专利名称：快速检测皮革真实属性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测皮革真实属性的试剂盒。
背景技术：
PCR是聚合酶链式反应的简称，是分子生物学中广泛运用的一项技术，主要原理是通过热循环，达到目的基因片段的大量扩增。目前这项技术越来越广泛地运用于产品检测之中。例如，运用PCR技术检测牛奶或腊肠中的植物成分等，运用PCR技术检测肉骨粉等产品中的动物源性成分等，运用PCR技术检测食品中的转基因成分等。皮革主要是由哺乳类动物毛皮加工而成，是我国重要的出口创汇产品。天然皮革按其动物来源种类分，主要有牛皮革、羊皮革、猪皮革、马皮革、兔皮革等。由于天然皮革种类繁多，价格昂贵，一些不法商贩为了寻求利益的最大化，以人造革冒充天然皮革，或以低档皮革冒充高档皮革，损害了广大消费者的健康和利益，对社会经济以及皮革产业发展产生了不利的影响。目前，国内外皮革材质的鉴别主要仍以手摸眼看的感官鉴定方法为主，随着皮革加工技术的提高，在某些方面，感官鉴别方法已很难鉴别出皮革种类，急需开发更为科学有效的方法。
实用新型内容基于此，本发明提供了一种快速检测皮革真实属性的试剂盒。该试剂盒主要是依据不同种类皮革所承载的遗传信息存在差异，通过基因检测技术特异性地分析皮革样品中的DNA信息来区分皮革种类。一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，包括盒体，盒体内主要有:具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶；所述试剂瓶包括装有DNA提取缓冲液的试剂瓶，装有Taq DNA聚合酶的试剂瓶，装有PCR反应液的试剂瓶和装有上样缓冲液的试剂瓶。本实用新型从遗传学角度对皮革样品基因成分进行分析鉴别，克服了传统的感官鉴别方法所面临的难题，具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前皮革基因检测方法的空白，为皮革种类的鉴定提供了一种精确且易于标准化的分析方法，为质量监督等提供了技术支持，可广泛应用于皮革包括毛皮等样品基因的提取、皮革品种鉴定等方面，具有良好的经济社会效益与重大的推广应用价值，对于有效监管皮革产品质量，保护广大消费者利益具有重大意义。
图1为本发明实施例1的快速检测皮革真实属性的试剂盒的结构图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来详细说明本实用新型。[0010]实施例1快速检测皮革真实属性的试剂盒请参考图1，所述快速检测皮革真实属性的试剂盒的盒体I内具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位2 (共有4个下凹瓶位)，下凹瓶位2用于放置装有溶液的试剂瓶；所述试剂瓶包括:装有DNA提取缓冲液的试剂瓶，装有Taq DNA聚合酶的试剂瓶，装有PCR反应液的试剂瓶和装有上样缓冲液的试剂瓶。上述试剂盒里的试剂瓶的成分及制备如下:(可供进行50份PCR反应):(I) DNA 提取缓冲液(IOOmL)分别称取2.00mg CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、1.2 Img Tris.HCl (三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、0.58g EDTA2Na(乙二胺四乙酸二钠)和8.18g NaCl于容量瓶中，用水定容至IOOmL,混勻。经过120°C、30min,高温消毒灭菌后,再加入10.0Omg购置的蛋白酶K (购自大连宝生物公司)，15.43g 二硫苏糖醇(DTT)。(2) Taq DNA 聚合酶(25 μ I)购置Taq DNA聚合酶25 μ I共125IU (购自大连宝生物公司)。(3) PCR 反应液(1000 μ I)首先制备引物，制备的引物浓度为100nmol/L。按照本领域常规方法制备引物。在DNA自动合成仪(采用美国ABI公司的ABI3949型全自动DNA合成仪)上按照制造商的说明书进行合成。分别合成如下引物:动物基因成分通用引物，正向:5，-cctgagaaacggctaccat-3’(SEQ ID N0.1)；动物基因成分通用引物，反向:5，-cgtgtcaggattgggtaat-3’(SEQ ID N0.2)；牛线粒体基因的正向引物:5’-gccatatactctccttggtgaca-3’ (SEQ ID N0.3)；牛线粒体基因的反向引物:5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’ (SEQ ID N0.4)；羊线粒体基因的正向引物:5’-tattaggcctcccccttgtt-3’ (SEQ ID N0.5)；羊线粒体基因的反向引物:5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’ (SEQ ID N0.6)；猪线粒体基因的正向引物:5’-atgaaacattggagtagtcctactatttacc-3’ (SEQ IDN0.7)；猪线粒体基因的反向引物:5’-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’(SEQ ID N0.8)；马线粒体基因的正向引物:5’-ccctcaaacatttcatcatgatgaaa_3’(SEQID N0.9)；马线粒体基因的反向引物:5’-gctcctcaaaaggatatttggcctca-3’ (SEQ IDN0.10)；兔内源基因的正向引物:5’-taatcgtcaccgcacatgcc-3，(SEQ ID N0.11)；兔内源基因的反向引物:5，-ctatgtcaggagccccaattatca-3’(SEQ ID N0.12)；称取0.285mg MgCl2,用500 μ L水溶解,经过120°C、30min,高温消毒灭菌后，分别加入0.5 μ mo I的一对引物和0.5mmol的三磷酸脱氧核苷酸，用水定容至1000 μ L。(4)上样缓冲液(100 μ I)分别称取2.5g溴酚蓝、400g蔗糖于容量瓶中，用水定容、混匀。实施例2利用实施例1的试剂盒检测皮革样品中的基因成分检测方法包括以下步骤:(I)样品DNA的制备a皮革样品[0039]剪取50cm2左右的经酒精浸泡消毒后的皮革样品，放入碎皮机中破碎。使用磷酸盐缓冲溶液在不断振荡的条件下浸泡碎皮革样品12小时，期间每隔2小时换一次缓冲溶液，以降低皮革试样中的色素及盐离子如铬离子等的含量。浸泡后将皮革样品再次破碎，取3mL破碎的样品，加入2mL DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65°C放置45 60min，不时摇动，使样品充分裂解。取出，加入ImL饱和氯化钠溶液，剧烈振荡3 5min，置于0°C下放置5 lOmin，离心。取上清，用体积比为25: 24: I的苯酚:氯仿:异戊醇混合液进行提取，离心。取上清，用体积比为24: I的氯仿:异戊醇混合液进行提取，离心。取上清，力口入异丙醇沉淀核酸，-20°C放置2小时，使得异丙醇与核酸充分反应，高速离心，获得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA。为防止提取过程中外源DNA的污染，采用无菌滤纸代替皮革样品作阴性对照，提取方法与皮革样品完全一致。b动物肉类(牛肉、羊肉、猪肉、马肉、兔肉)样品:分别将牛肉、羊肉、猪肉、马肉、兔肉等试验材料，使用经过120°C、30min高压消毒过的固体粉碎机或研钵粉碎制成粉样。分别称取IOOmg研磨粉碎后的样品于离心管中，加入ImL试剂盒中的DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65°C放置60min,不时摇动,使样品充分裂解。用体积比为24: I的氯仿:异戍醇混合液进行提取，小心的混合两相，12000r/min离心5min。将上清液移至
1.5mL离心管中，加入2倍体积预冷的异丙醇,充分混勻，12000r/min离心5min,获得DNA沉淀。再用70 %的乙醇溶液洗沉淀物2次，室温离心12000r/min，5min收集DNA，尽可能除去乙醇。用100 μ I双蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，即得样品DNA，置于-20 V保存。(2)检查DNA的纯度和含量在石英比色皿中加入50 μ I按10倍稀释的DNA样品(5 μ I DNA样品加水45 μ I混匀)，分别测定DNA样品在260nm和280nm处的紫外光吸收值，并计算A26(l/A28(l值。A26tl/A280应介于1.7 1.9之间，低于1.7则表明制备物中存留显著蛋白质，应重新提取DNA ’大于1.9则表明DNA样品中含有RNA，此时应加入RNA酶进行消化。计算DNA浓度:10 X A26tl ( μ g/ μ I)。皮革样品DNA提取结果见表I。表1.皮革样品DNA提取结果
权利要求1.一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征是，包括盒体，盒体内主要有:具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶；所述试剂瓶包括装有DNA提取缓冲液的试剂瓶，装有Taq DNA聚合酶的试剂瓶，装有PCR反应液的试剂瓶和装有上样缓冲液的试剂瓶。
专利摘要本实用新型公开了一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，所述试剂盒包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶；所述试剂瓶包括装有DNA提取缓冲液的试剂瓶，装有Taq DNA聚合酶的试剂瓶，装有PCR反应液的试剂瓶和装有上样缓冲液的试剂瓶。本实用新型从遗传学角度对皮革样品基因成分进行分析鉴别，克服了传统的感官鉴别方法所面临的难题，具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前皮革基因检测方法的空白，为皮革种类的鉴定提供了一种精确且易于标准化的分析方法，为质量监督等提供了技术支持，可广泛应用于皮革包括毛皮等样品基因的提取、皮革品种鉴定等方面，具有良好的经济社会效益与重大的推广应用价值，对于有效监管皮革产品质量，保护广大消费者利益具有重大意义。
文档编号C12Q1/68GK203021563SQ2012204567
公开日2013年6月26日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者罗海英, 柯振华, 吴玉銮, 郭新东, 刘春生, 冼燕萍, 陈筱婷, 陈意光, 罗东辉, 吴文海 申请人:广州市质量监督检测研究院