利用家蚕卵黄原蛋白启动子性别和组织特异性表达外源基因及方法
【专利摘要】本发明提供利用家蚕卵黄原蛋白启动子在性别特异性和组织特异性地表达外源基因中的用途以及方法。该方法突破传统转基因家蚕不能有效的雌雄特异性和组织特异性的表达外源基因的局限性，首次开发和利用家蚕卵黄原蛋白启动子在家蚕细胞系和转基因家蚕中性别特异性和组织特异性地表达外源基因。从而首次利用转基因家蚕的性别表达可控制性和组织表达可控制性，扩展了家蚕的应用领域，保持蚕业的可持续发展，并可研究害虫的遗传控制。
【专利说明】利用家蚕卵黄原蛋白启动子性别和组织特异性表达外源基因及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】。具体地说，本发明涉及利用家蚕(Bombyx moriLinnaeus)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)启动子进行性别特异性和组织特异性地表达外源基因的方法和应用。
【背景技术】
[0002]家蚕是絹丝昆虫，同时也是鳞翅目昆虫中重要的经济昆虫和模式生物，为我国的经济发展做出了巨大贡献并且正在为中国的经济可持续发展进一步做着更大的贡献。随着我国家蚕基因组计划宣布家蚕基因组框架图的完成，标志着家蚕后基因组时代的到来，功能基因组学的主要工作包括:大量功能基因的克隆鉴定、重要生物学性状的分子调控机理，以及实现人为控制和调节这些基因和性状以满足人类的需求。因此，利用家蚕作为昆虫，特别是鳞翅目昆虫的遗传防治的研究对象，将在农林业害虫遗传防治方面产生重大的影响，而且还将在鳞翅目其他昆虫中推广应用。
[0003]然而，现阶段的家蚕转基因中，使用最多的启动子大都是外源性启动子，例如来自家蚕NPV病毒的IE1。而本领域技术人员知道，目前利用的外源性启动子有各种各样的缺陷，例如，目前所用的外源性启动子不具备时间和空间特异性，如性别或组织的特异性，进而无法对昆虫进行特异性地调控，或者给外源性基因产物的检测或纯化带来种种困难。此外，本领域技术人员知道，内源性启动子对成功建立转基因体系至关重要。然而，目前在家香中尚未有相关启动子的报道。
[0004]因此，本领域急需获得家蚕体内的性别特异性和组织特异性的启动子。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种能够性别特异性和组织特异性地驱动外源基因表达的启动子及其用途和使用方法。
[0006]在第一方面，本发明提供一种分离的卵黄原蛋白启动子，所述的卵黄原蛋白启动子为选自下组的序列:
[0007](a)如SEQ ID N0.:1所示的核苷酸序列；
[0008](b)与SEQ ID N0.:1所示序列的同源性≥95% (较佳地≥98%)，且基本具有SEQIDN0.:1所示多核苷酸功能的核苷酸序列；或
[0009](c)在SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短一个或多个，较佳地1-30，更佳地1-6个核苷酸，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸。
[0010]在优选的实施方式中，所述卵黄原蛋白启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所
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[0011]在第二方面，本发明提供一种构建物，所述构建物含有外源基因以及本发明第一方面所述的卵黄原蛋白启动子。[0012]在优选的实施方式中，所述构建物具有在雌性鳞翅目昆虫的脂肪体中性别特异性和组织特异性地表达外源基因的功能。
[0013]在进一步的优选实施方式中，所述鳞翅目昆虫是家蚕。
[0014]在第三方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件:本发明第一方面所述的卵黄原蛋白启动子、外源基因ORF序列和终止子。
[0015]在优选的实施方式中，所述的表达盒还包括选自下组的一种或多种元件:poly(A)元件、增强子、转运元件或基因靶向元件。
[0016]在另一优选的实施方式中，所述表达盒具有在雌性鳞翅目昆虫的脂肪体中性别特异性和组织特异性地表达外源基因的功能。[0017]在进一步的优选实施方式中，所述鳞翅目昆虫是家蚕。
[0018]在第四方面，本发明提供一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的卵黄原蛋白启动子、或本发明第三方面所述的表达盒。
[0019]在优选的实施方式中，所述载体具有在雌性鳞翅目昆虫的脂肪体中性别特异性和组织特异性地表达外源基因的功能。
[0020]在进一步的优选实施方式中，所述鳞翅目昆虫是家蚕。
[0021]在第五方面，本发明提供一种昆虫细胞，所述昆虫细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述的卵黄原蛋白启动子、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达盒。
[0022]在优选的实施方式中，所述昆虫细胞具有在雌性鳞翅目昆虫的脂肪体中性别特异性和组织特异性表达外源基因的功能。
[0023]在优选的实施方式中，所述宿主细胞的染色体具有一个或多个(如1-50个，较佳地2-6个)拷贝的本发明第一方面所述启动子、或本发明第三方面所述的表达盒。
[0024]在另一优选实施方式中，所述的昆虫细胞是鳞翅目昆虫，优选家蚕。
[0025]在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的启动子，第二方面所述的构建物，第三方面所述的表达盒或第四方面所述的载体的用途，所述启动子、构建物、表达盒或载体在雌性鳞翅目昆虫中性别特异性地表达外源基因。
[0026]在优选的实施方式中，所述启动子在雌性鳞翅目昆虫的脂肪体中性别特异性和组织特异性地表达外源基因。
[0027]在另一优选实施方式中，所述的鳞翅目昆虫是家蚕。
[0028]在第七方面，本发明提供一种在雌性鳞翅目昆虫中性别特异性地表达外源基因的方法，所述方法包括以下步骤:
[0029](a)提供本发明第二方面所述的构建物；
[0030](b)将步骤(a)中的构建物导入雌性鳞翅目昆虫细胞或雌性鳞翅目昆虫卵，获得转化的雌性昆虫细胞或昆虫卵；
[0031](C)培养步骤(b)中转化的鳞翅目昆虫细胞或将所述昆虫卵再生成昆虫，从而使外源基因在雌性鳞翅目昆虫细胞或雌性鳞翅目昆虫中特异性表达。
[0032]在优选的实施方式中，所述外源基因在雌性鳞翅目昆虫的脂肪体中特异性表达。
[0033]在优选的实施方式中，所述鳞翅目昆虫是家蚕。
[0034]在第八方面，本发明提供一种制备雌性转基因昆虫的方法，包括步骤:[0035](a)提供昆虫卵，所述昆虫卵含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述的启动子、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达盒；
[0036](b)将所述的转基因昆虫卵再生为昆虫，从而获得雌性转基因昆虫。
[0037]在优选的实施方式中，所述昆虫是鳞翅目昆虫，优选家蚕。
[0038]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1显示了家蚕卵黄原蛋白启动子克隆及转基因质粒的构建。A:合成的启动子PUC-57-Vgp质粒酶切(EcoRI和Sail)图谱，白色箭头所指处为Vgp ；B:用pXL-BacI1-Blank质粒构建目的转基因质粒，在多克隆酶切位点插入待检验启动子和报告基因EGFP ；C:构建的三种转基因质粒，分别为含有启动子和报告基因、只含启动子或只含有报告基因的三种质粒，图示为关键元件在质粒上的位置；
[0040]图2显示了家蚕卵黄原蛋白基因启动子在BmN细胞中的表达。A:为空白对照，即，不加入任何质粒=PXLBacI1-1ElDsRed2-Vgp在BmN细胞中的转染结果；C:PXLBacI1-1ElDsRed2-EGFP 在 BmN 细胞中的转染结果；D =PXLBacI1-1ElDsRed2-VgpEGFP 在BmN细胞中的转染结果。“红”表示在红色荧光下观察结果，“绿”代表在绿色荧光下观察的结果; [0041]图3显示了 PXLBacI1-1ElDsRed2-Vgp-EGFP质粒在家蚕蛹期的表达。分别在白光、绿色荧光、红色荧光下观察雌雄的荧光表达。
【具体实施方式】
[0042]发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现家蚕卵黄原蛋白基因启动子能够性别特异性和组织特异性地表达，从而能够性别特异性和组织特异性地表达外源基因，进而扩展了家蚕的应用领域以及可以研究昆虫，特别是鳞翅目昆虫的遗传控制。在此基础上完成了本发明。
[0043]鳞翅目
[0044]鳞翅目包括蛾、蝶两类昆虫。属于有翅亚纲、全变态类。全世界已知约20万种，中国已知约8000余种。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目。包括麦蛾科；粉蝶科，如麦蛾、棉红铃虫、马铃薯块茎蛾和甘薯麦蛾等；卷蛾科，如棉褐带卷蛾、大豆食心虫等；螟蛾科，如梨大食心虫、玉米螟等；尺蛾科，如大造桥虫等；粉蝶科，如菜粉蝶等；夜蛾科，如粉蚊夜蛾、棉铃虫等；毒蛾科，如舞毒蛾等；凤蝶科，如玉带风蝶、金风蝶等；舟蛾科，如舟形毛虫等；灯蛾科，如黄腹灯蛾、红腹灯蛾、美国白蛾等；天蛾科，如葡萄天蛾等；蚕蛾科，如家蚕等；天蚕蛾科，如樗蚕等；弄蝶科，如稻苞虫等。
[0045]鳞翅目昆虫的分布范围极广，以热带种类最为丰富。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形较大者常食尽叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。成虫多以花蜜等作为补充营养，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。[0046]综上所述，鳞翅目昆虫周大多数是害虫，也有少数，例如家蚕是有经济价值的昆虫。因此，对鳞翅目昆虫的性别特异性和组织特异性启动子进行研究，对于害虫的防治以及有经济价值的转基因产物将产生极大的现实意义。
[0047]因此，在优选的实施方式中，本发明的鳞翅目昆虫是家蚕。
[0048]目前昆虫转基因技术常用转座子的方式进行。piggyBac转座子是一种来源于鳞翅目昆虫的转座子，最初是通过杆状病毒(Baculovirus)侵染粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368 细胞株系，从 Galleria mellonella(GmMNPV)和 Autographa californica(AcMNPV)核多角体病毒内首次分离得到的，在粉红色螟蛉虫(Pectinophora gassypiella)胚胎、家蚕(Bombyx mori)卵细胞的切除测试等都证明了 piggyBac转座子切除的准确性。在黄色伤寒蚊(Aedes aegypti)、粉蚊夜蛾和家蚕卵细胞内等的实验也显示了 piggyBac能够进行顺利转座，而且切除和转座的频率都较高。在家蚕中的研究始于1997年，发现piggyBac转座子对家蚕的转座作用，研究人员随后利用piggyBac转座子对家蚕进行了研究。piggyBac转座子的深入研究将为害虫的遗传防治奠定理论基础。
[0049]启动子
[0050]本文所用的术语“启动子”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，其引导基因核酸序列转录为mRNA，通常存在于目的基因编码序列的上游(5，端)。启动子或启动子区域一般提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。
[0051]本文所用的术语“本发明启动子”、“卵黄原蛋白启动子”、“Vg启动子”、“Vgp启动子”、“Vgp”或“性别特异性和组织特异性的启动子”或“雌性特异性或脂肪体特异性的启动子”具有相同的含义，在本文中可互换使用；具体地说，本发明的启动子表示来源于鳞翅目昆虫，优选家蚕的，具有SEQ ID N0.:1所示核苷酸序列或其活性片段的启动子:CAAGCTTGGCGCGCCCCCGATCCATTAACAGTGCTTTTAGGTACCACAAGCACCGGTCACCGTTGTCGTCGAACCCGTCGCTTGCGACGAAGGGCTCGACGAGCGAATTAACCCATAGACACAGCCCACTGAGTTTCTTGCCGGATCTTCTAGGTGGGTCGCGTTTCCGATCCGGTGGTAGATTCTGCGAAGCACTGCCCTTGCTAGGGCCAGTGTTAGCAACACTCCGGTTTGAACGCCGTGAGCTAACCTACACGTTAGGGCGAAGCTGAAATAGCCTCTCAAGGCTATCAGCATAGGTAGGAAAAAAAAAGCAATTTTGTCCATATTCCTATAATTCGAAATTCCAGATATTTTTTTTATTGCCTTTGTAGGCAGACGGGCATACGGCCCACCTGATGGTGAGTGGTTACCGTCGCCCATGGACTTCAGCAATGCCAGGGGCAGAGCCAAGCCGCTGCCTACCGCTTAACACTCTCCACAAGCCTCGTTTGAAGAAGGACATGTCATAGCGCTCGGTAAACACCGTGGAGGGGAGCTCATTCCATAGCCGGATGGTACGCGATCTTTCGCGTTCTAATTTTTATTTTATTAAAAGCGAATATTCGCGCTTGATTTAACTCCTCGCCCCAGTTCCCTCAAATTTCAGTCTCCACAAAGACAAAGGAATAAGAAAATGATTCGTTACATTGTATTTTATCTGTGTTTACTATCTAGGGTCACAGTTCTGGGACGCGTGTACCCTCCCTATATAAAGGGGGTGACCTGGCCAGAGATGTTCAGATCCGCTAGCATATG(SEQ IDNO:1)。
[0052]鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员不难理解，尽管本发明的实例中提供了来源于家蚕的Vg启动子，但是来源于鳞翅目的其它昆虫，尤其是与家蚕属于同一科或属的，例如亚洲玉米螟，棉铃虫，与本发明启动子具有一定同源性(保守性)的启动子，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它昆虫中分离得到该启动子并验证其功能。 [0053]因此，本发明包括与本发明的优选启动子序列(SEQ ID N0.:1)具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸也具有性别特异性和组织特异性表达外源性基因的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一I"生)。
[0054]同样，本领域技术人员还应理解，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
[0055]因此，在具体的实施方式中，本发明还包括在SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短一个或多个，较佳地1-30，更佳地1-6个核苷酸，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸。
[0056]卵黄原蛋白
[0057]在大多数昆虫中，卵黄原蛋白(Vg)在天然状态下是一种寡聚糖磷脂蛋白，分子量为200-700kD，等电点为6.1-6.3。昆虫Vg是由6_7kb的mRNA编码的分子量约为200kD的前体蛋白，经修饰后成为由几个亚基组成。它的单体可由1-4个亚基构成，包括一个分子量大于180kD的大亚基和分子量小于50kD的小亚基。在家蚕中，Vg前体被酶切为一个大分子量的亚基(>180kD)和一个小分子量的亚基(<50kD)，通常情况下昆虫Vg含有几个比较保守的结构域或氨基酸基序，如多聚丝氨酸区(polyserine domains)、GL/ICG、RXXR、DGXR和C-端半胱氨酸等。昆虫Vg序列中的多聚丝氨酸区域多位于N-末端，也有少数位于C-端，其位置相对保守。多聚丝氨酸区域的个数在昆虫中也是不相同的。鳞翅目昆虫中的凤蝶总科和夜蛾总科，卵黄发生在成虫羽化前就已经开始，JH对其Vg的合成和卵子成熟是必需的。从体外培养的美洲粘虫的咽侧体中释放出的JH与脂肪体Vg合成的速率呈正相关；在去头的雌虫中，Vg合成受到抑制，而用JH处理时，又能恢复Vg的合成。在家蚕的蛹期，咽侧体摘除不能抑制4龄幼虫脂肪体中Vg的合成和卵成熟，而用蜕皮激素处理时，血淋巴中Vg和卵巢内Vt的含量 显著增加，并随着剂量的增加而增加。在吐丝期老龄幼虫的腹部和胸部处结扎，能够阻止前胸合成与分泌20E，且能抑制Vg的合成；向其腹腔注射少量的20E，则能诱导Vg的合成与成熟，蜕皮激素对于家蚕卵黄发生和Vg的合成是必须的。
[0058]因此，研究家香的Vg启动子不仅能揭不家香卵黄原蛋白的表达和调控机理，而且将为研究鳞翅目昆虫的利用和防治提供有效的基因工程元件。
[0059]性别特异性和组织特异性
[0060]本文所用的术语“性别特异性”表示本发明的启动子特异性地在某种性别中驱动基因，优选外源基因的表达。在具体的实施方式中，本发明的启动子在雌性鳞翅目昆虫中驱动基因，优选外源基因的表达。在优选的实施方式中，本发明的启动子在家蚕中驱动基因，优选外源基因的表达。
[0061 ] 类似地，本文所用的术语“组织特异性”表示本发明的启动子特异性地在某种组织中驱动基因，优选外源基因的表达。在具体的实施方式中，本发明的启动子在雌性鳞翅目昆虫的脂肪体中驱动基因，优选外源基因的表达。在优选的实施方式中，本发明的启动子在家蚕的脂肪体中驱动基因，优选外源基因的表达。
[0062]本发明启动子的功能和用途
[0063]本发明提供的启动子能够高效、专一地在雌性鳞翅目昆虫，优选家蚕的脂肪体中表达。因此，本发明的启动子可以用于鳞翅目昆虫，优选家蚕中性别特异性和组织特异性地表达转基因以及害虫的遗传控制。[0064]在具体的实施方式中，本发明的启动子在雌性鳞翅目昆虫的脂肪体中性别特异性和组织特异性地表达外源基因，所述启动子选自下组:
[0065](a)核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示的多核苷酸；
[0066](b)核苷酸序列与SEQ ID N0.:1所示序列的同源性≥95% (较佳地≥98%)，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸；或
[0067](c)在SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短一个或多个，较佳地1-30，更佳地1-6个核苷酸，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸。
[0068]在优选的实施方式中，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示。
[0069]在进一步的优选实施方式中，所述鳞翅目昆虫是家蚕(Bombyx mori Linnaeus)。
[0070]性别特异性和组织特异性地表达外源基因的方法
[0071]本发明提供在雌性鳞翅目昆虫中性别特异性和组织特异性地表达外源基因的方法，所述方法包括以下步骤:
[0072](a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及本发明启动子；
[0073](b)将步骤(a)中的构建物导入雌性鳞翅目昆虫细胞或雌性鳞翅目昆虫卵，获得转化的雌性昆虫细胞或昆虫卵；
[0074](C)培养步骤(b)中转化的鳞翅目昆虫细胞或将所述昆虫卵再生成昆虫，从而使外源基因在雌性鳞翅目细胞或雌性鳞翅目昆虫的脂肪体中特异性表达。
[0075]在一优选例中，所述鳞翅目昆虫是家蚕。
[0076]本发明还提供一种构建物，所述构建物含有外源基因以及本发明的启动子。
[0077]在优选的实施方式中，所述构建物具有在雌性鳞翅目昆虫，优选家蚕的脂肪体中性别特异性和组织特异性地表达外源基因的功能。
[0078]本发明还提供一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件:本发明的启动子、外源基因ORF序列和终止子。
[0079]在优选的实施方式中，所述的表达盒还包括选自下组的一种或多种元件:poly(A)元件、增强子、转运元件或基因靶向元件。
[0080]在优选的实施方式中，所述表达盒具有在雌性鳞翅目昆虫，优选家蚕的脂肪体中性别特异性和组织特异性地表达外源基因的功能。
[0081 ] 本发明提供一种载体，所述载体含有本发明的启动子、或本发明的表达盒。
[0082]在优选的实施方式中，所述载体具有在雌性鳞翅目昆虫，优选家蚕的脂肪体中性别特异性和组织特异性地表达外源基因的功能。
[0083]本发明的启动子、构建物、表达盒或载体可用于在雌性鳞翅目昆虫，优选家蚕中性别特异性地表达外源基因；优选地，在雌性鳞翅目昆虫，优选家蚕的脂肪体中性别特异性和组织特异性地表达外源基因。
[0084]本发明还提供一种昆虫细胞，所述昆虫细胞含有本发明的载体、或其染色体整合有外源性的本发明启动子、或其染色体整合有本发明的表达盒。
[0085]在优选的实施方式中，所述昆虫细胞(优选鳞翅目昆虫，更优选家蚕)具有在脂肪体中组织特异性表达外源基因的功能。
[0086]在优选的实施方式中，所述宿主细胞的染色体具有一个或多个(如1-50个，较佳地2-6个)拷贝的本发明启动子元件、或本发明的表达盒。[0087]本发明还提供一种制备雌性转基因昆虫的方法，包括步骤:
[0088](a)提供昆虫卵，所述昆虫卵含有本发明的载体、或其染色体整合有本发明的启动子、或其染色体整合有本发明的表达盒；
[0089](b)将所述的转基因昆虫卵再生为昆虫，从而获得雌性转基因昆虫。
[0090]在一优选例中，所述昆虫是鳞翅目昆虫，优选家蚕。
[0091]本发明的优点:
[0092]1.本发明首次发现家蚕卵黄原蛋白启动子能够性别特异性和组织特异性地表达外源基因；
[0093]2.本发明利用家蚕卵黄原蛋白启动子，通过转基因家蚕在雌性个体表达外源基因，突破传统转基因家蚕不能性别特异性和组织特异性的表达外源基因的局限性，成功实现了性别特异性和组织特异性表达；
[0094]3.本发明首次利用转基因家蚕的性别表达可控制性和组织表达可控制性，扩展了家蚕的应用领域，保持蚕业的可持续发展，进而可以研究害虫的遗传控制。
[0095]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0096]实施例1.载体的构建
[0097]本发明利用的PXL-BaCI1-1El-DSRed2注射转座子载体是piggyBac衍生来的(参见 Elick 等，Genetica, 1996 ；W0 2006122442)，在 Piggybac 转座子载体中导入了由启动子(Kojima等，Virus Research, 2008)驱动的红色突光蛋白DsRed (NCBI登录号:AJ851284 ；SEQ ID NO: 2)，构建 PXL-BacI1-1El-DsRed2 转基因载体。家蚕 Vgp 启动子序列来自Vg蛋白上游800bp序列，通过分段全基因合成法获得，并克隆在载体PUC-57 (SangonBiotech)上。用含有 KpnI 和 ApaI 的特异性引物 VgF (CGGGGTACCCCGCCCGATCCATTAACAGTGCT，SEQ ID NO:3)和 VgR(AAGGGCCCTTGGATCTGAACATCTCTGGCC，SEQ ID NO:4)用高保真酶KOD(Genview)从载体质粒roC-57-vgp进行PCR扩增，克隆到pMD-18T (TaKaRa)上，构建成质粒pMD-18T-Vgp，测序正确后用KpnI和ApaI (NEB)分别酶切pMD-18T_Vgp和PXL-BacI1-1El-DsRed2,然后将vgp片段插入到载体质粒PXL-BacI1-1El-DsRed2上，构建成质粒 PXL-BacI1-1El-DsRed2-Vgp。同时用含有 ApaI 的特异性引物 EGF(ATGTTCAGATCCAAGGGCCGCCACCATGGTGAGCAAGG, SEQ ID NO:5)和 EGR (TCGACCTCGAGGGGTTCGTACGCGTATCGATAAGCTTTAA, SEQID NO:6)用 KOD 酶扩增 EGFP(NCBI 登录号:HQ416901 ；SEQ ID NO:7),胶收后连接到PMD-18T载体上测序，构建成质粒PMD-18T-EGFP，获得正确的序列后，用ApaI酶切PXL-BaCI1-1El-DSRed2和pMD_18T_EGFP，胶收目的片段后连接，获得目的质粒PXL-BacI1-1El-DsRed2-EGFP,用 ApaI 酶切 PXL-BacI1-1El-DsRed2_Vgp 和 pMD_18T_EGFP，胶收目的片段后连接，获得目的质粒PXL-BaCI1-1El-DSRed2-Vgp-EGFP，经测序正确备用。
[0098]实施例2.BmN细胞水平的检测
[0099]将构建好的三种质粒分别转入家蚕卵巢细胞(BmN细胞，参见EP0225777)中，如果该Vgp启动子有活性并且如预测的那样具有组织特异性和性别特异性，即，只在某种性别的特定器官中表达，那么实验中将会观察到有绿色荧光。实验用的细胞转染方法参照Qiagen公司生产的Effectene Transfection Reagent kit试剂盒,方法简要如下:取24孔板,选择12孔，每孔加入300ul的BmN细胞，隔夜培养。将转染质粒PXL-BacI1-1El-DsRed2-EGFP、PXL-BacI1-1El-DsRed2-VgpEGFP, PXL-BacI1-1El-DsRed2-Vgp 纯化准备好，稀释浓度到200ng/ul。在超净台进行如下操作:分别取70ul的EC加入1.5ml的EP管；再取7.5ul的质粒加入，混匀;加入12ul的Enhance,混匀，静置4min ;加入15ul的Effectance,混匀，静置lOmin，期间将24孔板中的培养液吸去；然后加900ul的小牛血清培育基到EP管中，混合后，分别加到3个孔中，密封；28°C培养箱培养。72小时后,在突光聚焦显微镜下观察转染结果。
[0100]三种质粒的转染结果如图2所示。从结果可以得出结论:该启动子可以在家蚕的卵巢细胞中表达。参见图2.C，Vgp启动子驱动报告基因表达(即质粒PXLBacI1-1ElDsRed2-VgpEGFP)，而在对照A中没有观察到任何的荧光和实验组B、C没有检测到绿色荧光。同时从实验结果可以知道该启动子在BmN细胞中驱动报告基因EGFP表达时间较晚，这是因为在家蚕体内卵巢表达卵黄原蛋白水平远远低于脂肪体表达量。
[0101]本实施例证明本发明的启动子可以在雌性环境中驱动报告基因表达。
[0102]实施例3.转基因家蚕的获得以及检测启动子的特异性表达
[0103]本实施例中，将只含有报告基因、含有启动子和报告基因以及只含启动子的三种质粒，即，PXL-BacI1-1El-DsRed2-EGFP 、 PXL-BacI1-1El-DsRed2_Vgp-EGFP、PXL-BacI1-1El-DsRed2_Vgp 分别与 PHA3PIG (Tamura 等., Nature Biotechnology, 2000,还可参见EP1482035 ;用作辅助质粒产生转座酶)等量混合后注射到家蚕初产卵(产下后4_8小时)中，注射质粒DNA的纯化试剂盒用Qiagen公司的Plasmid Midi kit试剂盒纯化,注射方法参照Kanda&Tamura(1991)描述的方法进行家蚕显微注射。注射后的蚕卵用无毒胶封口以防止污染。在25°C条件 下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(GO)的蚕蛾自交，获得Gl代蚕卵，在荧光显微镜下挑出转基因个体饲养，待其生长到蛹期检测启动子的表达。
[0104]发明人通过以下方法检测启动子的特异性表达:
[0105]为验证该启动子是否具有性别特异性和组织特异性，可检测外源基因表达是否具有性别特异性和组织特异性。获得转基因材料可通过观察红色荧光，进而挑选出有红色荧光蛋白表达的蚕卵即可。观察转染三种质粒的细胞在绿色荧光和红色荧光下的表达状况，确定其在雌性细胞中的表达以及快速确定该质粒和启动子功能是否正常。通过蛹期区分不同性别，在绿色荧光下检测外源基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达可以确定其是否具有性别特异性表达，以及通过解剖来确定表达部位。若是其他基因可通过相应的分子生物学手段检测。
[0106]从图3可知，携带有启动子Vgp和报告基因EGFP的质粒已经成功转入到家蚕基因组中并且可以稳定表达(IEl-DsRed2为参照系统)，并且只在雌性蛹期观察到了绿色荧光的强表达。由图3还可以明显看出，雌性蚕蛹有明显的荧光产生，而雄性蚕蛹没有荧光。经过对蚕蛹进行解剖，发明人发现荧光出现在脂肪体中。
[0107]因此，本实施例证明本发明的启动子能在雌性家蚕的脂肪体中性别特异性和组织特异性地驱动报告基因的表达。
[0108]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种分离的卵黄原蛋白启动子，其特征在于，所述的卵黄原蛋白启动子为选自下组的序列: (a)如SEQID N0.:1所示的核苷酸序列； (b)与SEQID N0.:1所示序列的同源性≤95%(较佳地≤98%)，且基本具有SEQIDN0.:1所示多核苷酸功能的核苷酸序列；或 (c)在SEQID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短一个或多个，较佳地1-30，更佳地1-6个核苷酸，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸。
2.—种构建物，其特征在于，所述构建物含有外源基因以及权利要求1所述的卵黄原蛋白启动子。
3.—种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件:权利要求1所述的卵黄原蛋白启动子、外源基因ORF序列和终止子。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的卵黄原蛋白启动子、或权利要求3所述的表达盒。
5.一种昆虫细胞，其特征在于，所述昆虫细胞含有权利要求4所述的载体、或其染色体整合有权利要求1所述的卵黄原蛋白启动子、或其染色体整合有权利要求3所述的表达盒。
6.如权利要求1所述的卵黄原蛋白启动子，权利要求2所述的构建物，权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的载体的用途，其特征在于，所述卵黄原蛋白启动子，构建物，表达盒或载体在雌性鳞翅目昆虫中性别特异性地表达外源蛋白。
7.—种在雌性鳞翅目昆虫中性别特异性地表达外源基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (a)提供权利要求2所述的构建物； (b)将步骤(a)中的构建物导入雌性鳞翅目昆虫细胞或雌性鳞翅目昆虫卵，获得转化的雌性昆虫细胞或昆虫卵； (C)培养步骤(b)中转化的鳞翅目昆虫细胞或将所述昆虫卵再生成昆虫，从而使外源基因在雌性鳞翅目昆虫细胞或雌性鳞翅目昆虫中特异性表达。
8.一种制备雌性转基因昆虫的方法，包括步骤: (a)提供昆虫卵,所述昆虫卵含有权利要求4所述的载体、或其染色体整合有权利要求1所述的卵黄原蛋白启动子、或其染色体整合有权利要求3所述的表达盒； (b)将所述的转基因昆虫卵再生为昆虫，从而获得雌性转基因昆虫。
【文档编号】C12N15/85GK103865927SQ201210553180
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】谭安江, 许军, 尤朗, 黄勇平 申请人:中国科学院上海生命科学研究院