专利名称：利用天然微纳米级凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用天然微纳米凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法。
背景技术：
伴随着DNA重组技术和淋巴细胞杂交瘤技术的发明而诞生的生物制药高新技术在过去的近40年里得到了快速发展，近25年来，世界生物技术工业就创造了 35种重要的治疗性生物技术药物，极大地改善和提高了人们的健康生活水平，因此，世界各国都把生物制药确定为21世纪科技发展的关键技术和新兴产业。尽管如此，相比于化学药，普通百姓通常是难以承受生物药其昂贵费用。利用大规模哺乳动物细胞培养生产具有医用价值的生产因子、干扰素、激素、疫苗、单抗和酶等，已成为生物制药高技术产业链的核心。但在哺乳动物细胞培养过程中，如CO2、乳酸、氨、尿素、吲哚等代谢废物的积聚会抑制哺乳动物细胞的生长，阻碍细胞密度提高，进而大幅提升哺乳动物细胞的培养成本和生物药成本。因此，优化哺乳动物细胞培养微环境、提高哺乳动物细胞产率、降低哺乳动物细胞的培养成本是目前生物制药产业技术重要研究方向之一。素有“千用之土，万土之王”的凹凸棒石粘土是一种稀有非金属矿石，理想的化学式是Al (OH2)4 (OH)2Mg5Si8. 4H20，其基本构造单元式由两层硅氧四面体和一层铝氧八面体组成。这种独特的纳米通道结构使得凹凸棒土具有超大的比表面积(146 210m2/g)，使其具有了良好的吸附性，已在机械、化工、建材、石油、催化载体和抗菌剂载体等方面得到广泛应用。近几年来，纳米级凹凸棒土在生物领域的应用研究得以开展2007年，Jin等人通过血红蛋白直接沉积到NNATP黏土膜修饰的玻璃碳电极，并通过UV-vis、FTIR和电化学手段研究ATP和血红蛋白之间 的相互作用，从而发现固定化的血红蛋白在凹凸棒土表面保持其原始构象，表现出极佳的电化学催化活性，对过氧化氢表现出很高的亲和性和敏感性，其电催化反应在一定范围内与过氧化氢浓度线性相关。该研究表明ATP能够作为一个良好的蛋白固定化基质，用于制作不需要介导体的第三代生物传感器；2009年，Wang等人通过Ca2+离子交联海藻酸钠制作了壳多糖-g_聚丙烯酸/ATP/海藻酸钠(CTS-g-PAA/APT/SA)复合材料的水凝胶微球。该微球作为药物呈递的基质具有PH敏感性，其对双氯芬酸钠(DS)的累计释放率在PH6. 8时要慢于pH7. 4时，且随着ATP含量的增加而减少，故ATP引入CTS-g-PAA网络能够延长DS的释放时间，这表明将黏土引入聚合物网络能够简单而有效的制备新的药物呈递系统；2011年，Ma等人通过将修饰后ATP加入聚氨酯制得生物大分子载体，并使用FTIR、SEM等方法对其进行表征分析，发现有机修饰的ATP的加入能够提升载体的结构和物理化学性质，并促进微生物的固定化。凹凸棒土具有较强的吸附性能，具有优化哺乳动物细胞培养微环境、提高细胞产率中的潜力。本发明目的是提供天然微纳米凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法，拓宽微纳米级凹凸棒土的应用领域，实现高技术含量凹凸棒土在生物产业中应用，提高其附加值。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用天然微纳米凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法。利用天然微纳米级凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法，包括以下步骤(I)取粒径小于1000目的纯度大于99%的天然微纳米凹凸棒土与去离子水混合，高压灭菌后配制成浓度为O. 001mg/mL lmg/mL的凹凸棒土溶液；(2)当哺乳动物细胞处在对数生长期时，取上述凹凸棒土溶液与细胞密度为IO3 IO5个/mL的细胞悬浮液按1:1到1:10的体积比共培养；(3)对于大规模哺乳动物细胞培养时，让细胞反应釜中的细胞培养液循环流填充天然微纳米级凹凸棒土的管道，管道中填充的天然微纳米凹凸棒土与流过的细胞培养液的体积比为I 10_3。步骤(I)中配制的凹凸棒土溶液的浓度为O. Olmg/mL lmg/mL。步骤(2)中所述共培养的方法为接触式或非接触式共培养方法。所述接触式共培养方法为凹凸棒土溶液与细胞悬浮液混合后共同接种于培养皿中。所述非接触式共培养方法为凹凸棒土溶液与细胞悬浮液分别置于具有连通性的分离式培养皿中。
步骤(3)中所述管道中填充的天然微纳米凹凸棒土与流过的细胞培养液的体积比为 KT1 1(Γ3。本发明方法的有益效果为采用天然凹凸棒土与哺乳动物细胞接触式或非接触式共培养方式，会降低细胞培养液中的铵离子和乳酸浓度，优化哺乳动物细胞培养微环境，提高哺乳动物细胞产率，降低培养成本。本发明具有方法简单、成本低廉、细胞产率高、在生物制药产业具有较大的应用价值和市场前景。
图1为与天然微纳米凹凸棒土共培养的293细胞活性图。图2为凹凸棒土透射电镜图以及共培养的VERO细胞图。图3为添加天然微纳米凹凸棒土与共培养的VERO细胞活性图。图4为添加凹凸棒土前后细胞培养液中铵离子、乳酸浓度图
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1取粒径小于1000目的纯度大于99%天然微纳米凹凸棒土与去离子水混合，高压灭菌后分别配制浓度为O. 005mg/mL、0. lmg/mL的天然微纳米级凹凸棒土溶液，当293细胞处在对数生长期时，按体积比为1:10的比例，分别将浓度为O. 005mg/mL、0. lmg/mL的天然微纳米级凹凸棒土溶液与细胞密度为IO3个/mL的细胞悬浮液进行接触式共培养，用于提高293细胞的产率，并设置空白对照。其结果见图1所示，与对照相比，添加浓度为O. 005mg/mL、0. lmg/mL的天然微纳米级凹凸棒土溶液的293细胞活性增强。实施例2取粒径小于1000目的纯度大于99%天然微纳米凹凸棒土与去离子水混合，高压灭菌后分别配制浓度为O. 25mg/mL的天然微纳米级凹凸棒土溶液，当293细胞处在对数生长期时，按体积比为1:1的比例，将天然微纳米级凹凸棒土溶液和细胞密度为IO3个/mL的293细胞悬浮液进行接触式共培养，用于提高293细胞的产率。结论与实施例1相同，天然微纳米级凹凸棒土会增强293细胞活性。实施例3取粒径小于1000目的纯度大于99%天然微纳米凹凸棒土与去离子水混合，高压灭菌后配制浓度为O. Olmg/mL的天然微纳米级凹凸棒土溶液，按体积比为1:1和细胞密度为IO3个/mL的VERO细胞进行接触式共培养，提高VERO细胞的产率，并设置空白对照。天然微纳米凹凸棒土透射电镜(TEM)图以及共培养的VERO细胞图如图1所示，培养结果如图3，从图中可以看出天然微纳米凹凸棒土提高VERO细胞活性，并且会降低细胞培养液中的铵离子和乳酸浓度，优化细胞培养微环境，如图4所示。实施例4取粒径小于1000目的纯度大于99%天然微纳米凹凸棒土与去离子水混合，高压灭菌后配制浓度为O. Olmg/mL的天然微纳米级凹凸棒土溶液，按体积比为1:1和细胞密度为IO3个/mL的SP20细胞进行接触式共培养，提高SP20细胞的产率，并设置空白对照。结论天然微纳米凹凸棒土提高SP20细胞活性，并且会降低细胞培养液中的铵离子和乳酸浓度。实施例5 取粒径小于1000目的纯度大于99%天然微纳米凹凸棒土与去离子水混合，高压灭菌后配制浓度为lmg/mL的天然微纳米级凹凸棒土溶液，按体积比为1:10和细胞密度为IO3个/mL的VERO细胞采取接触式共培养方式，用来提高VERO细胞的产率。实施例6对于大规模培养的CHO细胞，取粒径小于1000目的纯度大于99%天然微纳米凹凸棒土，选取细胞密度为IO5个/mL CHO细胞培养液循环流过填充天然微纳米级凹凸棒土的管道，管道中填充的天然微纳米凹凸棒土与流过的细胞培养液的体积比为O. 1，并设置空白对照组。结论与上述实施例中的结论相同，天然微纳米凹凸棒土提高CHO细胞的产率。实施例7对于大规模培养的CHO细胞，取粒径小于1000目的纯度大于99%天然微纳米凹凸棒土，选取细胞密度为IO5个/mL CHO细胞培养液循环流过填充天然微纳米级凹凸棒土的管道，管道中填充的天然微纳米凹凸棒土与流过的细胞培养液的体积比为O. 01，并设置空白对照组。结论与上述实施例中的结论相同，天然微纳米凹凸棒土提高CHO细胞的产率。
权利要求
1.利用天然微纳米级凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取粒径小于1000目的纯度大于99%的天然微纳米凹凸棒土与去离子水混合，高压灭菌后配制成浓度为0. OOlmg/mL lmg/mL的凹凸棒土溶液； (2)当哺乳动物细胞处在对数生长期时，取上述凹凸棒土溶液与细胞密度为IO3 IO5个/mL的细胞悬浮液按1:1到1:10的体积比共培养； (3)对于大規模哺乳动物细胞培养时，让细胞反应釜中的细胞培养液循环流填充天然微纳米级凹凸棒土的管道，管道中填充的天然微纳米凹凸棒土与流过的细胞培养液的体积比为1(T3 I。
2.根据权利要求1所述的利用天然微纳米级凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法，其特征在于，步骤(I)中配制的凹凸棒土溶液的浓度为0. Olmg/mL lmg/mL。
3.根据权利要求1所述的利用天然微纳米级凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法，其特征在于，步骤(2)中所述共培养的方法为接触式或非接触式共培养方法。
4.根据权利要求3所述的利用天然微纳米级凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法，其特征在于，所述接触式共培养方法为凹凸棒土溶液与细胞悬浮液混合后共同接种于培养皿中。
5.根据权利要求3所述的利用天然微纳米级凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法，其特征在于，所述非接触式共培养方法为凹凸棒土溶液与细胞悬浮液分别置于具有连通性的分离式培养皿中。
6.根据权利要求1所述的利用天然微纳米级凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法，其特征在于，步骤(3)中所述管道中填充的天然微纳米凹凸棒土与流过的细胞培养液的体积比为10_3 10'
全文摘要
本发明公开了属于生物技术领域的一种利用天然纳米级凹凸棒土提高哺乳动物细胞产率的方法。本发明的方法采用天然凹凸棒土与哺乳动物细胞接触式或非接触式共培养的方式，会降低细胞培养液中的铵离子和乳酸浓度，优化哺乳动物细胞培养微环境，提高哺乳动物细胞产率，降低培养成本。本发明具有方法简单、成本低廉、细胞产率高、在生物制药产业具有较大的应用价值和市场前景。
文档编号C12N5/071GK103045532SQ201210559039
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者丁克俭, 贺丽, 吴昊, 王楠, 郑青 申请人:北京交通大学