专利名称：鸭瘟病毒gE蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家禽基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种鸭瘟病毒gE蛋白基因及其应用。
背景技术：
近年来我国水禽养殖业发展迅猛，存栏量和出栏量长期保持世界第一的位置，到2010年仅肉鸭的出栏量就达到20. 84亿只。但随着集约化、规模化养殖的发展，各种疾病常导致鸭群大面积死亡，仅2010年因鸭群各种疾病累计造成直接和间接养殖经济损失50亿元。在鸭的多种常发疾病中，鸭瘟流行广泛，传播迅速，发病率高，病死率大，病死率通常在90%以上，对水禽业发展危害极大。初步估计鸭瘟作为鸭群养殖的常见病多发病其常规预防和治疗用药在国内每年至少拥有15亿元销售市场。目前，临床上常用鸭瘟弱毒疫苗来预防鸭瘟疾病，并取得一定的临床效果。但是弱毒疫苗的应用带来的副作用也相对比较突出，比如弱毒疫苗存在毒力返强的风险、临床难以区分野毒和疫苗毒、无法根除鸭瘟疾病等。因此，临床急需开展鸭瘟基因工程标记疫苗的研究来改进上述疫苗的缺点，为彻底根除水禽业的鸭瘟疾病打下基础。病原鸭痕病毒(Duck Plague Virus)属于疱疫病毒科疱疫病毒属中的滤过性的病毒。鸭瘟病毒的DNA具典型的疱疹病毒DNA的特征，大小约为150kb，两端为末端重复序列，中间有内部重复序列。囊膜蛋白为疱疹病毒的主要保护性抗原，它在介导病毒进入细胞，以及病毒的成熟与释放中·均起重要的作用。疱疹病毒gE基因是疱疹病毒从视网膜、嗅觉上皮细胞、三叉神经节侵入中枢神经组织所必需的毒力基因，对疱疹病毒在体内毒力表达、侵袭神经和沿着神经传递起着决定性的作用。疱疹病毒gE蛋白对于病毒感染及复制都是非必需的。疱疹病毒中，囊膜糖蛋白不仅介导病毒对靶细胞的感染而且还是被感染的宿主免疫系统识别的主要抗原。随着DNA重组技术的发展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速发展，其中亚单位疫苗成为当前新型疫苗的研究热点。通过基因工程制备的鸭瘟gE蛋白亚单位疫苗，成本较低且蛋白质量稳定，并且可以激发机体的免疫应答，无疑具有重要的现实意义和市场开发价值。但是，目前鸭瘟gE蛋白的重组表达效率很低，难以满足实际生产的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸭瘟病毒gE基因及其应用，即一种能够高效表达鸭瘟病毒gE蛋白的核苷酸，及其作为疫苗的应用。本发明一个方面提供一种用于编码鸭瘟病毒gE蛋白的核苷酸，其序列为SEQ IDNO :1。本发明还涉及上述序列为SEQ ID NO :1的核苷酸的互补序列。本发明提供一种表达载体，所述的表达载体所携带有上述的核苷酸。上述的鸭瘟病毒gE蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO :2。
本发明的鸭瘟病毒gE蛋白在制备鸭瘟病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。本发明获得的鸭瘟病毒基因工程亚单位疫苗经肌肉接种10日龄鸭瘟病毒阴性鸭，接种14日后取血测鸭瘟抗体,免疫组鸭瘟抗体全部为阳性,有效率达到100%，而对照组未检测到抗体。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的鸭瘟病毒基因工程亚单位疫苗可以引起鸭的免疫应答。
图1 :gE基因优化前后表达量比较的Western印迹图。
具体实施例方式本发明优化得到了表达量高的鸭瘟病毒gE基因，基因表达获得重组蛋白具有很好的抗原性，可以防御鸭瘟病毒，从而促成了本发明。本发明依赖于在遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。下列资源包括了对本发明有用的一般方法学的描述Sambrook et al.，M0LE⑶LAR CLONING: ALABORATORY MANUAL (2nd Ed. , 1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION; ALABORATORY MANUAL(1990) and Ausubel etal. , Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(1994)。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。一、鸭瘟病毒gE基因的密码子优化由于目前已知序列的猪瘟病毒的gE基因序列高度保守，因此选择鸭瘟Anatidherpesvirusl株的gE基因序列进行密码子优化,应用在原核细胞中的优势密码子,减少稀有密码子造成的外源蛋白低表达甚至不表达的发生。优化后的gE基因核苷酸序列为SEQID NO :1，其翻译的氨基酸序列为SEQ ID N0:2。将优化后的gE基因序列送基因公司进行全基因合成。二、基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得1.构建pET-E表达载体(I)设计引物根据优化后的gE基因序列SEQ ID NO :1利用Primer 5. 0软件设计基因扩增引物，引物上下游分别引入限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI作用位点(下划线)，设计引物如下 gE-F: 5' GGAATTCATGATGGTTACCTTCATC' 3 (EcoRI)gE-R: 5' ACTCGAGTTAGATACGGAAAGAAGATT' 3 (XhoI)融合标签使用了 pET载体上的N端的6个His氨基酸标签。根据基因公司合成的gE基因序列(SEQ ID NO 1)为模板扩增目的基因。PCR 反应体系如下5 X PrimeSTARE Buffer 10 u L ；dNTP Mixture (2. 5 mM)4 uL ；PrimeSTARE HS DNA Polymerase 0.5 U L ;模板 0.5 iiL;引物 I y L/l u L ；ddH2033 u L0按以下参数在PCR仪上进行反应98 °C预变性30 S，然后以98 V 10 S、55 V15 s、72 °C I min进行25个循环。反应完毕后取5 y L反应产物，1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
(2) PCR产物回收灌制可上样50 ii L的1. 0 %琼脂糖凝胶，将PCR扩增产物分别加入电泳上样孔中，指示剂迁移至适当位置时停止电泳，在365 nm紫外光下切下含目的片段的凝胶，移入1.5 mL EP管中，称取重量后，参照天根生物技术公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)说明书进行。2、gE基因片段连接到pET载体上并转化DH5a感受态细胞(I) gE基因与pET载体质粒分别利用EcoR I和Xho I酶进行双酶切。酶切体系如下EcoRI 2 u L ,Xho I 2 u L, IOXH Buffer 5 u L,DNA 模板 10 u L,加水至 50 u L。(2)酶切后目的片段的回收双酶切产物通过1. 0%琼脂糖回收胶，将上述酶切反应体系中各加入5 V- L IOXLoading buffer, 80 V电泳待指示剂迁移至距凝胶前沿1. 5 cm时停止电泳，分别切割符合理论值的目的片段的琼脂糖凝胶，使用天根生物技术公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)回收所需片段。(3)连接反应根据载体片段与插入片段摩尔数比为1: 2 10的原则，设计连接体系如下PET酶切后片段I iiL ;酶切后E基因5 uL ；T4 DNA Iigase I uL ；10Xligation buffer I u L ；dd H2O 2 U L, 16°C连接过夜。(4)连接产物转化E. coli DH5 a感受态细胞取E. coli DH5 a感受态菌液各100UL，加入连接反应产物10 UL，用手指轻轻弹几下后放冰水浴30 min。42 °C水浴热刺激90 S，迅速放置冰水浴广2 min，每管各加300 u L LB培养液(无抗性)，37 1摇床培养45min。混匀上述菌液，取适量菌液(200 y L)均匀涂布于含Kan+抗性的LB平板，待菌液完全被培养基吸收后倒置平皿，37 1孵箱培养过夜。
(5)阳性转化子的筛选与鉴定Kan+ LB平板有菌落生长，挑取分隔良好的菌落分别接种于LB液体培养基(Kan+抗性)中，37 1摇床培养过夜。吸取I UL菌液，作为菌液PCR模板鉴定阳性克隆。阳性克隆的测序由华大基因公司完成，将测序后的序列与优化后的gE基因序列进行核酸序列的Blast分析，构建完成质粒命名为pET-gE。测序结果表明制备的质粒插入了正确的目的片段。3、pET-gE 质粒转化 E. coli BL21(DE3)感受态细胞(I) pET-gE质粒的提取,采用质粒抽提试剂盒(Takara公司),参照说明书操作。(2) ￡1'飞￡质粒转化此21(0￡3)感受态细胞中(步骤同转化DH5 a感受态细胞)。(3)挑5个单菌落在Kan+ LB液体培养基中培养，通过全菌PCR鉴定阳性克隆。挑一株阳性克隆命名为BL21-pET-gE菌株。三、工程菌BL21-pET-gE表达目的蛋白gE-His1、1卩丁6诱导乩21-口￡!'1￡菌株表达重组工程菌BL21-pET_gE经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色观察目的蛋白表达，并通过Western印迹鉴定为融合His标签的gE蛋白。收集诱导表达的重组菌按照1:9(w/v)的比例混匀于PBS缓冲液中，于超声波细胞破碎仪冰浴超声破菌至菌液不再粘稠，将裂解液进行差速离心700g离心20min，弃沉淀，上清离心12000g离心20min,分别收集超声上清和沉淀,用同体积的缓冲液重悬沉淀,制备样品进行SDS-PAGE和Western印迹分析。结果表明目的蛋白的表达形式主要是包涵体。2、目的蛋白的纯化(I)包涵体的洗涤沉淀分别以包涵体洗涤液重悬，4°C搅拌洗涤40min。12000rpm离心20min，弃上清，重复洗涤一次。上述沉淀以包涵体洗涤液II重悬，4°C搅拌20min。12000rpm离心20min，弃上清，重复洗涤一次。(2)包涵体的溶解上述沉淀与包涵体溶解液以1:9 (w/v)的比例重悬，4°C搅拌溶解过夜。12000g离心20min,上清即为重组蛋白包涵体溶液。(3)目的蛋白的纯化采用镍离子亲和层析柱，柱床体积(CV)为I mL。去离子水流冲上样A、B管及亲和层析柱，至基线平稳；分别以缓冲液Al、缓冲液BI流冲上样A、B管道，然后以缓冲液Al平衡亲和层析柱至基线平稳。以超声上清上样，亲和层析缓冲液Al冲洗亲和层析柱，收集穿过峰；待穿过峰消失回复至基线，以亲和层析缓冲液BI梯度洗脱解离，收集洗脱峰，即为纯化后蛋白样品。(4)蛋白稀释复性将ImL纯化后的蛋白(含30%甘油)，缓慢滴入IOOmL复性液中(IOmM TrisCl, 0. 5MNaCl，pH8. 0 ；30 % 甘油；1 mM GSH ；0.1 mM GSSG ；0. 5 M Arg),4 °C孵育 48 h，4 °C, 12000g离心30 min,即为复性好的复性蛋白稀释液。结论构建含有pET-gE表达载体的BL21 (DE3)工程菌，获得纯化后的融合His标签的gE蛋白。四、密码子优化前后gE蛋白表达量的比较将gE基因序列密码子优化前和优化后分别构建的gE蛋白表达工程菌等比例接种培养基，培养IOh后，超声破菌，将全菌蛋白样品进行蛋白浓度测定。取全菌蛋白总量相等的样品进行Western印迹分析，结果得到优化后的目的gE蛋白条带比优化前的gE蛋白条带浓度大，结果见图1。从而表明本发明所优化的核苷酸具有突出的效果。五、多克隆血清的制备(I)动物选择新西兰大耳白兔两只。( 2 )接种途径皮下注射。(3)接种部位脊背，左右脚足垫，左右腹股沟。(4)佐剂使用弗氏完全佐剂(CFA)，弗氏不完全佐剂(IFA)为Sigma公司产品。(5)接种策略I)每只大耳白兔抗原免疫用量1. 0 mg。取2. 5 mg纯化后的gE蛋白加弗氏完全佐剂2. 5 mL，顺时针方向研磨直至形成“油包水”样乳剂。2)固定大耳白兔，75 %乙醇消毒，分别在脊背，左右脚足垫，左右腹股沟皮下注射乳化液，注射量2 mL/只。3)每隔一周加强免疫一次，其中第二、三次加弗氏不完全佐剂，第四次注射抗原溶液。4)第五周起于兔耳缘静脉取血，用琼脂糖双扩法检测特异性抗体的效价。
5)抗血清分离心脏放血，室温下待血清完全分离，离心后分装血清，_70°C冻存备用。双向免疫扩散结果显示，在抗gE蛋白抗血清稀释度为1:32时，出现明显沉淀线，兔抗gE蛋白多克隆抗体效价分别为1:32。结论gE蛋白可以使新西兰大耳白兔产生多克隆血清。Western印迹检测血清特异性选取BL21 (DE3)菌为阴性对照，同时以纯化后的gE_Hi s为阳性对照进行SDS-PAGE,电转移至NC膜上，制备的兔抗血清以1:5000稀释为一抗，1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG为二抗，检测兔抗gE-His血清的免疫反应性。结果表明纯化的gE-His蛋白可以与兔抗gE-His血清能够发生明显的免疫反应，而BL21(DE3)在相应分子量位置未见反应条带出现，表明具有良好免疫反应性。六、重组蛋白制备的鸭瘟病毒基因工程亚单位疫苗的动物试验
将制备的鸭瘟病毒基因工程亚单位疫苗经肌肉接种10日龄鸭瘟阴性鸭10只，另取10只作为对照。接种14日后取血测鸭瘟抗体，免疫组鸭瘟抗体全部为阳性，有效率达到100%，对照组未检测到抗体；结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好。用该重组蛋白进一步制备的鸭瘟病毒基因工程亚单位疫苗可以引起鸭的免疫应答，能够有效的预防鸭瘟。
权利要求
1.一种用于编码鸭瘟病毒gE蛋白的核苷酸，其序列为SEQ ID N0:1。
2.—种核苷酸,所述的核苷酸为权利要求1所述的核苷酸的互补序列。
3.权利要求1所述的鸭瘟病毒gE蛋白，其氨基酸序列为SEQID N0:2。
4.权利要求3所述的鸭瘟病毒gE蛋白在制备鸭瘟病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。
5.权利要求4所述的疫苗用来预防鸭瘟病。
全文摘要
本发明涉及一种鸭瘟病毒gE蛋白，经过密码子优化后的高表达的核苷酸序列为SEQ ID NO1。本发明获得的鸭瘟病毒gE蛋白基因工程亚单位疫苗经肌肉接种10日龄鸭瘟病毒阴性鸭，接种14日后取血测鸭瘟抗体，免疫组鸭瘟抗体全部为阳性，有效率达到100%，而对照组未检测到抗体。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的鸭瘟病毒基因工程亚单位疫苗可以引起鸭的免疫应答。
文档编号C12N15/11GK103060343SQ20121054991
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者魏波, 凌红丽, 徐丽丽, 王睿智 申请人:青岛康地恩药业股份有限公司, 青岛宝依特生物制药有限公司