNA模板或重组质粒2. O μ L，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增94°C 5min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C 40s，共35个循环；72°C延伸10 min，反应结束后，取5μ PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，将扩增的PCR产物经2%的凝胶电泳分析并回收、纯化；(4)将回收纯化后的PCR产物连接到pMD18-T Vector上，转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑取单个菌落接种至培养液中过夜振荡培养，提取重组质粒，以提取的质粒DNA 作为模板进行PCR鉴定，并将重组质粒进行测序鉴定；(5)提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍系列稀释，共做6个稀释度102, IO3, IO4, IO5, IO6, IO7, 将其作为标准质粒模板；(6)取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBRGreen I荧光定量PCR扩增，获得扩增动力学曲线及标准曲线；(7)分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌、LI阳性对照的 DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC，，验证本发明方法的特异性；(8)将已计算出拷贝数的质粒做 ο倍梯度稀释，选取ιο-9、ιο-1(ι、ιο-η、ιο-12、10_13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测，以此确定出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，验证本发明方法的敏感性；(9)将已知的标准品分别进行批内、批间重复性试验，验证本发明中方法的稳定性和重复性；(10)对采自山东省内疑似PPE发病猪的盲肠、回肠组织样品及粪便样品处理后，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR扩增，同时设阳性标准对照和阴性对照，用于对比本发明方法的优良之处。
2.根据权利要求1所述的一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBRGreen I荧光定量 PCR检测方法，其特征在于提取DNA的方法为将回肠或盲肠等病料剪碎后，加入5ml的PBS 进行研磨，加入浓度均是1000U/ml的青、链霉素各1ml，将组织悬液放入_20°C条件下，反复冻融3次，融化后于12000 rpm离心5min，取上清，加入SDS、蛋白酶K混匀，50°C下裂解1.5h，加入体积比酚氯仿为1:1的酚和氯仿，取下层抽提，取上清液加入体积比氯仿异戊醇为1:1的氯仿和异戊醇再抽提I次，取上清液加1/10体积3M/L的NaAc，2倍体积无水乙醇，于-20°C下沉淀lh，4°C下12000rpm，离心lOmin，弃上清液，沉淀即为DNA，用75%乙醇冲洗2次，缓慢倒出乙醇，将沉淀室温晾干，加入适量ddH20溶解DNA，于-20°C保存或立即做PCR检测。
3.根据权利要求1所述的一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤6-10中，所述的荧光定量PCR反应体系如下总反应体积 25uL，其中 ddH20 10. 5ul，上游引物 O. 5ul，下游引物 O. 5ul，2X0ne Step SYBR Green I Premix预混酶12. 5ul,质粒模板Iul ;突光定量PCR反应条件如下94°C预变性3 min ； 940C 30 s，56°C30s，72°C30s，同时在72°C延伸过程中收集荧光信号，40个循环，同时设溶解曲线反应循环参数为95°C 15 s，60°C 30 s，95°C 15 S。
全文摘要
本发明涉及一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法，本发明方法步骤包括猪胞内劳森氏菌DNA的提取﹑引物设计﹑PCR扩增PPE的aspA基因片段﹑猪增生性肠炎的aspA基因的克隆与鉴定﹑标准质粒模板的制备﹑荧光定量PCR的扩增并获得扩增动力学曲线和标准曲线﹑特异性试验﹑敏感性试验﹑重复性和稳定性试验及临床病料样品检测。本发明方法具有良好的特异性﹑敏感性﹑重复性和稳定性，能够简便﹑快速﹑特异﹑敏感的对临床疑似PPE感染或发病猪进行准确的鉴别诊断和早期感染的检测监控。
文档编号C12Q1/68GK102994641SQ20121054586
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者郭显坡, 陈申秒, 蔡培军 申请人:山东滨州沃华生物工程有限公司