专利名称：一种lhx3基因辅助检测黄牛生长性状的方法及其专用试剂盒操作规则的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及基因单核苷酸多态性的检测，特别涉及一种LHX3基因辅助检测黄牛生长性状的方法及其专用试剂盒操作规则。
背景技术：
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander (1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/G/C/T)的变化而引起的多态性。它的变异形式有:颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，基因编码区内的SNPs (cSNPs)比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段:第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection, MAS),该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在畜禽育种中，人们期望，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP) ,PCR-RFLP和直接测序技术等，SSCP它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。
LHX3基因隶属LIM同源框基因家族，所编码的蛋白家族负责LIM结构域形成，该结构域富含独特的半胱氨酸和锌指结合域。LIM同源框基因的蛋白质翻译产物不仅具有与DNA相互结合的保守的同源框结构域(homeo-domain, HD),而且含有2个富含半胱氨酸和组氨酸的蛋白与蛋白互作的LM结构域(LIM domain)，这些UM同源框转录因子(LIMhomeodomain transcription factor)作为一类家族性转录因子调控体内一些基因的表达，决定发育中组织和细胞的特异性分化。LHX3基因的多态性来自于其基因序列中的单碱基变异，迄今为止，已经发现多种LHX3基因的多态性。在人上，已报道的LHX3基因的突变包括:外显子2存在23bp的缺失；Y111C, A210V, E173Ter，and W224Ter。转录因子突变多表现为复合性垂体激素缺乏，如GH、催乳素、促甲状腺激素、促性腺激素。转录因子LHX3的突变可影响垂体的发育，从而引起GH等垂体激素的缺乏。研究揭示，在人上LHX3基因的点突导致该基因对于垂体基因激活调控功能受损，从而引起垂体激素分泌紊乱。该基因突变导致组合型垂体激素缺乏症的发生，颈椎棘突硬化。该基因的突变与生长激素、催乳素、黄体生成素、卵泡刺激素、促甲状腺素的缺乏以及完整的促皮质激素功能有关。而且LHX3基因具有相当程度的多态性，这些多态位点在不同的品种以及同一品种的个体间也有差异。以此为基础，深入研究LHX3的多态性及其表达特征与生产性能的关系，在家畜的品种改良、选育以及实施准确度较高的标记辅助选择(MSA)方面都有重要的应用前景和使用价值。
本实验室的研究结果表明LHX3突变纯合基因型TT对秦川牛群体的生长性状有显著不利影响(P〈0.05)。以上研究表明，LHX3基因可以作为秦川牛生长性状有效选择标记。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种检测黄牛LHX3基因单核苷酸多态性的方法，寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。本发明通过以下技术方案来实现:一种检测黄牛LHX3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含LHX3基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛LHX3基因；琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小；用变性剂处理PCR扩增产物之后，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛LHX3基因第10385位的单核苷酸多态性；所述的引物对P为:上游引物:5’ -TTCCACCGCAGACGAGCCAGC-3 ’ ；下游引物:5’-GCATCGGGGTACACCAAGC-3’ ；所述的PCR扩增反应程序为:95°C预变性 4min ;94°C变性 30s，66.5°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 个循环；72°C延伸IOrnin0琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为
1.5%。所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳质量浓度为10%。所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛LHX3基因第10385位的单核苷酸多态性为:GG基因型表现为10385位为核苷酸G纯合；GT基因型表现为10385位为核苷酸G/T杂合；TT基因型表现为10385位为脱氧核苷酸T纯合；其中，单核苷酸多态性TT基因型为突变纯合基因型。与现有技术相比，本发明具有以下独特的技术效果:本发明根据已公布牛LHX3基因(GenBank Accession N0.AY923832)的序列设计引物，分别以3个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛LHX3基因的部分序列与NCBI公布的序列进行比较，发现在LHX3基因的第10385位存在SNP多态性。针对上述第10385位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，用变性剂处理扩增产物后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。本发明提供的检测方法为LHX3基因的SNP与黄牛部分生长性状进行关联分析，研究表明基因型对秦川牛群体的体重等性状有显著影响(p〈0.05)。以上研究表明，LHX3基因结果表明该位点能够作为提高黄牛体重等生长性状的分子标记，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。本发明还涉及一种用于实施本发明所述方法的专用试剂盒，所述试剂盒内容包括:一、试剂盒引物成分:1.1特异引物，所述的特异弓I物包括:F:5’TTCCACCGCAGACGAGCCAGC 3’R:5'GCATCGGGGTACACCAAGC 3’1.2生化试剂，所述生化试剂包括:`
TaqDNA聚合酶；灭菌超纯水；内含Mg2+、dNTPs 的 2 X Buffer ；包含600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNAMarker I ；二、试剂盒操作说明:2.1PCR操作说明(I) PCR扩增反应体系PCR反应体系见表2。(2) PCR扩增反应程序95°C预变性 4min ;94°C变性 30s，66.5°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 个循环；72°C延伸IOrnin02.2电泳检测与基因型判断( I) PCR产物的琼脂糖电泳检测扩增得到长度为261bp的PCR产物，经用1%的琼脂糖电泳检测，表现唯一的261bp的PCR条带，见图2所示。(2 ) PCR 产物的 SSCP 分析对每个个体扩增片段变性处理后，进行10%聚丙稀酰胺凝胶电泳检测，其个体可以出现GG，或GT，或TT带型，见图4所示。2.3待检个体的选择与淘汰依据表4的分析结果(秦川牛LHX3基因座基因型GG个体的体重显著大于基因型GT和TT个体)，将GT，TT型个体淘汰；GG型个体留种进行扩繁，将形成一个优良的群体。2.4注意事项(I)DNA的提取可以按照以上提供的步骤操作，也可以依据不同厂家的全血DNA提取试剂盒的要求来提取，但是要保证DNA的纯度，若提取效果不佳，需要纯化后再进行后续的试验。(2)反应体系和反应程序可以依据不同的厂家产品的要求来操作，但要保证扩增的特异性和扩增产物的浓度，以免影响后续的试验结果。
图1是本发明的技术流程示意图。图2是本发明用来检测PCR产物片段大小的琼脂糖凝胶电泳(泳道1-4分别代表不同黄牛个体的PCR扩增产物；M SMarker I，条带分别为IOObp, 200bp, 300bp, 400bp,500bp,600bp)。图3是本发明中PCR产物混合测序筛查到的黄牛LHX3基因序列10385位G-T突变测序结果图(黑色方框所指处为单核苷酸突变位置，自上至下分别为GG、GT和TT基因型的测序结果图)。图4是本发明用来检测各样本突变情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳(自左至右泳道分别代表基因型GG、GT和TT的电泳带型)。
具体实施例方式
本发明首先根据NCBI 公布的 LHX3 基因序列(GenBank Accession N0.AY923832)设计引物，分别以3个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与黄牛生长性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。I地方黄牛品种LHX3基因部分DNA序列的克隆1、黄牛样本采集本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1:河南南阳牛(263)，陕西秦川牛(302)，河南郏县红牛(143)；表I黄牛样本的采集
权利要求
1.一种检测黄牛LHX3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于， (1)以包含LHX3基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛LHX3基因， 所述的引物对P为: 上游引物 Pl:5' TTCCACCGCAGACGAGCCAGC 3'； 下游引物 P2:5' GCATCGGGGTACACCAAGC 3'; (2)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(I)中PCR扩增产物片段大小； (3)用变性剂处理步骤(I)中PCR扩增产物之后，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛LHX3基因第10385位的单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述的检测黄牛LHX3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤(I)所述的PCR扩增反应程序为: 95°C预变性4min ;94°C变性30s，66.5°C退火30s，72。。延伸30s，34个循环；72°C延伸IOmin0
3.如权利要求1所述的检测黄牛LHX3基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
4.如权利要求1所述的检测黄牛LHX3基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.如权利要求1所述的检测黄牛LHX3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛LHX3基因第10385位的单核苷酸多态性为:GG基因型表现为10385位为核苷酸G纯合；GT基因型表现为10385位为核苷酸T/C杂合；TT基因型表现为10385位为核苷酸T纯合；其中，单核苷酸多态性TT基因型为突变纯合基因型。
6.权利要求1-5中任意一权利要求所述的检测黄牛LHX3基因单核苷酸多态性的方法在鉴定不同黄牛群体多态性中的诊断应用。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于用于中国黄牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择中的应用。
8.一种用于检测黄牛LHX3基因单核苷酸多态性方法的专用试剂盒，所述试剂盒的内容包括: (1)特异引物，所述的特异引物包括: 上游引物 P1: 5' TTCCACCGCAGACGAGCCAGC 3'； 下游引物 P2:5' GCATCGGGGTACACCAAGC 3'; (2)生化试剂，所述生化试剂包括: TaqDNA聚合酶；灭菌超纯水；内含 Mg2+、dNTPs 的 2 X Buffer ；包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNA Marker I ； (3)操作说明书所述操作说明书包括 PCR操作说明； 电泳检测与基因型判断；待检个体的选择与淘汰； 注意事项。
全文摘要
本发明公开了一种检测黄牛生长性状的基因诊断试剂盒，是一种LHX3基因检测黄牛生长性状的方法，该方法以包含LHX3基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛LHX3基因；通过DNA测序和PCR-SSCP技术进行基因多态性的检测与快速分型。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与秦川牛生长性状密切相关的分子遗传标记，故本发明提供的检测方法可用于秦川牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。本发明检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对LHX3基因第10385位突变的大规模的筛查和诊断。
文档编号C12Q1/68GK103146809SQ201210549050
公开日2013年6月12日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者陈宏 , 黄永震, 靖永杰, 蓝贤勇, 雷初朝, 胡沈荣 申请人:西北农林科技大学