专利名称：一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B<sub>1</sub>产生趋势的方法
技术领域：
本发明属于微生物与分子生物学应用领域，尤其涉及一种利用多重PCR技术分析花生柏中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法。
背景技术：
花生柏极易感染黄曲霉和寄生曲霉等微生物，在一定温度与湿度条件下产生黄曲霉毒素。而黄曲霉毒素是目前发现的污染农产品中毒性最强的一类生物毒素，具有极强的致癌、致突变和致畸性；尤其是黄曲霉毒素B1，毒性分别是氰化钾和砒霜的10倍和68倍；黄曲霉毒素的污染，已经成为很多农产品规模应用的瓶颈与人畜生命安全的潜在威胁。目前黄曲霉菌毒素B1产生菌的鉴定十分困难，主要采用传统的形态学方法，通过光学显微镜观察微生物的形态特征以及平板单菌落的形态学分析，但是这两种方法都很难将黄曲霉毒素B1产生菌与其他非产黄曲霉毒素霉菌区分开来，尽管检测黄曲霉和寄生曲霉的传统方法和分子生物学方法已有许多，但由于花生柏样品成分复杂，对分子生物学方法的直接应用存在较大干扰，难以实现。
发明内容
本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种具有特异性高、能够快速鉴定花生柏中是否感染黄曲霉毒素B1产生菌、检测花生柏的黄曲霉毒素B1产生的趋势的方法。本发明的目的是这样实现的，一种利用多重PCR技术分析花生柏中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于 提取样品花生柏的基因组DNA后，通过多重PCR扩增黄曲霉毒素B1合成基因，通过PCR结果判断花生柏产生黄曲霉毒素B1的趋势，用于指导花生柏的储藏和运输条件控制。为了进一步实现本发明的目的，可以是所述样品花生柏采用缩分法取样，最终样品的重量为0.lg。为了进一步实现本发明的目的，可以是该方法包括以下步骤:
(I)将花生柏进行液氮研磨预处理，用土壤DNA抽提试剂盒提取花生柏基因组DNA，得到的粗DNA用核酸蛋白定量仪检测后存于-20°C备用；
(2)以提取的DNA为模板，用4组引物进行PCR扩增，得到PCR产物，所述4组引物为4对引物序列，第一组引物的正向序列如序列表中SEQ ID -1F所示，第一组引物反向序列则具有表中SEQ ID -1R的碱基序列；第二组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -2F和SEQ ID -2R的碱基序列；第三组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQID -3F和SEQ ID -3R的碱基序列；第四组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID-4F和SEQ ID -4R的喊基序列；
弓I物名称序歹Li_广物大小序歹Li表中的序歹Li号
aflRF 一TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG ~24SEQID-1F
aflRR Iccgtcagacagccactccacacgg 丨24 |seqid-1r
权利要求
1.一种利用多重PCR技术分析花生柏中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于提取样品花生柏的基因组DNA后，通过多重PCR扩增黄曲霉毒素B1合成基因，通过PCR结果判断花生柏产生黄曲霉毒素B1的趋势，用于指导花生柏的储藏和运输条件控制。
2.根据权利要求1所述的一种利用多重PCR技术分析花生柏中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于所述样品花生柏采用缩分法取样，最终样品的重量为0.lg。
3.根据权利要求1所述的一种利用多重PCR技术分析花生柏中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征是该方法包括以下步骤: (1)将花生柏进行液氮研磨预处理，用土壤DNA抽提试剂盒提取花生柏基因组DNA，得到的粗DNA用核酸蛋白定量仪检测后存于-20°C备用； (2)以提取的DNA为模板，用4组引物进行PCR扩增，得到PCR产物，所述4组引物为4对引物序列，第一组引物的正向序列如序列表中SEQ ID -1F所示，第一组引物反向序列则具有表中SEQ ID -1R的碱基序列；第二组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID-2F和SEQ ID -2R的碱基序列；第三组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -3F和SEQ ID -3R的碱基序列；第四组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -4F和SEQ ID -4R的喊基序列；
4.根据权利要求3所述的一种利用多重PCR技术分析花生柏中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于所述的PCR扩增是以待测花生柏的DNA为模板，用aflR、omt-l、Ver-l和ITS的4对引物进行PCR反应，每次反应均用无菌水代替DNA模板做一个阴性对照，其中:PCR 反应体系(25 μ ):2μ L DNA 模板、2.5μ L IOXPCR Buffer,2y L I Ommo I/L dNTP、上下游引物(10_01/^)各14 1^和0.25 μ L Taq DNA聚合酶(5U/μ L)，用超纯水补足总体积； PCR扩增条件:采用95°C变性4min、94°C变性30s、59°C退火30s、72°C延伸60s，共30个循环，最后72°C延伸5min。
5.权利要求1所述的一种利用多重PCR技术分析花生柏中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于根据PCR结果的条带数目，判定花生柏是否感染黄曲霉毒素B1产生菌，根据条带丰度判定黄曲霉毒素B1产生趋势。
全文摘要
本发明公开了一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，该方法属于微生物与分子生物学领域，是利用土壤DNA抽提试剂盒提取花生粕基因组DNA，通过黄曲霉毒素B1合成代谢途径的关键酶基因设计引物序列，PCR鉴定潜藏性的黄曲霉毒素产生菌，通过PCR结果指导花生粕的储藏、运输条件控制，也可为研究花生粕中黄曲霉毒素B1的动态变化与控制提供科学依据，具有速度快，可靠性高的优点。
文档编号C12Q1/68GK103103258SQ20121058428
公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者陆健, 李恒严, 蔡国林, 李秋, 朱德伟, 任晓静 申请人:山东鲁花集团有限公司, 江南大学