专利名称：一种截短的甘露聚糖酶的设计与制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白质表达领域，尤其涉及截短的Aus Man5A(dAus Man5A)的设计和表达，以及该酶的性质和应用的研究。
背景技术：
β -甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase, EC 3.2.1.78)是一种能从均一甘露聚糖和异甘露聚糖主链的内部降解β_1，4-甘露糖苷键的水解酶，属于半纤维素酶类，其广泛地存在于微生物、植物和动物中。它可以广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、印染和石油工业等领域。在食品和医药领域，β-甘露聚糖酶作用于甘露聚糖后可以产生功能性低聚糖，这种低聚糖可以有效地降低人体血糖和胆固醇水平且有利于人和动物肠道内益生菌群的生长，进而调节人和动物的免疫系统、提高免疫力。在饲料工业中，它作为饲料添加剂能有效降解植物细胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗营养因子，提高能量利用率、改善饲料转化率。在造纸工业中，β_甘露聚糖酶和β_木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用， 处理纸浆，能明显改善纸质。将β_甘露聚糖酶运用纺织印染的漂白工艺中，能有效地去除产品上粘附的多余染料，更可以减少氯和碱的用量以及它们带来的环境污染问题，有利于生态环境的保护。目前已报道的能产β_甘露聚糖酶的微生物主要来自于细菌、真菌和放线菌，例如细菌中的枯草芽孢杆菌，真菌中的曲霉、木霉、青霉、酵母，以及放线菌中的链霉菌等。目前，关于第5家族β -甘露聚糖酶的报道较多，它们的最适pH值为3. O 7. 5，最适温度在45 92°C。
近年来，随着对自然界中半纤维素资源的开发、饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露寡糖生理功能的发现，甘露聚糖酶的需求量越来越大，导致对甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮。但就国内外相关文献或专利报道来看，微生物β_甘露聚糖酶发酵酶活性普遍不高，导致了生产成本很高，从而阻碍了该酶在众多领域中的广泛应用。另外为了提高β_甘露聚糖酶的发酵产率和酶活性，早期的研究工作主要集中在产酶菌种的筛选、诱变、产酶诱导，酶的分离纯化及性质，酶水解底物方式及应用等方面。进入 90年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究工作逐步转向酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但有关基于理性设计的甘露聚糖酶的分子改造，尤其是关于截短基因设计和表达的研究鲜有报道。据报道，蛋白质N端和C端的无序残基对蛋白的结构或功能的影响是难以捉摸的。 发明内容
本发明的目的是提供一种催化效率高的dAus Man5A截短酶分子的设计与构建的方法，对原有的Aus Man5A进行了分子改造。
本发明的技术方案将原有Aus Man5A的N端和C端分别截掉3个无序残基,构建出dAus Man5A截短酶，截短酶的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，相应地基因命名为dAusman5A。
携带有Aus Man5A基因的重组质粒pUCm-T_man5A有由江南大学构建和保藏(专利申请号:201010550927. 4)。
所述的截短酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:2。
所述的截短酶的活性测定方法
于25mL具塞试 管A和B中，各加入用pH 4. 8、乙酸-乙酸钠缓冲液配制的质量浓度为O. 5%的角豆胶溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入O.1mL适当稀释的酶液，50°C 准确反应IOmin ;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加 O.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生I μ mol还原糖所需的酶量定义为I个β -甘露聚糖酶活性单位(IU)。
所述的截短酶基因的构建和表达的方法
(I)截短残基的选定以里氏木霉β-甘露聚糖酶的三维结构(IQNR)为模板，用 Modeller9. 9 软件模拟出 Aus Man5A 的三维结构。利用 Discovery Studio 3. OClient 和 PyMOL软件对模拟出的三维结构进行分析，确定末端的无序残基。
(2)截短酶dAus Man5A基因的合成基于上面设计的截短酶基因序列，采用PCR技术将Aus Man5A的基因序列5'和3'端分别去掉9个碱基。PCR涉及到的两对引物分别为
dN3C3-F CTCGAGAAAAGAAGCACC TCCGGCCTCCAATTC,
dN3C3~R GCGGCCGCTTAAATAGCA GCAACATGATCCGTC。
以重组质粒pUCm-T-man5A为模板、dN3C3_F和dN3C3_R为弓I物进行PCR反应，反应条件为94°C 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin,30 个循环；72°C IOmin ;10°C永久保存。 将PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段dAus man5A并将它与pUCm_T载体连接，将连接产物热激转化入大肠杆菌JM109感受态细胞后进行蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定及测序鉴定。
(3)重组表达质粒的构建将测序正确的pUCm-T-dAus man5A及pPIC9KM分别用XhoI和Not I进行双酶切，回收目的片段并进行连接和转化。然后对重组菌进行筛选和鉴定，将经过初步鉴定的质粒送至上海生工进行测序验证，测序正确的重组质粒命名为 pPIC9KM-dAusman5A (图1)。
(4) GS115/dAus man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定将测序正确的 pPIC9KM-dAus man5A经Sac I线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞，先经MD平板筛选后再用G418筛选高拷贝的GS115/dAus man5A重组子，将高拷贝的重组子按照毕赤酵母表达手册上的标准流程进行诱导表达，并对发酵液进行活性测定和酶学性质初步鉴定。
本发明的有益效果本发明提供了一种dAus Man5A截短酶的设计与构建的方法， 新型截短酶工程菌GS115/dAus man5A的构建，以及截短酶的高效表达的方法。截短酶具有底物亲催化效率高的优点，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值，也为其它β -甘露聚糖酶的研究奠定了理论基础。
图1 :重组质粒pPIC9KM_dAus man5A的构建示意图具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1截短酶基因及其表达质粒的构建
以重组质粒pUCm-T-man5A为模板、dN3C3_F和dN3C3_R为引物进行PCR反应，反应条件为94°C 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin,30 个循环；72°C IOmin ;10°C永久保存。 将PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段dAus man5A并将它与pUCm_T载体连接，将连接产物热激转化入大肠杆菌JM109感受态细胞后进行蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定及测序鉴定。将测序正确的pUCm-T-dAus man5A及pPIC9KM分别用Xho I和Not I进行双酶切，回收目的片段并进行连接和转化。然后对重组菌进行筛选和鉴定，将经过初步鉴定的质粒送至上海生工进行测序验证，测序正确的重组质粒命名为pPIC9KM-dAUsman5A。
实施例2GS115/dAus man5A的构建、表达、及活性测定
用Sal I对pPIC9KM-dAus man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、 筛选 ，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/dAus man5A。该基因工程菌用1.0%甲醇诱导表达72h，采用DNS法测得发酵液中甘露聚糖酶活性比原酶的活性有较大提高。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度的结果表明，截短酶的蛋白表达水平也明显高于原酶。
权利要求
1.一种表达水平和催化催化效率高的dAus Man5A截短酶，其核苷酸和氨基酸序列分别为 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
2.截短酶工程菌的构建和表达方法 (1)截短残基的选定以里氏木霉β_甘露聚糖酶的三维结构(IQNR)为模板，用Modeller9. 9 软件模拟出 Aus Man5A 的三维结构。利用 Discovery Studio 3. OClient 和PyMOL软件对模拟出的三维结构进行分析，确定末端的无序残基； (2)截短酶dAusMan5A基因的合成基于上面设计的截短酶基因序列，采用PCR技术将Aus Man5A的基因序列5'和3'端分别去掉9个碱基；PCR涉及到的两对引物分别为dN3C3-F CTCGAGAAAAGAAGCACCTCCGGCCTCCAATTC,dN3C3-R GCGGCCGCTTA A ATAGCAGCA ACATGATCCGTC ； 以重组质粒pUCm-T-man5A为模板、dN3C3_F和dN3C3_R为引物进行PCR反应，反应条件为94°C 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin, 30 个循环；72°C IOmin ;10°C永久保存；将PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段dAus man5A并将它与pUCm_T载体连接，将连接产物热激转化入大肠杆菌JM109感受态细胞后进行蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定及测序鉴定； (3)重组表达质粒的构建将测序正确的pUCm-T-dAusman5A及pPIC9KM分别用XhoI和Not I进行双酶切，回收目的片段并进行连接和转化。然后对重组菌进行筛选和鉴定，将经过初步鉴定的质粒送至上海生工进行测序验证，测序正确的重组质粒命名为pPIC9KM_dAusman5A ； (4)GS115/dAusman5A的构建、表达、产物纯化及活性测定将测序正确的pPIC9KM-dAus man5A经Sac I线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞，先经MD平板筛选后再用G418筛选高拷贝的GS115/dAus man5A重组子，将高拷贝的重组子按照毕赤酵母表达手册上的标准流程进行诱导表达，并对发酵液进行活性测定和酶学性质初步鉴定。
全文摘要
一种截短的甘露聚糖酶的设计与制备。本发明提出了一种催化效率和表达水平较高的dAus Man5A截短酶的设计与构建的方法，其核苷酸序列为SEQ ID NO1，氨基酸序列为SEQ ID NO2，相应的基因命名为dAusman5A。本发明还公开了截短酶工程菌的构建以及高效表达的方法，制备的截短酶具有表达水平和催化效率高的特性，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
文档编号C12N15/56GK102994531SQ201210562588
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者邬敏辰, 唐存多, 陈忠法, 李剑芳 申请人:江南大学