专利名称：一种分离纯化胰蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及纯化胰蛋白酶的方法。
背景技术：
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8. 9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近(23300)，其等电点约为pH10. 8，最适pH7. 6 8. 0，在pH = 3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH > 5时易自溶；Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸)的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专ー性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专ー性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶作为蛋白酶的ー种，不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最強的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。还可用于治疗毒蛇咬伤，也常用于动物细胞培养前对组织的处理。用传统的方法仅提取胰蛋白酶是相当困难的。2006年7月上海阿敏制药有限公司公开了ー种糜胰蛋白酶的制备方法(200610023582. 0)，其采用低温酸提、梯度盐析、冰水透析、亲和层析、こ醇醇析的产品エ 艺，得到糜胰蛋白酶。2011年I月马忠仁等申请了ー种提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682. X)，其采用了 CaCl2激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶的同时加入饱和度的(NH4)2SO4，使其生成硫酸钙沉淀吸附糜胰蛋白酶，经过洗脱、盐析、超滤和冻干获得白色的糜胰蛋白酶的冻干粉末。产品均为糜胰蛋白酶，没有单纯的胰蛋白酶提取分离纯化。
发明内容
本发明的目的是将提取的胰蛋白酶纯化，得到较高纯度的胰蛋白酶。相对于现有技术，本发明成本低，产品胰蛋白酶效价高，适合于规模化生产。本发明的技术方案是将胰蛋白酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干的方法，即可得较高纯度的胰蛋白酶，包括如下步骤(I)投料称取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2 4ml的水搅拌溶解，调节pH至3. 0±0. 5，以助其溶解，搅拌10 16小时；计量溶液体积，按400 500g/L比例加入固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10 16小时；(2)盐溶将溶液过滤，称量滤饼重量,先按每克滤饼加入2_4ml的水，搅拌溶解后，调节pH至3. 0±0. 4，再按每克滤饼加入I 3ml的饱和硫酸铵溶液静止沉淀10 16小时；
(3)盐析将溶液过滤，量取滤液体积，加入等体积量的饱和硫酸铵溶液，静置沉淀10 16小时；
(4)洗镁将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置I分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重，待活化；
(5)活化称滤饼重量为A千克，将滤饼溶于3A 5A升的O. 001 O. 01mol/L盐酸溶液，另加入O. 5 2mol/L氯化钙溶液A 3A升及pH7. 5 8. 5硼酸缓冲液4A 6A 升，再加入6A 9A升的水,调节pH至7. O 8. O,最后每克滤饼加5 15mg的结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液置O 10°C中静置60 80小时进行活化，pH控制在7. O 8. O ;
(6)除钙活化后的溶液，调节pH至3. 0±0. 4，再按200 300g/L加入固体硫酸铵，搅拌溶解，在O 10°C中存放32 60小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液按150 250g/L 加入固体硫酸铵，在O 10°C中静置10 14小时，过滤，得滤饼；
(7)结晶按每克滤饼加入I 2ml ρΗ8· O 10. O硼酸缓冲液，调节pH至8.0±0. 4，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，O 10°C时浸于外透液中，结晶3 7天；
(8)透析取出结晶液过滤得结晶物，再按每克结晶物加入I 3ml水溶解，调节 pH至3. 0±0. 5 ;将溶液透析2 4天，去除杂质，每10 14小时左右透析池换水一次，温度控制在O 10°C ；
(9)冻干取出透析液，加入少量硅藻土，抽滤，得滤液，调节pH至6. O±0. 4，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明
实施例1
1.投料
1.1称取胰蛋白酶粗品100. 0g，先用300ml纯化水搅拌溶解，加2. 5mol/L硫酸溶液调节PH至3. O,以助其溶解，搅拌12小时；
1. 2计量溶液体积298. 4ml，加入固体硫酸铵140. 9g，待其溶解后，静置沉淀12小时；
1. 3将溶液真空过滤，称量滤饼重量96. 6g,加纯化水289. 9ml,搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调节pH 至3. 0，加入饱和硫酸铵溶液193. 2ml，静止沉淀12小时；
1. 4将溶液过滤，量取滤液体积479. 3ml，加入饱和硫酸铵溶液479. 3ml，静置沉淀 12小时；
1. 5洗镁将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液， 静置I分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重 93. 3g，待活化；
2.活化
将滤饼溶于373. 2ml0. 005mol/L盐酸溶液，另加入lmol/L氯化钙溶液186. 6ml及 PH8. O硼酸缓冲液466. 5ml，再加入746. 4ml纯化水，调节pH至7. 4，最后加933mg活力较高的结晶胰蛋白酶进行活化处理，将溶液在5 10°C中静置72小时进行活化，第二天测pH值为7. 4 ;3.除钙活化后的溶液用2. 5mol/L硫酸溶液调节pH至3. 1，溶液体积为1873ml，再加入固体硫酸铵455. 2g，搅拌溶解，在0 10°C中存放48小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液加入固体硫酸铵369. 0g，在0 10°C静置12小时，过滤，得滤饼重量45. 6g ；4.结晶滤饼加入pH9. 0硼酸缓冲液68. 4ml,用2. 5mol/L硫酸溶液调节pH至8. 0,搅拌均匀，再将溶液装透析袋，5 10°C浸于外透液中，结晶5天，每2小时摇包一次；5.透析取出结晶液过滤得结晶物28. 7g，加纯化水43.1ml溶解，用2. 5mol/L硫酸调节pH至3. 0 ;将溶液装透析袋，然后挂于透析池中透析3天，去除盐类杂质，每12小时左右透析池换水一次，温度控制在5 10°C ；6.冻干取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽滤，得滤液，用5mol/L氢氧化钠溶液调节PH至6. 0，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品6. 2g，经测定其活性效价为2600iu/mg ；实施例21.投料
1.1称取胰蛋白酶粗品120. 0g，先用300ml纯化水搅拌溶解，加3. Omol/L硫酸溶液调节PH至3. 1，以助其溶解，搅拌12小时；1. 2计量溶液体积320. 4ml，加入固体硫酸铵128. 2g,待其溶解后，静置沉淀12小时；1. 3将溶液真空过滤，称量滤饼重量98. 3g,加纯化水393. 2ml,搅拌溶解后加
2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3. 2，加入饱和硫酸铵溶液294. 9ml，静止沉淀12小时； 1.4将溶液过滤，量取滤液体积680.1ml，加入饱和硫酸铵溶液680.1ml，静置沉淀15小时；1. 5洗镁将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置I分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剰余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重96. 8g，待活化；2.活化将滤饼溶于484. OmlO. 01mol/L盐酸溶液，另加入1. 5mol/L氯化钙溶液193. 6ml及PH8. 5硼酸缓冲液387. 2ml，再加入677. 6ml纯化水，调节pH至7. 5，最后カロ 970mg活力较高的结晶胰蛋白酶进行活化处理，将溶液在5 10°C中静置72小时进行活化，第二天測PH值为7.4；3.除钙活化后的溶液用3. 0mol/L硫酸溶液调节pH至3. 2，溶液体积为1892ml，再加入固体硫酸铵473. Og,搅拌溶解，在0 10°C中存放54小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液加入固体硫酸铵370. 0g，在0 10°C静置12小时，过滤，得滤饼重量47. 2g ；4.结晶
滤饼加入pH9. O硼酸缓冲液94. 4ml,用3. Omol/L硫酸溶液调节pH至8.1,搅拌均匀，再将溶液装透析袋，5 10°C浸于外透液中，结晶5天，每2小时摇包一次；
5.透析
取出结晶液过滤得结晶物29. 5g，加纯化水59. Oml溶解，用3. Omol/L硫酸溶液调节pH至2. 9 ;将溶液装透析袋，然后挂于透析池中透析3天，去除盐类杂质，每12小时左右透析池换水一次，温度控制在5 10°C ；
6.冻干
取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽滤，得滤液，用5mol/L氢氧化钠溶液调节PH至6. 2，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品7. 4g，经测定其活性效价为2590iu/ mg ；
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的 任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
权利要求
1.一种分离纯化胰蛋白酶的方法，其特征在于将胰蛋白酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干，即可。
2.根据权利要求1分离纯化胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)投料取胰蛋白酶粗品，加水溶解，调节PH，搅拌；加入硫酸铵，溶解，静置；(2)盐溶过滤,滤饼加水,搅拌溶解,调节pH，加入饱和硫酸铵溶液，静置；(3)盐析过滤，滤液中加入饱和硫酸铵溶液，静置；(4)洗镁将上清液弃去，抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置I分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，滤饼待活化；(5)活化将滤饼溶于盐酸溶液，加入氯化钙溶液及硼酸缓冲液，再加水，调节pH，最后加入结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液静置；(6)除钙将活化后的溶液调节pH，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置，过滤，滤液加入固体硫酸铵，静置，过滤，得滤饼；(7)结晶滤饼中加入硼酸缓冲液，调节pH，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中；(8)透析过滤得结晶物，加水溶解，调节pH;将溶液透析，去除杂质；(9)冻干取出透析液，抽滤，得滤液，调节pH，冻干后得结晶胰蛋白酶成品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(I)中，胰蛋白酶粗品用水溶解，粗品与水的重量比为1: 2-1 4，调节pH至3. 0±0. 5，搅拌10 16小时；每升溶液加入 400 500g固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10 16小时。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中，称取滤饼重量，加水的重量为滤饼重量的2 4倍，搅拌溶解后，调节pH至3. O ±O. 4，加入滤饼重量I 3倍的饱和硫酸铵溶液，静置10 16小时。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中，量滤液体积，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，静置10 16小时。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(5)中，称滤饼重量，加O.001 O.01mol/L盐酸溶液将滤饼溶解，加入O. 5 2mol/L氯化钙溶液，以及ρΗ7· 5 8. 5的硼酸缓冲液，再加入水，调节ΡΗ7. O 8. 0，最后每克滤饼加5 15mg的结晶胰蛋白酶进行活化处理，pH值控制在7. O 8. O ;所述盐酸溶液的加入量为滤饼重量的3 5倍，所述氯化钙溶液的加入量为滤饼重量的I 3倍，所述硼酸缓冲液的加入量为滤饼重量的4 6倍。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(6)中，活化后的溶液调节pH至3.0±0. 4，再按200 300g/L加入固体硫酸铵，搅拌溶解，在O 10°C中存放32 60小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液中按150 250g/L加入固体硫酸铵，O 10°C时放置10 14小时，过滤，得滤饼。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(7)中，按每克滤饼加入I 2mlpH8. O 10. O硼酸缓冲液，调节pH至8. 0±0. 4，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中，温度控制在O 10°C。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(8)中，按每克结晶物加入I 3ml 水溶解，调节pH至3. O±O. 5，温度控制在O 10°C，透析2 4天。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(9)中，调节pH至6.0±0.4。
全文摘要
本发明公开了一种分离纯化胰蛋白酶的方法，技术方案是将胰蛋白酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干，获得较高纯度的胰蛋白酶。胰蛋白酶精品收率在6％以上，活性效价在2500iu/mg以上。
文档编号C12N9/76GK103060297SQ20121059801
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者刘冠男, 王议锋, 刘翠珍, 宋超龙 申请人:青岛九龙生物医药有限公司