专利名称：一种生产酸性蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，特别是涉及采用固态发酵生产酸性蛋白酶的方法。
背景技术：
酸性蛋白酶是一种在酸性(PH=2. 5 4)条件下催化蛋白质，生成多肽和氨基酸的生物催化剂。适用于酸性条件下水解动物、植物蛋白质，被广泛用于啤酒、果酒、酒精、饲料、皮革等工业。
目前，我国主要采用液体深层通风发酵，经硫酸钠盐析提取成工业级酸性蛋白酶产品。发酵酶活仅为6000 7000u/ml，酶的发酵水平低，生产原料品种需要较多，能源消耗高，成品酶的酶活保存率差，失活快。发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种生产酸性蛋白酶的方法，以提高酶的发酵水平和/或成品酶的保存率。
基于上述目的，本发明提供的生产酸性蛋白酶的方法包括
I)灭菌在曲盘中配置固体培养基；然后用塑料薄膜覆盖所述曲盘，并用橡胶圈将所述塑料薄膜捆扎于所述曲盘上；将曲盘置于高压灭菌锅内，进行灭菌；
2)接种灭菌后冷却，当曲盘中的固体培养基冷却至25 35°C时，移开所述塑料薄膜，在无菌条件下接入经过种母摇瓶培养和种子罐扩大培养的液体种母，并与所述固体培养基充分混合均匀；用塑料薄膜将所述曲盘再次覆盖，并用橡胶圈将所述塑料薄膜捆扎于所述曲盘上；
3)发酵接种完成后，将所述曲盘放入培养室中进行发酵；
4)后提取当发酵酶活达到要求后，即培养时间为110 120小时，发酵酶活达 45000 50000u/ml，停止发酵，进入后提取，提取成不同规格的酶制剂产品。
可选地，在所述发酵步骤中，培养室的温度为30±0. 5°C，在培养时间为O 60小时内，培养室内湿度为45 65% ;当菌丝繁殖至布满整个培养基的表面时，移去所述塑料薄膜，并将曲盘内的物料耙松，同时将培养室的湿度提高至85 90%。
较佳地，耙松所述物料后，在30 60分钟内将培养室的湿度提高至85 90%。
可选地，在所述后提取步骤中，停止发酵后，先将发酵成熟的固体酶放入浸泡罐中，加水浸泡，并开启搅拌，利用搅拌的剪切作用将浸泡液中的固体酶分散、打碎后进行萃取，得到萃取清液，萃取2 3次；再用离心机将萃取清液进行固液分离，并收集离心液 ’最后将所述离心液分别经板框二次过滤、超滤浓缩、精制过滤、添加稳定剂和防腐剂的步骤， 制得液体酸性蛋白酶。
可选地，所述液体酸性蛋白酶通过喷雾或沸腾干燥法制成固体酸性蛋白酶。
可选地，所述培养基中各种成分的重量体积比为碳源I 5%，营养盐O.1 O. 5%,氮源 O. 15 O. 55%,麸皮 98. 75 95%。
较佳地，所述碳源选自葡萄糖、淀粉糖和麦芽蔗糖中的任意一种。
优选地，所述营养盐选自磷酸二氢钾、硫酸铵、磷酸氢二钾、氯化铵、氯化钙和硫酸镁中的任意两种。
可选地，所述塑料薄膜选自聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙乙烯中的任意一种。
从上面所述可以看出，本发明提供的生产酸性蛋白酶的方法通过塑料薄膜覆盖曲盘、用橡胶圈将所述塑料薄膜捆扎于所述曲盘上，在灭菌过程中，能防止培养基中水分的蒸发、以及营养物质的流失，有利于微生物的繁殖、提高单位酶活力；在灭菌、接种、发酵等的转移过程中，使培养基不受外界微生物入浸和感染，给酸性蛋白酶固体发酵创造了一个良好的发酵环境；在发酵的前期，通过塑料薄膜保持曲盘内的湿度，这期间培养室不需要增加湿度，节约了能源，降低了生产成本，更重要的是保持培养室空气干燥和清洁，防止感染杂菌；发酵前期结束时，菌丝已进入旺盛期繁殖到整个培养料表面并伸展至培养基内，有较好的抗杂菌能力，同时进入产酶高峰期，此时及时去掉覆盖的塑料薄膜，耙松曲料，提高微生物的吸氧量，促进产酶及酶活力单位的积累，快速完成发酵，防止杂菌感染，提高产品质量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
作为本发明的一个实施例，所述生产蛋白酶的方法包括以下步骤
I)种母摇瓶培养将菌种接种于约500 IOOOml的液体培养基内，在温度约 30±1°C、转速约250 280r/min的条件下培养约24 28小时。
2)种子罐扩大培养将培养成熟的摇瓶种母移接至约500 1000L的种子罐内， 在温度约30±1°C、转速约250 280r/min的条件下培养约24 30小时。
3)灭菌在约700X500X50的曲盘中配置固体培养基约800 lOOOg，并将培养基抚平；然后用塑料薄膜覆盖所述曲盘，并用橡胶圈将所述塑料薄膜捆扎于所述曲盘上； 将曲盘置于高压灭菌锅内，在约O. 08 O. 12Mpa、约110 130°C条件下保持灭菌约30 50min,进行灭菌；
4)接种灭菌后冷却，当曲盘中的固体培养基冷却至约25 35°C时，移开所述塑料薄膜，在无菌条件下接入上述经过种母摇瓶培养和种子罐扩大培养的液体种母，并与所述固体培养基充分混合均匀；用塑料薄膜将所述曲盘再次覆盖，并用橡胶圈将所述塑料薄膜捆扎于所述曲盘上；
5)发酵接种完成后，将所述曲盘放入约30±0. 5°C的培养室中进行发酵；在发酵的前期(即O 60小时)，培养室不加湿，通过塑料薄膜保持曲盘内的湿度，供微生物繁殖；发酵前期结束时，菌丝已进入旺盛期，当菌丝繁殖至布满整个培养基的表面并伸展至培养基内时，有较好的抗杂菌能力，同时进入产酶高峰期，此时及时移去所述塑料薄膜，并将曲盘内的物料耙松，提高微生物的吸氧量，促进产酶及酶活力单位的积累，快速完成发酵， 防止被杂菌感染，提高产品质量；同时，在约30 60分钟内将培养室的湿度提高至85 90% ；
6)后提取当发酵酶活达到要求后，S卩120 130小时，发酵酶活达40000 50000u/g，这时停止发酵，进入后提取。具体为将发酵成熟的固体酶放入浸泡罐中，加水浸泡，并开启搅拌，利用搅拌的剪切作用将浸泡液中的固体酶分散、打碎后进行萃取，得到萃取清液，萃取2 3次；再用离心机将萃取清液进行固液分离，并收集离心液；最后将所述离心液分别经板框二次过滤、超滤浓缩、精制过滤、添加稳定剂和防腐剂等步骤，制得液体酸性蛋白酶。
可选地，所述液体酸性蛋白酶通过喷雾或沸腾干燥法制成固体酸性蛋白酶。
可选地，所述固体培养基中各种成分的重量体积比为碳源I 5%，营养盐O.1 O. 5%，氮源O. 15 O. 55%，麸皮98. 75 95%。所述液体培养基中各种成分的重量体积比为 碳源I 5%，营养盐O.1 O. 5%，氮源O. 15 O. 55%，其余为水。
可选地，所述培养基中为碳源选自葡萄糖、淀粉糖和麦芽蔗糖中的任意一种。
所述培养基中营养盐选自磷酸二氢钾、硫酸铵、磷酸氢二钾、氯化铵、氯化钙和硫酸镁中的任意两种。
可选地，所述塑料薄膜选自聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙乙烯中的任意一种。
需要指出的是，所述培养基各组分的“重量体积比 ”是指培养基中的物料重量与培养基体积的比值。
由此可见，本发明提供的生产酸性蛋白酶的方法通过塑料薄膜覆盖曲盘、用橡胶圈将所述塑料薄膜捆扎于所述曲盘上，在灭菌过程中，能防止培养基中水分的蒸发、以及营养物质的流失，有利于微生物的繁殖、提高单位酶活力；在灭菌、接种、发酵等的转移过程中，使培养基不受外界微生物入浸和感染，给酸性蛋白酶固体发酵创造了一个良好的发酵环境；在发酵的前期，通过塑料薄膜保持曲盘内的湿度，这期间培养室不需要增加湿度，节约了能源，降低了生产成本，更重要的是保持培养室空气干燥和清洁，防止感染杂菌；发酵前期结束时，菌丝已进入旺盛期繁殖到整个培养料表面并伸展至培养基内，有较好的抗杂菌能力，同时进入产酶高峰期，此时及时去掉覆盖的塑料薄膜，耙松曲料，提高微生物的吸氧量，促进产酶及酶活力单位的积累，快速完成发酵，防止杂菌感染，提高产品质量。
所属领域的普通技术人员应当理解以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括1)灭菌在曲盘中配置固体培养基；然后用塑料薄膜覆盖所述曲盘，并用橡胶圈将所述塑料薄膜捆扎于所述曲盘上；将曲盘置于高压灭菌锅内，进行灭菌；2)接种灭菌后冷却，当曲盘中的固体培养基冷却至25 35°C时，移开所述塑料薄膜， 在无菌条件下接入经过种母摇瓶培养和种子罐扩大培养的液体种母，并与所述固体培养基充分混合均匀；用塑料薄膜将所述曲盘再次覆盖，并用橡胶圈将所述塑料薄膜捆扎于所述曲盘上；3)发酵接种完成后，将所述曲盘放入培养室中进行发酵；4)后提取当发酵酶活达到要求后，即培养时间为110 120小时，发酵酶活达 45000 50000u/ml，停止发酵，进入后提取，提取成不同规格的酶制剂产品。
2.根据权利要求1所述的生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，在所述发酵步骤中，培养室的温度为30±0. 5°C，在培养时间为O 60小时内，培养室内湿度为45 65% ;当菌丝繁殖至布满整个培养基的表面时，移去所述塑料薄膜，并将曲盘内的物料耙松，同时将培养室的湿度提高至85 90%。
3.根据权利要求2所述的生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，耙松所述物料后，在 30 60分钟内将培养室的湿度提高至85 90%。
4.根据权利要求1所述的生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，在所述后提取步骤中， 停止发酵后，先将发酵成熟的固体酶放入浸泡罐中，加水浸泡，并开启搅拌，利用搅拌的剪切作用将浸泡液中的固体酶分散、打碎后进行萃取，得到萃取清液，萃取2 3次；再用离心机将萃取清液进行固液分离，并收集离心液；最后将所述离心液分别经板框二次过滤、超滤浓缩、精制过滤、添加稳定剂和防腐剂的步骤，制得液体酸性蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述液体酸性蛋白酶通过喷雾或沸腾干燥法制成固体酸性蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述固体培养基中各种成分的重量体积比为碳源I 5%，营养盐O.1 O. 5%，氮源O. 15 O. 55%，麸皮98. 75 95%。
7.根据权利要求6所述的生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、 淀粉糖和麦芽蔗糖中的任意一种。
8.根据权利要求6所述的生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述营养盐选自磷酸二氢钾、硫酸铵、磷酸氢二钾、氯化铵、氯化钙和硫酸镁中的任意两种。
9.根据权利要求1所述的生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述塑料薄膜选自聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙乙烯中的任意一种。
全文摘要
本发明公开了一种生产酸性蛋白酶的方法，所述方法通过用塑料薄膜将曲盘覆盖，并用橡胶圈将所述塑料薄膜捆扎于所述曲盘上，在灭菌过程中，能防止培养基中水分的蒸发、以及营养物质的流失，有利于微生物的繁殖、提高单位酶活力；在灭菌、接种、发酵等的转移过程中，使培养基不受外界微生物入浸和感染；在发酵的前期，通过塑料薄膜保持曲盘内的湿度，节约了能源，降低了生产成本；发酵前期结束时，菌丝已进入旺盛期繁殖到整个培养料表面并伸展至培养基内，有较好的抗杂菌能力，同时进入产酶高峰期，此时及时去掉覆盖的塑料薄膜，耙松曲料，提高微生物的吸氧量，促进产酶及酶活力单位的积累，防止杂菌感染，提高产品质量。
文档编号C12N9/50GK102994485SQ201210566838
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者李洪兵, 朱永明, 胡永明, 毛强, 王小玲 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司