专利名称：荧光定量pcr检测豇豆i型和ii型耐旱性的方法以及诊断性基因和引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法以及诊断性基因和引物。
背景技术：
豆(Viffna unguiculata L. Walp)起源于非洲干旱地区,是世界范围内重要的粮食豆类和亚洲国家重要蔬菜作物之一。据2006年统计年鉴，我国豇豆年产量达800万吨以上，而由于干旱造成的产量损失估计达20%左右。豇豆的耐旱性在不同基因型之间存在显著差异。前人研究表明豇豆自然资源中存在着两种不同类型的耐旱反应，即I型和II型耐旱响应(Watanabe et al. , 1997; Muchero et al. , 2008; Agbicodo et al. , 2009)。在I型耐旱响应中，植物在水分胁迫下各组织迅速关闭气孔、停止生长并保持各组织水分含量大致相当，并在复水后才恢复生长；与此相反，II型耐旱品种的老叶快速干枯死亡，并且将其中水分运送至新叶并保持新叶气孔开张和继续生长，直到土壤水分继续下降至相当低的临界值(图1)。由于这两类耐旱机制的显著不同，在豇豆耐旱育种中需要事先明确将要利用的育种亲本材料的耐旱类型，然后有针对性的设计育种方案和制定育种计划。基因表达的调节对生物性状的形成和变化具有至关重要的作用。在干旱胁迫下，大批植物基因如转录因子、脱水素蛋白、水通道蛋白、ABA合成相关因子基因等都会发生表达水平的上调或下调。模式植物中的大量研究表明，有些基因在干旱胁迫的表达调控模式在不同耐旱类型材料中特异地表现出差异，从而可以作为区分各种耐旱类型的诊断性基因。目前，豇豆中尚未报道或开发过可用于特异检测I型和II型耐旱性的诊断性基因及其引物。
检测基因表达的常用方法传统的有Northern杂交法，较新的有实时荧光定量PCR法、表达谱芯片法等。表达谱芯片是一种高通量检测方法，一次可对上万条基因的表达水平进行检测，适于从大量基因中筛选出与植物生长发育、环境胁迫、抗病虫害等相关的目标基因。实时荧光定量PCR通常一次检测一个基因，但简便、经济，一般实验室均可操作。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，通过简单的荧光定量PCR即可区分豇豆品种的不同耐旱类型，分析过程在1-2日内即可完成，大大提高了效率，有利于有针对性的利用不同耐旱类型的育种亲本，促进豇豆耐旱育种。本发明的第二个目的是一种特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因。本发明的第三个目的是一种特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因的荧光定量PCR引物。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案
荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，该方法被检测的诊断基因的序列如SEQ ID N0:1所示；所述的荧光定量PCR引物具有以下的序列
上游引物5’-TGGAITGTGGTGGACATAC-3’ ；
下游引物5’-GGITCCTTCTGAGCAITGA-3’。作为优选，该方法包括以下的步骤
1)材料准备挑选饱满的I份I型耐旱豇豆品种和I份II型耐旱豇豆品种种子播于营养钵，基质为蛭石营养土 =3 1 ;待子叶平展时浇透水后停止灌水，于处理后14天用常规Trizol法提取正常生长和受胁迫条件下的叶部RNA ;或者拔出植株根部，迅速用水洗净后用常规Trizol法提取正常生长和受胁迫条件下的根部RNA ；
2)RAN提取和反转录取叶片或根组织组织0.1g加液氮研磨成粉末，参照试剂盒说明书提取总RNA ;将提取的RNA用DEPC处理过的水稀释至0.1 g/L，在8 y L DEPC处理过的水中依次加入2 ii L锚定引物AP、RNA 2uL ;将`上述混合物置于70°C温浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5 X第一链缓冲液4 u L、0. 25mmol/L dNTP 2. 5 u L、0.1 mol/L DTT 2. 5 u L,200 u/u L 的 SUPERSCRIPT II 反转录酶 0. 4 y L ;25°C 5 min, 42°C 15 min,70°C 10 min，4°C保持；反转录产物于_20°C保存；cDNA稀释10倍备用；
所述的第一链缓冲液包括250 mmol/L Tris-HCl、pH8. 3、375 mmol/L KC1、15 mmol/LMgCl2 ；
3)荧光实时定量PCR反应采用八连PCR管为单位进行荧光实时定量PCR；PCR体系包括10ii L2XMix，5. L ddH20, 2 u L 50XR0X,0. 6u L 弓丨物和 2yL cDNA，为 20 y L 体系；PCR程序为①酶激活95°C 15min，扩增循环②95°C 15s，③55°C 30s，④72°C 32s，②-④共40个循环；溶解曲线分析为95°C 15s，60°C Imin ;每组PCR均做3次重复，取平均值进行计算；内参基因的序列如SEQ ID N0:4所示；数据分析采用2_""\法；结果表明利用荧光实时定量PCR反应获得了与芯片表达谱相一致的SEQ ID NO:1基因差异表达模式，从而能够将I型和II型耐旱性材料明确区分出来。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案
特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因，该基因的序列如SEQ ID NO:1所示。为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案
用于诊断上述的特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因的荧光定量PCR引物，其特征在于该引物具有以下的序列
上游引物5’-TGGAITGTGGTGGACATAC-3’ ；
下游引物5’-GGITCCTTCTGAGCATTGA-3’。本发明由于采用了上述的技术方案，通过简单的荧光定量PCR即可区分豇豆品种的不同耐旱类型，分析过程在1-2日内即可完成，大大提高了效率，有利于有针对性的利用不同耐旱类型的育种亲本，促进豇豆耐旱育种。本发明的有益效果是1.本发明所鉴定的在豇豆I型和II型耐旱性材料中呈显著差异表达的基因为特异区分豇豆品种不同类型的耐旱性提供了的诊断性基因工具。2.本发明获得的针对I型和II型耐旱性诊断性基因的引物序列为利用实时荧光定量PCR快捷、简便的检测不同育种亲本材料的耐旱类型提供了直接技术支持。
图1为豇豆I型和II型耐旱性的特征。左图为I型耐旱材料，植株所有三出复叶均微黄且萎蔫程度相当；右图为II型耐旱材料，植株表现为最下方的三出复叶完全枯死，上部叶片组织则持绿良好。图2为利用基因芯片比较和鉴定I型和II型耐旱豇豆叶片在正常生长和干旱胁迫下基因表达谱聚类图。lxp，2xp，3xp 1型耐旱豇豆品种“花豆角”在正常生长条件下的叶片；7xp,8xp,9xp 花·豆角”在干旱胁迫条件下的叶片；13xp, 14xp, 15xp II型耐旱St豆品种“饭豆”在正常生长条件下的叶片；19Xp，20Xp，21Xp 饭豆”在干旱胁迫条件下的叶片。每个编号代表一个生物学重复。图3为荧光实时定量PCR在2个不同豇豆品种“花豆角”和“饭豆”中扩增诊断性基因CETSl的结果及与基因芯片的比较。
具体实施例方式实施例1
特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因的筛选和引物的设计方法，该方法包括以下的步骤
(I)豇豆无冗余基因序列的下载和预处理从HarvEST豇豆DNA数据库UP12 (http://www. harvest-web. org/hweb/bin/wc. dll hwebProcess hmain &versid=68)批量下载 Bi豆 unigene 序列，共 29, 728 条。运行 VecScreen 程序(http://www. ncb1. nlm. nih. gov/VecScreen/VecScreen. html ),扫描并去除下载序列上包含的载体和接头序列。(2)豇豆基因芯片设计对UP12数据库中全部29，728条unigene序列进行扫描后，针对每条序列在其不同碱基位置分别设计4条寡核苷酸DNA序列作为探针，这4条序列在芯片杂交中信号值的加权平均值将定义一个基因的信号值。设计时技术标准为转录组GC含量在35-60%之间，探针设计倾向于ORF开放阅读框3’末端，探针长度为60_mer。除去189条序列没有设计出合适的探针，有62组成对序列和3组3对序列由于同源性太高，设计的探针相同，最终设计出探针总数为117，746条，代表了 29728-189-62x1-3x2=29，471条 unigene。(3)芯片杂交和差异表达谱分析将步骤(2)设计的所有探针序列交由Nimblegen公司点制成12 X 135k规格的表达谱芯片。将点制好的芯片交由北京博奥生物有限公司分别对正常灌溉和干旱处理条件下生长的I个I型耐旱豇豆品种“花豆角”和I个II型耐旱豇豆品种〃饭豆〃的叶片cDNA进行杂交分析。杂交方法按常规表达谱芯片的标准程序进行。杂交完毕后用Roche-NimbleGen MS200扫描仪扫描芯片。通过LuxScan 4.0图像分析软件分析把图像信号转化为数字信号。根据cy5和cy3总体信号的全局平均值对各芯片进行片间线性校正，使得各张芯片的全局平均值相同。采用RMA方法(Irizarry et al.，2003)进行归一化。用SAM软件进行统计显著性测验并结合文献分析，挑选出11个在两类耐旱性材料中的表达调控模式呈显著差异的候选基因(表I)。表I芯片表达谱分析获得的11个候选差异表达基因UP12数据库基因代号I基因功能注释
UP127902Non-specificlipid-transferprotein
权利要求
1.荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于该方法被检测的诊断基因的序列如SEQ ID NO:1所示；荧光定量PCR引物具有以下的序列 上游引物5’-TGGATTGTGGTGGACATAC-3’ ； 下游引物5’-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3’。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤 1)材料准备挑选饱满的I份I型耐旱豇豆品种和I份II型耐旱豇豆品种种子播于营养钵，基质为蛭石营养土 =3 1 ;待子叶平展时浇透水后停止灌水，于处理后14天用常规Trizol法提取正常生长和受胁迫条件下的叶部RNA ;或者拔出植株根部，迅速用水洗净后用常规Trizol法提取正常生长和受胁迫条件下的根部RNA ； 2)RAN提取和反转录取叶片或根组织组织O.1g加液氮研磨成粉末，参照试剂盒说明书提取总RNA ;将提取的RNA用DEPC处理过的水稀释至O.1 g/L,在8 μ L DEPC处理过的水中依次加入2 μ L锚定引物AP、RNA 2 μ L ;将上述混合物置于70°C温浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5 X第一链缓冲液4 μ L、0. 25mmol/L dNTP 2. 5 μ L、0.1 mol/L DTT 2. 5 μ L,200 u/μ L 的 SUPERSCRIPT II 反转录酶 O. 4 μ L ;25°C 5 min, 42°C 15 min,70°C 10 min，4°C保持；反转录产物于_20°C保存；cDNA稀释10倍备用； 所述的第一链缓冲液包括250 mmol/L Tris-HCl、ρΗ8· 3、375 mmol/L KC1、15 mmol/LMgCl2 ； 3)荧光实时定量PCR反应采用八连PCR管为单位进行荧光实时定量PCR；PCR体系包括10μ L2XMix，5. 4μ L ddH20, 2 μ L 50XR0X,0. 6μ L 弓丨物和 2yL cDNA，为 20yL 体系；PCR程序为①酶激活95°C 15min，扩增循环②95°C 15s，③55°C 30s，④72°C 32s，②-④共40个循环； 溶解曲线分析为95°C 15s，60°C Imin ； 每组PCR均做3次重复，取平均值进行计算；内参基因的序列如SEQ ID N0:4所示；数据分析采用2_“\法；结果表明利用荧光实时定量PCR反应获得了与芯片表达谱相一致的SEQ ID NO:1基因差异表达模式，从而能够将I型和II型耐旱性材料明确区分出来。
3.特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因，其特征在于该基因的序列如SEQIDNO:1所示。
4.用于诊断权利要求3所述的特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因的荧光定量PCR引物，其特征在于该引物具有以下的序列 上游引物5’-TGGATTGTGGTGGACATAC-3’ ； 下游引物5’-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3’。
全文摘要
本发明涉及荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法以及诊断性基因和引物。荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，该方法被检测的诊断基因的序列如SEQIDNO:1所示；所述的荧光定量PCR引物具有以下的序列上游引物5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；下游引物5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。本发明的优点所鉴定的在豇豆I型和II型耐旱性材料中呈显著差异表达的基因为特异区分豇豆品种不同类型的耐旱性提供了的诊断性基因工具，另外针对I型和II型耐旱性诊断性基因的引物序列为利用实时荧光定量PCR快捷、简便的检测不同育种亲本材料的耐旱类型提供了直接技术支持。
文档编号C12Q1/68GK103045738SQ201210559678
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者徐沛, 李国景, 吴晓花, 汪宝根, 鲁忠富, 罗洁, 王莎, 刘永华 申请人:浙江省农业科学院