专利名称：一种连续生产细菌纤维素的方法
技术领域：
本发明涉及一种连续生产细菌纤维素的方法，特别是涉及一种细菌纤维素连续收集的培养方法。
背景技术：
对于纤维素生物合成的研究有着诸多报道，其中通过革兰氏阴性，原核细胞类的木醋杆菌生物合成得到的纤维素具有产率高、纯度高的优点而被选为细菌纤维素发酵培养的模板菌种。木醋杆菌生物合成纤维素的过程可以分为细胞内小分子聚合形成β-1，4-葡萄糖大分子链与细胞外微纤丝逐步、层次化自组装形成纤维素network网状结构两个过程。细菌纤维素独特的生物合成过程使其在内部结构上具有层次化的特点首先，纤维素丝束(断面直径600nm I μ m)中的晶区微纤丝(断面直径7nm)之间的缝隙相当于一根根极细的毛细管，能够源源不断地将亲水小分子吸入细菌纤维素内部，在晶区之间形成无定型区。 这赋予了细菌纤维素超强的吸湿能力，能够吸收自重700倍甚至更多的水分；其次，由刚性的β_1，4-葡萄糖大分子链通过分子内与分子间氢键结晶形成的微纤丝使细菌纤维素具有良好的力学强度。通过碱液与丝束内部无定型区的水在高浓度向低浓度渗透作用下，使微纤丝分子内分子间氢键的重排，再经过热压干燥处理，使得丝束内部的晶区增大，微纤丝之间氢键结合位点明显增加，能够大大提高BC薄膜的力学强度，杨氏模量最高可达15GPa ；第三，木醋杆菌具有极强的氧气依赖特性，纤维素network结构形成于氧气与培养液气液两相界面处。利用这种生物特性，能够通过静置培养得到一系列不同形状的细菌纤维素材料。这三大结构上的特征，使细菌纤维素能够作为基材制成伤口敷料、造纸、声学振膜、透明材料等产品，在生物医学、食品、半导体、日用品等多个领域获得广泛的应用。但是，细菌纤维素在静置培养阶段的产率较低，规模化制备成本高昂是目前细菌纤维素产业化面临的主要瓶颈。关于提高细菌纤维素产量的研究，至今已取得了许多成果。日本科学家提出“两步法”高效制备椰果产品通过前期动态培养，使细菌细胞体积浓度在短时间内上升两个数量级，随后将高密度的菌液转接入浅盘进行静置培养，大大缩短了培养周期，同时得到的椰果果片表面平整，脱水收缩的现象也大有改善。研究人员受此启发，设计了例如机械搅拌式、气升式、转鼓式、转盘式等一系列动态培养装置来培养细菌纤维素。据文献报道，现有细菌纤维素动态培养得到的产量能够达到12. 6g/7天。动态培养的方式在产量上能够弥补静态培养的不足，但是所得到的细菌纤维素外形多为絮状、团簇状、球形、星形等形状，直接利用价值较低。此外，通过转盘式发酵罐得到的细菌纤维素均质性(Homogeneity)较差,培养后期随着细菌纤维素膜厚度增加，会从转盘上脱落，培养液中的丝絮状纤维素会缠绕在转动轴上，使机器无法转动。从根本上说，两步法依然属于静态培养范畴，提高的只是单批次细菌纤维素膜的产量，批次与批次之间存在着较长的零产量时间(也称为死亡时间，Dead time)。由于发酵培养液上方空气对于细菌纤维素内部network结构的扩散作用，使得细菌纤维素内部存在着有氧区(aerobic zone),该区域很小,厚度不超过Imm,但是80%的纤维素是由处于有氧区内部的细菌所生物合成的。细菌纤维素膜下方的培养液在毛细作用趋势，不断被吸入细菌纤维素内部，形成“碳源区”。“有氧区”与“碳源区”产生重叠，则细菌纤维素得以连续形成。随着细菌纤维素膜的厚度增加，下方培养液不足以向上渗透至靠近上表面的有氧区，宏观上体现为纤维素产量逐渐下降并最终停止生长。因此，如何充分地利用“有氧区”内的活性细菌是细菌纤维素连续生产的关键。本发明现有技术基础上，结合两步法先动态后静态培养细菌纤维素膜的基础上，将培养过程分为三个步骤，即将动态扩培结合静态预培养形成凝胶状半透明细菌纤维素薄膜，再转移至容器中进行连续培养，当细菌纤维素原膜厚度达到要求时取出进行后处理。通过在收集细菌纤维素薄膜时，沿水平方向将其分为上层包含有氧区活性细菌的“活性层”与下层细菌纤维素膜，并重复使用活性层直至细胞活性下降至细菌纤维素膜厚度增长速度逐渐下降，重复进行动态扩培和预培养，将新形成的凝胶状半透明细菌纤维素薄膜转移至容器中进行静置培养。大大提高了 “有氧区”的利用率，并通过预培养、静置培养和后处理三个过程的合理结合，将规模化生产细菌纤维素时所存在的零产量时间基本排除，提高了生产效率，能够、降低长时间生产细菌纤维素的原料、设备维护以及人工成本。
发明内容
本发明涉及一种连续生产细菌纤维素的方法。在现有技术的基础上，结合“两步法”先动态后静态培养细菌纤维素膜的基础上，通过将发酵培养细菌纤维素的过程分为预培养阶段、连续培养和后处理三个阶段，将菌种细胞分裂的快速增长期与平稳增长期分开操作，并精确控制各环节的衔接时间节点。预培养阶段将动态扩培结合静态预培养形成凝胶状半透明细菌纤维素薄膜，其中动态扩培是指在利用机械搅拌式发酵罐、鼓泡式发酵罐或气升式发酵罐对菌种进行搅拌动态培养；连续培养阶段收集细菌纤维素膜时，利用细菌纤维素在形成过程中的生物特性，将细菌纤维素原膜剖切分为上层活性层与下层细菌纤维素膜，重复利用活性层，提高了一次接种进入发酵培养液的菌种的利用率，能够实现至少7周的细菌纤维素连续生产。大大提高了有氧区的利用率，并通过动态扩培、预培养、静置培养三个过程的合理结合，将规模化生产细菌纤维素时所存在的零产量时间基本排除，提高了生产效率，能够明显降低长时间生产细菌纤维素的成本。作为优选的技术方案如上所述的一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，所述的细菌纤维素是由木醋杆菌在静置培养条件下，与细胞内通过在酶的催化作用下，将小分子葡萄糖以β -I, 4-糖苷键相互键合，聚合形成β -I, 4-葡萄糖大分子链，由细胞体侧面的“终端合成物(Terminalcomplex)”挤出细胞体外。β -I, 4-葡萄糖大分子链在分子内与分子间氢键作用下，聚集并结晶形成纤维素微纤丝(纤维素微晶，断面直径约7nm)，微纤丝进一步形成丝带(Ribbon，断面直径约125nm)、丝束(Bundle,断面直径约600nm Ιμπι)。在细菌细胞无规则折线形运动与细胞分裂两种现象同时存在的情况下，纤维素丝束交织形成纤维素network网状结构，最终形成细菌纤维素。本发明还提供一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，包括以下步骤I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨O. 05、. 5，酵母膏O. 05、. 5，柠檬酸O. θΓθ. 1，磷酸氢二钠O. 02、. 2，磷酸二氢钾ο. οΓο. 1，余量为水；发酵培养液的pH为4. O 6. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液转移、接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107 2X IO9个/ml范围内；3)预培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的预培养池中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，28 32°C静置培养；控制预培养池的空气压力为I个标准大气压与氧气体积浓度为10 15%，当预培养池中发酵培养液表面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜，且厚度达到O. 5 2mm时，取出；4)连续培养准备期将预培养池中取出的半透明的细菌纤维素薄膜或者分离后的活性层，平铺在连续培养池内位于发酵培养液液面位置的金属筛网上；所述的金属筛网的上表面低于液面O. 5 Imm ；静置培养期控制与细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力在上限不超过I. 2个标准大气压，下限高于I个标准大气压的范围内，氧气体积浓度为10 15% ;同时使金属筛网以O. 5 Imm/小时的速率下降，直至金属筛网与在发酵培养液表面的细菌纤维素薄膜完全分离且距离超过5cm时，停止下降；培养温度控制在28 32°C范围内；分离/收集期当细菌纤维素薄膜厚度达到要求厚度时，取出即获得细菌纤维素原膜；将细菌纤维素原膜沿水平方向剖切成分离的上下两层，上层为活性层，下层为细菌纤维素膜；所述活性层的厚度为O. 5 2mm ;所述的活性层进入下一个准备期，进行循环连续培养；4)后处理将所述细菌纤维素膜浸泡在浓度为I 10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2 10小时，用纯净水清洗至pH为7. O。如上所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的细菌纤维素原膜的厚度为5 100mm。如上所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的金属筛网为50 200目的金属网。如上所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。如上所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的通纯氧是指将医用氧以lL/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4°C下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养基中。
如上所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述培养基置于高压灭菌锅内121°C灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。有益效果与现有技术相比，本发明的有益效果是(I)在现有技术“两步法”培养细菌纤维素的基础上，将细菌纤维素的培养过程分为“动态扩培”、“预培养”以及“连续培养”三个步骤，将木醋杆菌细胞分裂的快速增长期与平稳增长期分开操作，并精确控制各环节的衔接时间节点，不仅能够对细菌纤维素发酵培养的各个环节精确控制，同时也能够大大降低企业规模化培养细菌纤维素时所存在的“零纤维素产量”时间，提高了细菌纤维素的生产效率。(2)通过在“连续培养”环节收集细菌纤维素膜阶段，利用细菌纤维素在形成过程
中的生物特性，将细菌纤维素由分离器分为上层“活性层”与下层“细菌纤维素膜”。针对现有技术中发酵生产细菌纤维素时对菌种利用率低下，生产成本高昂的缺陷，并重复利用“活性层”，提高了一次接种进入发酵培养液的木醋杆菌细胞的利用率，能够实现至少7周的细菌纤维素连续生产。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例II)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨O. 05，酵母膏O. 05，柠檬酸O. 01，磷酸氢二钠O. 02，磷酸二氢钾O. 01，余量为水；发酵培养液的pH为4. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液转移、接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml范围内；3)预培养；将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的预培养池中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，28°C静置培养；控制预培养池的空气压力为I个标准大气压与氧气体积浓度为10%，当预培养池中发酵培养液表面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜，且厚度达到O. 5_时，取出；4)连续培养准备期将预培养池中取出的半透明的细菌纤维素薄膜或者分离后的活性层，平铺在连续培养池内位于发酵培养液液面位置的金属筛网上；所述的金属筛网的上表面低于液面O. 5mm ；静置培养期控制与细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为I个标准大气压，氧气体积浓度为10%;同时使金属筛网以O. 5_/小时的速率下降，直至金属筛网与在发酵培养液表面的细菌纤维素薄膜完全分离且距离超过5cm时，停止下降；培养温度控制在28 0C ；分离/收集期当细菌纤维素薄膜厚度达到要求厚度时，取出即获得细菌纤维素原膜；将细菌纤维素原膜沿水平方向剖切成分离的上下两层，上层为活性层，下层为细菌纤维素膜；所述活性层的厚度为O. 5mm ；所述的活性层进入下一个准备期，进行循环连续培养；4)后处理
将所述细菌纤维素膜浸泡在浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7. O。实施例2I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为6. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液转移、接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X109个/ml范围内；3)预培养；将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的预培养池中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，32°C静置培养；控制预培养池的空气压力为I个标准大气压与氧气体积浓度为15%，当预培养池中发酵培养液表面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜，且厚度达到2_时，取出；4)连续培养准备期将预培养池中取出的半透明的细菌纤维素薄膜或者分离后的活性层，平铺在连续培养池内位于发酵培养液液面位置的金属筛网上；所述的金属筛网的上表面低于液面Imm ；静置培养期控制与细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为I. 2个标准大气压，氧气体积浓度为15%;同时使金属筛网以Imm/小时的速率下降，直至金属筛网与在发酵培养液表面的细菌纤维素薄膜完全分离且距离超过5cm时，停止下降；培养温度控制在32 0C ；分离/收集期当细菌纤维素薄膜厚度达到要求厚度时，取出即获得细菌纤维素原膜；将细菌纤维素原膜沿水平方向剖切成分离的上下两层，上层为活性层，下层为细菌纤维素膜；所述活性层的厚度为2mm ；所述的活性层进入下一个准备期，进行循环连续培养；
4)后处理将所述细菌纤维素膜浸泡在浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. O。实施例3I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；
发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液转移、接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml范围内；3)预培养；将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的预培养池中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，30°C静置培养；控制预培养池的空气压力为I个标准大气压与氧气体积浓度为10%，当预培养池中发酵培养液表面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜，且厚度达到Imm时，取出；4)连续培养准备期将预培养池中取出的半透明的细菌纤维素薄膜或者分离后的活性层，平铺在连续培养池内位于发酵培养液液面位置的金属筛网上；所述的金属筛网的上表面低于液面Imm ；静置培养期控制与细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为I. I个标准大气压，氧气体积浓度为10%;同时使金属筛网以Imm/小时的速率下降，直至金属筛网与在发酵培养液表面的细菌纤维素薄膜完全分离且距离超过5cm时，停止下降；培养温度控制在30 0C ；分离/收集期当细菌纤维素薄膜厚度达到要求厚度时，取出即获得细菌纤维素原膜；将细菌纤维素原膜沿水平方向剖切成分离的上下两层，上层为活性层，下层为细菌纤维素膜；所述活性层的厚度为I. 5mm ；所述的活性层进入下一个准备期，进行循环连续培养；4)后处理将所述细菌纤维素膜浸泡在浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7. O。实施例4I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3，蛋白胨O. 1，酵母膏O. I，柠檬酸O. 05，磷酸氢二钠O. I，磷酸二氢钾O. 05，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液转移、接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X108个/ml范围内；3)预培养；将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的预培养池中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，30°C静置培养；控制预培养池的空气压力为I个标准大气压与氧气体积浓度为11%，当预培养池中发酵培养液表面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜，且厚度达到Imm时，取出；4)连续培养准备期将预培养池中取出的半透明的细菌纤维素薄膜或者分离后的活性层，平铺在连续培养池内位于发酵培养液液面位置的金属筛网上；所述的金属筛网的上表面低于液面Imm ；静置培养期控制与细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为I. I个标准大气压，氧气体积浓度为11%;同时使金属筛网以Imm/小时的速率下降，直至金属筛网与在发酵培养液表面的细菌纤维素薄膜完全分离且距离超过5cm时，停止下降；培养温度控制在30 0C ；分离/收集期当细菌纤维素薄膜厚度达到要求厚度时，取出即获得细菌纤维素原膜；将细菌纤维素原膜沿水平方向剖切成分离的上下两层，上层为活性层，下层为细菌纤维素膜；所述活性层的厚度为2mm ；所述的活性层进入下一个准备期，进行循环连续培养；4)后处理将所述细菌纤维素膜浸泡在浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7. O。实施例5I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇4，蛋白胨O. 4，酵母膏O. 4，柠檬酸O. 05，磷酸氢二钠O. 1，磷酸二氢钾O. 05，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液转移、接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X108个/ml范围内；3)预培养;将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的预培养池中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，30°C静置培养；控制预培养池的空气压力为I个标准大气压与氧气体积浓度为12%，当预培养池中发酵培养液表面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜，且厚度达到Imm时，取出；
4)连续培养准备期将预培养池中取出的半透明的细菌纤维素薄膜或者分离后的活性层，平铺在连续培养池内位于发酵培养液液面位置的金属筛网上；所述的金属筛网的上表面低于液面Imm ；静置培养期控制与细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为I. I个标准大气压，氧气体积浓度为12%;同时使金属筛网以Imm/小时的速率下降，直至金属筛网与在发酵培养液表面的细菌纤维素薄膜完全分离且距离超过5cm时，停止下降；培养温度控制在30 0C ；分离/收集期当细菌纤维素薄膜厚度达到要求厚度时，取出即获得细菌纤维素原膜；将细菌纤维素原膜沿水平方向剖切成分离的上下两层，上层为活性层，下层为细菌纤维素膜；所述活性层的厚度为2mm ；
所述的活性层进入下一个准备期，进行循环连续培养；4)后处理将所述细菌纤维素膜浸泡在浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7. O。实施例6I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液转移、接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X108个/ml范围内；3)预培养；将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的预培养池中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，30°C静置培养；控制预培养池的空气压力为I个标准大气压与氧气体积浓度为13%，当预培养池中发酵培养液表面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜，且厚度达到Imm时，取出；4)连续培养准备期将预培养池中取出的半透明的细菌纤维素薄膜或者分离后的活性层，平铺在连续培养池内位于发酵培养液液面位置的金属筛网上；所述的金属筛网的上表面低于液面Imm ；静置培养期控制与细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为I. I个标准大气压，氧气体积浓度为13%;同时使金属筛网以Imm/小时的速率下降，直至金属筛网与在发酵培养液表面的细菌纤维素薄膜完全分离且距离超过5cm时，停止下降；培养温度控制在30 0C ；分离/收集期当细菌纤维素薄膜厚度达到要求厚度时，取出即获得细菌纤维素原膜；将细菌纤维素原膜沿水平方向剖切成分离的上下两层，上层为活性层，下层为细菌纤维素膜；所述活性层的厚度为2mm ；所述的活性层进入下一个准备期，进行循环连续培养；4)后处理将所述细菌纤维素膜浸泡在浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7. O。
权利要求
1 一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征是分为预培养阶段、连续培养和后处理三个阶段； 所述的预培养阶段包括菌种扩培步骤和培养步骤； 所述的连续培养为细菌纤维素的准备期、静置培养期和分离/收集期的循环培养； 所述的准备期是将预培养的细菌纤维素薄膜或分离后的活性层平铺在连续培养池的发酵培养液表面进行初期细菌纤维素培养的时期； 所述的静置培养期是指细菌纤维素膜通过静置培养达到要求的时期； 所述的分离/收集期是指在所述静置培养期结束后将所得的细菌纤维素原膜剖切成活性层和细菌纤维素膜的时期。
2.根据权利要求I所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的菌种扩培是指动态扩培，也就是在搅拌条件下扩培。
3.根据权利要求I所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为 1)发酵培养液的调配； 发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨0. 05、. 5，酵母膏0. 05、. 5，柠檬酸0. oro. 1，磷酸氢二钠0. 02、. 2，磷酸二氢钾0.01 0. 1，余量为水； 发酵培养液的pH为4. 0 6. 0 ; 将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液； 2)菌种扩培； 将所述的发酵培养液转移、接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X IO7 2X109个/ml范围内； 3)预培养； 将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的预培养池中，液面高度不超过5cm，放置于恒温培养环境内，28 32 °C静置培养； 控制预培养池的空气压力为I个标准大气压与氧气体积浓度为10 15%，当预培养池中发酵培养液表面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜，且厚度达到0. 5 2_时，取出； 4)连续培养 准备期将预培养池中取出的半透明的细菌纤维素薄膜或者分离后的活性层，平铺在连续培养池内位于发酵培养液液面位置的金属筛网上；所述的金属筛网的上表面低于液面0.5 Imm ； 静置培养期控制与细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力在上限不超过I. 2个标准大气压，下限高于I个标准大气压的范围内，氧气体积浓度为10 15% ;同时使金属筛网以0. 5 Imm/小时的速率下降,直至金属筛网与在发酵培养液表面的细菌纤维素薄膜完全分离且距离超过5cm时，停止下降；培养温度控制在28 32°C范围内； 分离/收集期当细菌纤维素薄膜厚度达到要求厚度时，取出即获得细菌纤维素原膜；将细菌纤维素原膜沿水平方向剖切成分离的上下两层，上层为活性层，下层为细菌纤维素膜；所述活性层的厚度为0. 5 2mm ;所述的活性层进入下一个准备期，进行循环连续培养； 4)后处理 将所述细菌纤维素膜浸泡在浓度为I 10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2 10小时，用纯净水清洗至pH为7. O。
4.根据权利要求3所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的细菌纤维素原膜的厚度为5 100mm。
5.根据权利要求3所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的金属筛网为50 200目的金属网。
6.根据权利要求3所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
7.根据权利要求3所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的通纯氧是指将医用氧以lL/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4°C下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养基中。
8.根据权利要求3所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述培养基置于高压灭菌锅内121°C灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
9.根据权利要求3所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的平铺是指固定半透明细菌纤维素薄膜或活性层首尾两端，将其平整铺于连续培养池内的金属筛网上表面，整个过程中不触碰半透明细菌纤维素薄膜或活性层上表面或下表面。
10.根据权利要求3所述的一种连续生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的沿水平方向剖切是指将细钢丝固定在连续培养池尾部的两端，细菌纤维素原膜在沿水平方向收集过程中，截面经细钢丝剖切为上层活性层与下层细菌纤维素膜；所述的细钢丝是指断面直径在0. 01 0. Imm的不锈钢丝，长度与连续培养池的宽度相同。
全文摘要
本发明涉及一种连续生产细菌纤维素的方法，通过将发酵培养细菌纤维素的过程分为预培养、连续培养和后处理三个步骤，将菌种细胞分裂的快速增长期与平稳增长期分开操作，并精确控制各环节的衔接时间节点。通过在连续培养环节收集细菌纤维素原膜阶段，利用细菌纤维素在形成过程中的生物特性，将细菌纤维素原膜剖切分为上层活性层与下层细菌纤维素膜，重复利用活性层，提高了一次接种进入发酵培养液的菌种细胞的利用率，能够实现至少7周的细菌纤维素连续生产。
文档编号C12R1/41GK102978256SQ20121057556
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者王华平, 杨敬轩, 李喆, 陈仕艳 申请人:东华大学