含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法，步骤如下：制备Fc基因片段；将所得的Fc基因片段连接到pMD18-T载体中，得连接产物pMD18T-Fc；构建表达载体：将所得的连接产物pMD18T-Fc和表达载体pCDNA3.1经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc。本发明制得含Fc端融合蛋白的真核表达载体，可直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体中，快速、高效的表达含Fc端的融合蛋白。
【专利说明】含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种真核表达载体及其构建方法，特别涉及一种含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002]抗体的Fe端负责抗体的效应功能，如激活补体、结合Fe受体、穿越胎盘等。Fe融合蛋白主要是将生物活性蛋白与IgG的绞链区及CH2、CH3区结合。Fe融合蛋白具有如下特征:(I)通过与抗IgG或蛋白A结合用于检测或纯化；(2)通过该蛋白分子与其配体的相互作用将Fe段的生物学效应引到特定目标，如ADCC、固定补体及免疫调节作用等；(3)增加该蛋白在血液中的半裳期，利于重组蛋白作为治疗药物在临床中的实际应用；(4) IgG、IgM和IgA的Fe结构域可形成多聚合分子，使重组蛋白具有更强的抗原结合力。
[0003]目前常用的表达载体中未含有Fe端融合蛋白的基因，在表达该类蛋白时需要自己构建，而现有技术方案是将生物活性蛋白的基因与Fe段基因通过重叠PCR连接好后，再构建到表达载体中，比较费时，费力。
【发明内容】
[0004]基于此，针对现有技术表达载体中未含有Fe端融合蛋白的基因,构建含有Fe的表达载体时，费时费力的问题，本发明提供含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法。
[0005]解决上述技术问题 的具体技术方案如下:
[0006]一种含Fe融合蛋白的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤:
[0007](I)制备Fe基因片段，所述Fe基因片段碱基组成如SEQ ID N0.3所示；
[0008](2)将步骤(1)所得的Fe基因片段连接到pMD18-T载体中，得连接产物pMD18T-Fc ；
[0009](3)构建表达载体:将步骤(2)所得的连接产物pMD18T_Fc和表达载体p⑶NA3.1经EcoR I , Not I双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fe融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc。
[0010]在其中一些实施例中，步骤(1)所述的Fe基因片段的制备方法为:以人IgGl的重链恒定区为模板，用引物扩增，得Fe基因片段。
[0011]在其中一些实施例中，所述的引物为:
[0012]上游引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，
[0013]下游引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
[0014]在其中一些实施例中，步骤(2)所述的连接为:于21_23°C连接0.9-1.lh。
[0015]根据上述构建方法制得一种含Fe融合蛋白的真核表达载体。
[0016]本发明一种含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法具有以下优点和有益效果:
[0017]本发明的构建方法，可快速、高效的表达含Fe端的融合蛋白，利用该方法得到的含Fe端融合蛋白的真核表达载体，可直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体中，显著改善的非Ig蛋白药物动力学特性。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为人IgG1Fc基因的PCR扩增结果示意图；
[0019]图2为所制备的载体P⑶NA3.1-Fc构建示意图；
[0020]图3为P⑶NA3.1-Fc琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例
[0021]本发明通过将1gG1的绞链区及CH2、CH3区即Fe段，构建到真核表达p⑶NA3.1中，获得一种含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法，该构建方法可快速、高效的表达含Fe端的融合蛋白。
[0022]为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂或者试剂盒，均为市售产品。
[0023]其中，质粒H:暨南大学邓宁教授惠赠PMD18T-PLCH ；
[0024]所用培养基的配方如下:
[0025]LB培养基:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCllg，溶于IOOmL去离子水中，高压蒸气灭菌。
[0026]含Amp的LB琼脂平板培养基:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCllg, 1.5g琼脂条溶于IOOmL去离子水中，高压蒸气灭菌，灭菌完成后待温度降为50°C是加入Amp，使终浓度为 50 μ g/mL0
[0027]含Zeocin的LB固体平板培养基:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g,NaCllg, 1.5g琼脂条溶于IOOmL去离子水中，高压蒸气灭菌，灭菌完成后待温度降为50°C是加入Zeocin，使终浓度为25 μ g/mL。
[0028]以下将结合具体实施例进一步阐述本发明。
[0029]实施例1
[0030]1.制备Fe基因片段:
[0031]以人IgG1的重链恒定区为模板，用引物人扩增，得Fe基因片段；
[0032]其中，所述的引物为:
[0033]SEQ ID N0.1
[0034]上游引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，
[0035]SEQ ID N0.2
[0036]下游引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
[0037](PCR扩增结果参见图1，其中M为DNA Marker; I为Fe基因片段)
[0038]其中，Fe基因片段的碱基组成为:
[0039]SEQ ID N0.3[0040]GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。
[0041]具体扩增体系如下(所用dNTP Mixture、Taq均购自日本宝生物工程株式会社TaKaRa Bio Inc):
[0042]PCR反应体系
[0043]PCR reaction system
【权利要求】
1.一种含Fe融合蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)制备Fe基因片段，所述Fe基因片段的碱基组成如SEQID N0.3所示； (2)将步骤(1)所得的Fe基因片段连接到pMD18-T载体中，得连接产物pMD18T_Fc； (3)构建表达载体:将步骤(2)所得的连接产物pMD18T-Fc和表达载体p⑶NA3.1经EcoR I , Not I双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fe融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的制备Fe基因片段的制备方法为=WAIgG1的重链恒定区为模板，用引物扩增，得Fe基因片段。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述引物为:
上游引 物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT， 下游引物:GCGGCCGCTCAITTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述的连接为:于21-23°C连接 0.9-1.1h0
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法制得一种含Fe融合蛋白的真核表达载体。
【文档编号】C12N15/66GK103898151SQ201210587375
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】万晓春, 吕卫东, 于广, 邓宁 申请人:深圳先进技术研究院