专利名称：一种猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及猪瘟病毒检测设备领域，更具体地说，特别涉及一种猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒。
背景技术：
猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失。猪瘟病毒(Swinefever virus)是猪瘟的病原，猪瘟病毒是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。潜伏期24-72小时。其病毒粒子呈圆形，大小为38 44nm，核衣壳是立体对称二十面体，氯化铯中浮密度1.15 1.17g/ml，有包膜。目前，现有猪瘟病毒核酸的检测方法有抗体检测和抗原检测。抗体检测往往滞后于抗原检测，从而不能及时准确的快速发现疫病，导致疫病的爆发流行，造成巨大的经济损失；现有抗原检测方法中病毒分离时间长、环境设施要求高，技术水平要求高，而农村及边远地区广大中小养殖户乃至大中型养殖场由于环境设施和人员技术不合要，预警或可疑标本只能送到大型检测中心检测；而且其灵敏度不高；并且存在如何保存RNA不降解，一直是分子生物学领域的难题，迄今没有简便可行的保存方法；传统方法运输和储存这些病毒标本是需要专业的冰冻和运输技术的，这种方法成本高而且需要一定的专业知识，不易推广，从而不能及时和准确地发现疫病。综上所述，如何提高猪瘟病毒监测的便捷性和提取物运输时的安全性，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
实用新型内容本实用新型要解决的技术问题为提供一种猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒，使用该试剂盒提供的903滤纸卡采样、运输和储存方便可行，利用该试剂盒试剂进行一步法CSFV荧光定量PCR检测，操作步骤简单快捷，检测结果灵敏、准确。本实用新型提供了一种猪瘟病毒(即CSFV)血样采集与检测试剂盒，包括:盒体，所述盒体内设置有衬垫，在所述衬垫设置有滤纸槽和多个试剂/物件盛装孔。进一步地，所述滤纸槽内放置有滤纸卡片，所述滤纸卡片上贴覆有903滤纸条。进一步地，所述滤纸卡片上还具有信息记录区，所述903滤纸条上具有多个样品区。进一步地，多个所述试剂/物件盛装孔包括RNA提取液孔、DEPC水孔、酶混合液孔、CSFV检测PCR反应液孔、引物孔、探针孔、CSFV阳性对照孔和CSFV阴性对照孔。酶混合液含:Taq DNA聚合酶，反转录酶；CSFV检测PCR反应液含:d NTP，MgCl2, PCR buffer。进一步地，所述试剂盒还包括盒盖，所述盒盖与所述盒体为相互独立的构件，或者所述盒盖与所述盒体之间通过转动轴连接本实用新型的有益效果是:本实用新型使用903滤纸卡采集储存样品，样品采集简便，由于903滤纸卡是经化学试剂特殊处理的棉纤维卡片，可保护核酸免于酶的损伤，可阻断病毒的受体信号通路以杀灭有害病原体，利于核酸的室温长期稳定保存和运输；利用这种903滤纸卡，解决了 RNA难以保存和运输的难题，使含有RNA样品的903滤纸卡可按普通邮件邮寄到任何一个中心试验室进行检测。采样、运输和储存方便可行，操作步骤简单快捷。使用本实用新型的试剂盒检测猪瘟病毒时将反转录和聚合酶链式反应两步合成一步，免于转管，不仅降低污染风险，而且提高了检测灵敏度，提高了检测速率。整个检测过程，工作人员可以在3小时之内确定禽畜是否被致病病毒感染。这种方法快速、特异，敏感性比常规PCR高100倍以上，微量致病病毒的检测，且大大缩短了检测时间。
为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1为本实用新型实施例的猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒结构示意图；图2为本实用新型实施例的猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒中滤纸卡片的示意图。
具体实施方式
本实用新型的核心为提供一种猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒，使用该试剂盒提供的903滤纸卡采样、运输和储存方便可行，利用该试剂盒试剂进行一步法CSFV荧光定量PCR检测，操作步骤简单快捷，检测结果灵敏、准确。为了使本领域的技术人员更好地理解本实用新型的技术方案，
以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步的详细说明。本实施例提供了一种猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒，请参考图1和图2，该猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒包括:盒体1，该盒体I内设置有衬垫2，衬垫2固定在盒体I内的上部，通过台阶支撑或者螺栓栓固在盒体I的四周上。在衬垫2设置有滤纸槽3和多个试剂/物件盛装孔4。在滤纸槽3内放置有滤纸卡片5，滤纸卡片5是由硬纸片制作而成，在该滤纸卡片5粘贴有滤纸,该滤纸优选为903滤纸条51。该滤纸条51是采用英国Whatman生产的58cmX58cm 903滤纸,经无菌裁剪后，自制加工而成的一种棉纤维滤纸。多个试剂/物件盛装孔4用于盛装采集到的样本或者对照试条等。优选地，该滤纸卡片5上还具有信息记录区52，并且，在903滤纸条51上分设有多个样品区53。设置在衬垫2上的多个试剂/物件盛装孔4包括RNA提取液孔41、DEPC水孔42、酶混合液孔43、CSFV检测PCR反应液孔44、引物孔45、探针孔46、CSFV阳性对照孔47和CSFV阴性对照孔48，每个盛装孔对应着放置这些试剂瓶或者对照纸片。该试剂盒还包括盒盖6，盒盖6与盒体I为相互独立的构件，或者盒盖6与盒体I之间通过转动轴连接。[0022]使用本猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒检测猪瘟病毒时，具体的方法是:一、样品采集和处理1、点样:从猪耳静脉采集静脉血，移液枪吸取100 μ I血液，以同心圆周动作把血液滴加在903滤纸卡片的划线圆圈内。使样品在室温下干燥大约I小时。把样品放入干净的保护袋储存在阴凉、干燥的环境中，室温放置0-10天。2、取样:用打孔器将903滤纸卡样品区整个样品盘打下，把盘放入PCR扩增管中。3、孵育:加入400yL RNA处理缓冲液(IOmM三羟甲基氨基甲烷-HCl，pH 8.0，
0.1mM EDTA, 200 μ g/mL糖原和2mM 二硫苏糖醇)，并上下吹打两次。盖上盖子并在冰上孵育15分钟，每5分钟混合一次。4、纯化:加入40ul 3M的乙酸钠(pH5.2)和400 μ I冰预冷的异丙醇从洗涤溶液中沉淀RNA ;在-20°C下孵育I小时。把管放置在微量离心管内，12，000转/分离心5分钟；去除上清液。用冰预冷的75%乙醇洗涤沉淀颗粒，12，OOOx g(转/分)离心5分钟。去除上清液；干燥，把沉淀重悬在15-50 μ I三羟甲基氨基甲烷-EDTAE中。5、取5 μ I样品到45 μ I无菌水中10倍稀释，以此类推做4个稀释度。二、测量1、配制一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；25μ I或50μ I的三羟甲基氨基甲烷-HCl (ρΗ7.8-9.0)，上下游引物各0.1-0.5 μ Μ，脱氧核苷酸混合物各100-400 μ Μ，探针0.1-0.5 μ Μ，莫洛尼小鼠白血病病毒反转录酶100-300U，热稳定性的DNA1-5U, Mg2+-4-8M，均一化参比染料 R0X300_500nM，总 RNAlpg-1 μ g ；2、在实时荧光PCR检测仪ABI 7300上机检测，设置反应程序:
权利要求1.一种猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒，包括:盒体(I)，其特征在于，所述盒体(I)内设置有衬垫(2)，在所述衬垫(2)设置有滤纸槽(3)和多个试剂/物件盛装孔(4)。
2.根据权利要求1所述的猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒，其特征在于，所述滤纸槽(3)内放置有滤纸卡片(5)，所述滤纸卡片(5)上贴覆有903滤纸条(51)。
3.根据权利要求2所述的猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒，其特征在于，所述滤纸卡片(5)上还具有信息记录区(52)，所述903滤纸条(51)上具有多个样品区(53)。
4.根据权利要求1所述的猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒，其特征在于，多个所述试剂/物件盛装孔(4)包括RNA提取液孔(41) ,DEPC水孔(42)、酶混合液孔(43) ,CSFV检测PCR反应液孔(44)、引物孔(45)、探针孔(46)、CSFV阳性对照孔(47)和CSFV阴性对照孔(48)。
5.根据权利要求1所述的猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括盒盖￠)，所述盒盖(6)与所述盒体(I)为相互独立的构件，或者所述盒盖(6)与所述盒体(I)之间通 过转动轴连接。
专利摘要本实用新型公开了一种猪瘟病毒(CSFV)血样采集与检测试剂盒，包括盒体(1)，所述盒体(1)内设置有衬垫(2)，在所述衬垫(2)设置有滤纸槽(3)和多个试剂/物件盛装孔(4)。使用该试剂盒提供的903滤纸卡采样、运输和储存方便可行，利用该试剂盒试剂进行一步法CSFV荧光定量PCR检测，操作步骤简单快捷，检测结果灵敏、准确。
文档编号C12R1/93GK202925021SQ20122051559
公开日2013年5月8日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年10月9日
发明者刘敬, 王睿, 罗俊彩 申请人:湖南农安生物技术有限公司