专利名称：面向空间的微型微流控实时荧光pcr工作系统的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种面向空间的微型微流控实时荧光PCR工作系统，是一种“功能集成结构缩微”型的PCR扩增反应装置，属于生物学、分析化学及医学检测领域。
背景技术：
分析测试是人类最频繁的科学技术活动之一，创新分析测试技术及相应的创新分析测试仪器在很大程度上代表了一个国家的科技水平，并保证了技术先进的国家在相关领域的知识和技术的战略储备和可持续发展能力。在以生命科学为主导的21世纪，新一代的分析测试仪器应该更加微型化、自动化、快速化与便携化。微型全分析系统(MiniaturizedTotal Analysis System, μ TAS)又称芯片实验室(lab on a chip，L0C)。μ TAS的目标是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能集成到便携设备上，甚至是方寸大小的芯片上，即实现生化分析实验室的“功能集成结构缩微”。随着我国载人航天技术的日趋成熟，航天任务周期的逐渐延长，对航天员健康保障的要求也会越来越高。航天器中处于非监控状态的微生物严重威胁航天员的健康。由于宇宙射线与应激等因素的协同作用，导致人体免疫功能降低，患病机率增加，此时舱中的致病微生物会严重影响到航天员的身体健康。同时，航天飞行器上携带有能在太空环境下生存的微生物，有可能通过人类或航天器带到空间站、火星表面，会对人类研究太空生命形式造成不利影响。因此，航天器上装备生物危害实时自动报警系统是十分必要的。生物危害报警器中的微型荧光检测系统，由于其关键技术的实质是要求功能集成和结构缩微，以实现重量轻体积小全自动检测为目标。而目前的生物芯片荧光微检测系统，也同样要求体积小、功能多、自动化水平高。因此，生物危害报警器中荧光微检测系统的研究，将可以移植在生物芯片荧光微检测系统基础上进行，并可以对检测系统在失重条件下的计算进行修正研究，以实现“面向空间应用”。PCR微流控生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它是将采样、稀释、加试剂、反应、分离和检测等功能集成于一个芯片里，其科学性和先进性集中体现在结构缩微和功能集成这两个方面。生物芯片技术有4个基本要点芯片制备、样品制备、生化反应和信号检测。其原理是PCR反应混合物在精密注射泵的作用下按设定的流速进入生物芯片上分别处于三个恒温区(94°C、50 60°C、72°C )的微通道，经过PCR的变性、复性和延伸，从而实现一次扩增循环，一个循环可以使DNA总量增加一倍。在合适条件下，这种循环不断重复，η次循环后使产物DNA的量按2η方式扩增。最后待测液体经过激发光源照射发出荧光，由光敏元件采集并经过光电转换后输出荧光值的电信号。显然目前的微流控PCR工作系统对于在空间进行PCR荧光实时检测工作主要存在如下缺点I、温度循环系统采用铜块或铝块进行加热和风扇冷却相配合，整个装置耗能多，体积大难以缩小，无法实现便携性；
3[0009]2、目前荧光微光谱检测器都是直接使用传统的封装光电管，如光电倍增管(PMT)或电荷耦合元件(CCD)。由于元件自身的体积就很大，而且又是分体使用，需要有配套的光路装置，致使整个荧光检测装置的体积庞大，根本不可能嵌入到生物芯片中；3、由于在激发光传导和反射光采集时需要各类光学器件和光纤组成的光路进行光路传输，不仅结构复杂难以实现集成化，并且影响实时荧光检测的稳定性；4、由于检测并未达到零距离接触的测量方式，会使荧光微检测受到非检测对象物质，如组成微通道壁等物质的干扰，造成测量误差；5、PCR微流控生物芯片的进样控制系统、温度控制系统、荧光检测系统一般采用各部分单独控制，无法对微通道内温度的变化、液体的流速及荧光检测之间的信号进行实时反馈与集成控制。因此，实现对PCR微流控工作系统不同模块间进行高度集成控制，以及研制体积小到可嵌入芯片且灵敏度高到能达到生物技术要求的微型荧光检测装置是实现PCR荧光实时检测系统的集成便携式以及微型化的主要研究方向。
实用新型内容为了很好地解决上述问题，本实用新型涉及一种微型微流控实时荧光PCR工作系统，主要应用于空间范围对PCR扩增反应进行实时荧光检测。目的在于实现微型微流控实时荧光PCR检测系统的集成自动化控制，以及实现整个工作系统的便携式微型化。本专利是采用以下技术方案实现上述目的一种微型微流控实时荧光PCR工作系统，包括生物芯片I，注射泵2，步进电机3 ;所述的生物芯片I上依次设置有三个恒温加热区5，即高温变性区、适温延伸区、低温退火区；所述高温变性区的温度为94°C、低温退火区的温度为56°C、及适温延伸区的温度为720C ;生物芯片I上还设计有微通道4，微通道4依次通过高温变性区、低温退火区、适温延伸区，构成一个反应循环通道，然后在适温延伸区折弯，再依次经过高温变性区和低温退火区到达适温延伸区，构成下一个反应循环通道；微通道4中多个反应循环通道依次相连；为了避免高温对检测器件的损害，因此在微通道中温度较低的退火区的折弯区设置有微型荧光检测装置8 ;微通道4的入口与连接有步进电机3的注射泵相连；步进电机3的控制端与微型荧光检测装置8的检测信号连接至单片机控制系统10 ;高温变性区、低温退火区、适温延伸区之间设置有隔热风门7。所述的生物芯片I为微流控生物芯片。所述的反应循环通道的个数为20至30个。所述的单片机控制系统10包括液晶显示装置和键盘输入装置。所述的微通道4用光刻技术或蚀刻技术或热压法、注塑法、激光烧蚀微加工法在玻璃、硅片或高聚物材料上制作，或将毛细管直接布在贴有加热薄膜的载片上。所述的隔热风门7为孔状。所述的微型荧光检测装置8主要包括激发光光源单元11和荧光检测单元12以及检测装置的电输出入层9 ;其中激发光光源单元11为管状，由激发光源13、组合滤光片14、光学微透镜16和将整个激发单元的四周包围起来的对导管内光波高反射和对导管外光波完全阻隔的作用的多层光学薄膜15组成；荧光检测单元12为管状，由光学微透镜16、组合滤光片18、光电转换器件17和将整个检测单元的四周包围起来的对导管内光波高反射和对导管外光波完全阻隔的作用的多层光学薄膜15组成；所述的激发光光源单元11的连接方式是将激发光源13与组合滤光片14用多层光学薄膜15包围成管状，然后在组合滤光片14上采用原位成型法制作光学微透镜16，即将紫外光学固化胶液滴从组合滤光片14上垂直释放，滴落到组合滤光片14上，并自上而下向 四周扩散流淌，用紫外激光对液滴进行照射，使其固化，形成微光学透镜16 ；荧光检测单元12同样是将光电转换器件17和组合滤光片18用多层光学薄膜15包围成管状，然后在滤光片表面制作光学微透镜16。所述的微型荧光检测装置8与生物芯片I的连接方式为在生物芯片I的微通道4的底部和两侧打孔，将激发光光源单元11置于底部孔内，光学微透镜朝上，荧光检测单元12置于左侧，微透镜朝右；在微通道4的顶部以及右侧再嵌入另一套微型检测装置19，其中激发光光源单元11置于顶部，微透镜朝下，荧光检测单元12置于右侧，微透镜朝左；使光学微透镜均朝向流有待测微流体的微通道4 ；所述的检测装置的电输出入层9位于生物芯片I的下端与低温退火区相隔开，或置于生物芯片I上刻蚀出的槽状通道中，或直接置于生物芯片I表面。本实用新型中的装置是这样工作的注射泵2直接插入芯片上的微通道，由步进电机3推动注射泵完成样品的进样，同时可以通过单片机微处理系统10给予步进电机不同的指令实现对微流体流速的控制；4为充满待测微流体的微通道，待测流体通过微通道流经三个不同的温度区5实现一次DNA的扩增，即DNA经高温变性(94°C )、低温退火(56°C )以及适温延伸(72°C)后完成一次循环，因此可以通过设定微通道在不同温度区域的通道长度就可以确保待测流体在不同温度区的反应时间；5、6组成恒温控制系统，恒温区5从芯片顶端依次向下三个温度区的设定温度分别为94°C、72°C和56°C，在加热区表面粘贴的贴片式温度传感器6获得实时温度值后反馈到微处理系统10实现对温度的实时监控；在此处嵌入微型荧光检测装置8对待测微流体进行检测，同时也可对待测微流体的流速进行监测。其中激发光光源单元11可以采用导体发光二极管(LED)或半导体激光二极管(LD)提供激发光，荧光检测单元12所用光电转换器件可以是光电二极管或硅兰光电池来采集荧光信号；9为微型荧光检测装置的电输出入层，待检测物质由激发光激发出荧光，被检测单元采集后变成电信号输出；10为单片机微处理系统，主要对PCR反应的三大模块进行集成化控制，即温度控制模块、样品进样测速模块以及荧光检测模块。该微型微流控实时荧光PCR工作系统图I所示，由于PCR扩增反应至少需要20 30个扩增循环，且每个PCR扩增循环的时间必须一致。当待测流体通道进入微通道4后流经高温变性区、低温退火区和适温延伸区后为一个反应循环，因此至少需要30个相同的反应循环通道，且每个PCR扩增循环微通道的长短和布局是一样的。本专利中温度加热区域5的加热方式是将贴片式电阻加热薄膜直接粘贴到微通道底部进行加热，其温度变化可通过温度传感器6采集并反馈回单片机微处理系统10进行微调整，其中温度传感器6直接粘贴在贴片式电阻加热薄膜表面。为了实现微流控PCR反应的实时荧光检测，本专利中提出每完成一次扩增循环对待测流体的荧光信号检测一次，因此在每个循环微通道的同一位置设置有微型荧光检测装置8，每相邻的两个荧光实时检测点在微流体流动方向上的长度为一个循环微通道长度。为了保证检测的稳定性，因此从第二个PCR扩增循环开始，待测液体由单片机10控制步进电机3推动注射泵2注入微通道，待微流体按预先设定好的流速在微通道内流动，当到达检测点时，微型荧光检测装置8检测到待测液体的实际荧光信号值，同时根据荧光PCR试剂的前端是否流到正在检测的荧光检测点，计算机记录微流体流经该通道的时间，就可获得微流体在该通道内的实际的工作流速和实际流速需调整量，从而反馈给单片机控制系统后再将实际流速调整量反馈到步进电机完成下一个扩增循环。本专利所提出的工作系统具有以下优势本实用新型集成了微流控实时荧光PCR工作系统的样品进样测控速系统、温度控制系统以及微型实时荧光检测系统，采用单片机微处理器集成控制，既减少了多余的外围设备，使工作系统更加集成微型化，这种“功能集成结构微缩”正适合面向空间应用，又使不同模块之间及时反馈并做调整，极大缩短了整个系统的工作周期。本实用新型中的微型荧光检测装置8直接嵌入到微通道中，集成了多种非电要素，如激发光源、光的聚集、传输、光勻束、光米集、光检测等。由于取代了无法嵌入芯片的光电倍增管PMT或电荷耦合元件(XD，使得整个装置的特征尺寸缩小到只有毫米数量级，甚至还可以再进一步微缩至微米量级，并在微通道每个反应循环的同一位置设置检测点，可以根据荧光PCR试剂的前端是否流到正在检测的荧光检测点对待测液体的流速进行实时调難
iF. O工作系统中生物芯片中的微通道，可以采用光刻技术、蚀刻技术以及热压法、注塑法、激光烧蚀微加工法等方式在玻璃、硅片或高聚物材料上制作，也可将毛细管直接布在贴有加热薄膜的载片上，毛细管作为扩增反应所用的微通道与上述等方式具有以下优势(I)制作工艺简单易于加工，并且性价比高可以一次性使用；(2)毛细管内壁光滑，相比于以上方式减小了通道内的粗糙度以及层流效应；(3)采用毛细管作为微通道时，用固化胶固化成特定形状通道，由于胶体成黑色，即可以满足荧光检测时所需的避光环境。生物芯片中不同的温区之间设有隔热孔(风门)7，使不同温区的隔温效果有效的提高。
图I微型微流控实时荧光PCR工作系统总结构图；图2图I所示方向的A-A剖面图；图3通道中微型荧光检测装置的局部放大图；图中1生物芯片；2注射泵；3步进电机；4微通道；5恒温加热区；6温度传感器；7隔热风门；8微型荧光检测装置；9检测装置的电输出入层；10单片机控制系统；11激发光光源单兀；12突光检测单兀；13激发光源；14、18组合滤光片；15光学薄膜；16光学微透镜；17光电转换器件；19另一套微型荧光检测装置；20芯片微通道载片截面。
具体实施例
以下结合附图I 3详细说明本实施例。本专利的结构示意图如图I所示，这种面向空间的微型微流控实时荧光PCR工作系统主要包括三个控制模块以及作为载体的生物芯片，即进样测控速控制系统、温度控制系统以及微型荧光检测系统，由单片机微处理器进行集成控制。整个芯片的尺寸大约为80X60X10mm。具体实施内容为图I中2与3构成进样装置，由步进电机控制注射泵将液体注入微通道4内，可通过单片机微处理系统10设定不同指令给步进电机来控制流体的流速，待测微流体按一定的流速流经三个恒温加热区5，其温度变化可通过温度传感器6采集并反馈回单片机10进行微调整。待测液体到达微通道中的微型荧光检测装置8时，完成一个PCR扩增反应循环。在检测点，微型荧光检测装置获得待测微流体的实际荧光信号值。如图3所示检测装置主要包括激发光光源单元11和荧光检测单元12，激发光源13 —般采用半导体发光二极管(LED)或半导体激光二极管(LD)，经特定峰值波长的组合滤光片14后经光学微透镜16聚焦到被测生物微流体上，使相应的待测微流体发出荧光。15为多层光学薄膜，将整个激发单元的四周包围起来，形成管状，起到对管内光波高反射和对管外光波完全阻隔的作用。17为光电转换器件，可以是光敏二极管或硅兰光电池，荧光信号经光学微透镜16聚焦后经过特定峰值波长的组合滤光片18后由光敏二极管采集并转换为电信号经9输出到单片机微处理系统10。同时根据荧光PCR试剂的前端是否流到正在检测的荧光检测点，微处理系统会记录微流体流经该通道的时间，因此得到实际的工作流速=一个微通道的长度/微流体流经该通道实际所需时间，实际流速需调整量=理论设计流速-实际的工作流速，结果为正，说明实际的工作流速需增加；反之需减少；结果为零，说明实际的工作流速与理论计算设计的工作流速吻合，实际流速不需调整。从而实现了对实时荧光检测和进样测速控速同步控制，并与温度控制系统结合起来均由单片机微处理系统控制，从而减少芯片的外围设备，使工作系统更加集成化微型化，以达到空间作业的要求。
权利要求1.一种微型微流控实时荧光PCR工作系统，其特征在于包括生物芯片(I)，注射泵(2)，步进电机(3);所述的生物芯片(I)上依次设置有三个恒温加热区(5)，即高温变性区、适温延伸区、低温退火区；所述高温变性区的温度为94°C、低温退火区的温度为56°C、及适温延伸区的温度为72°C ;生物芯片(I)上还设计有微通道(4)，微通道(4)依次通过高温变性区、低温退火区、适温延伸区，构成一个反应循环通道，然后在适温延伸区折弯，再依次经过高温变性区和低温退火区到达适温延伸区，构成下一个反应循环通道；微通道(4)中多个反应循环通道依次相连；为了避免高温对检测器件的损害，因此在微通道中温度较低的退火区的折弯区设置有微型荧光检测装置(8);微通道(4)的入口与连接有步进电机(3)的注射泵相连；步进电机(3)的控制端与微型荧光检测装置(8)的检测信号连接至单片机控制系统(10);高温变性区、低温退火区、适温延伸区之间设置有隔热风门(7)。
2.根据权利要求I所述的一种微型微流控实时突光PCR工作系统,其特征在于所述的生物芯片(I)为微流控生物芯片。
3.根据权利要求I所述的一种微型微流控实时突光PCR工作系统,其特征在于所述的反应循环通道的个数为20至30个。
4.根据权利要求I所述的一种微型微流控实时突光PCR工作系统,其特征在于所述的单片机控制系统(10)包括液晶显示装置和键盘输入装置。
5.根据权利要求I所述的一种微型微流控实时突光PCR工作系统,其特征在于所述的微通道(4)用光刻技术或蚀刻技术或热压法、注塑法、激光烧蚀微加工法在玻璃、硅片或高聚物材料上制作，或将毛细管直接布在贴有加热薄膜的载片上。
6.根据权利要求I所述的一种微型微流控实时突光PCR工作系统,其特征在于所述的隔热风门(7)为孔状。
7.根据权利要求I所述的一种微型微流控实时突光PCR工作系统,其特征在于所述的微型荧光检测装置(8)主要包括激发光光源单元(11)和荧光检测单元(12)以及检测装置的电输出入层(9);其中激发光光源单元(11)为管状，由激发光源(13)、组合滤光片(14)、光学微透镜(16)和将整个激发单元的四周包围起来的对导管内光波高反射和对导管外光波完全阻隔的作用的多层光学薄膜(15)组成；荧光检测单元(12)为管状，由光学微透镜(16)、组合滤光片(18)、光电转换器件(17)和将整个检测单元的四周包围起来的对导管内光波高反射和对导管外光波完全阻隔的作用的多层光学薄膜(15)组成；所述的激发光光源单元(11)的连接方式是将激发光源(13)与组合滤光片(14)用多层光学薄膜(15)包围成管状，然后在组合滤光片(14)上采用原位成型法制作光学微透镜(16);荧光检测单元(12)同样是将光电转换器件(17)和组合滤光片(18)用多层光学薄膜(15)包围成管状,然后在滤光片表面制作光学微透镜(16);所述的微型荧光检测装置(8)与生物芯片(I)的连接方式为在生物芯片(I)的微通道(4)的底部和两侧打孔，将激发光光源单元(11)置于底部孔内，光学微透镜朝上，荧光检测单元(12)置于左侧，微透镜朝右；在微通道(4)的顶部以及右侧再嵌入另一套微型检测装置(19)，其中激发光光源单元(11)置于顶部，微透镜朝下，荧光检测单元(12)置于右侧，微透镜朝左；使光学微透镜均朝向流有待测微流体的微通道(4)；所述的检测装置的电输出入层(9)位于生物芯片(I)的下端与低温退火区相隔开，或置于生物芯片(I)上刻蚀出的槽状通道中，或直接置于生物芯片(I)表面。
专利摘要面向空间的微型微流控实时荧光PCR工作系统，属于生物学、分析化学及医学检测领域包括生物芯片，注射泵，步进电；所述的生物芯片上依次设置有高温变性区、适温延伸区、低温退火区；生物芯片上还设计有微通道，微通道依次通过上述三区，构成一个反应循环通道，然后在适温延伸区折弯，再依次经过高温变性区和低温退火区到达适温延伸区，构成下一个反应循环通道；微通道中多个反应循环通道依次相连在微通道中温度较低的退火区的折弯区设置有微型荧光检测装置；微通道的入口与连接有步进电机的注射泵相连；步进电机的控制端与微型荧光检测装置的检测信号连接至单片机控制系统；本实用新型制作工艺简单易于加工，并且性价比高可以一次性使用。
文档编号C12M1/34GK202730131SQ20122007209
公开日2013年2月13日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者吴坚, 杨洋, 陈涛, 刘世炳 申请人:北京工业大学