专利名称：先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型提供了一种先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
RSl基因包含有6个外显子，编码一段有224个氨基酸的蛋白质，前23个氨基酸为分泌引导肽，介导蛋白质的输出。RSl基因转录产物仅在视网膜表达，有细胞特异性，其功能可能与视网膜细胞的粘着及细胞间信号的传递有关。Sauer等证实RSl基因为先天性视网膜劈裂症的致病基因。先天性视网膜劈裂症是引起男性青少年黄斑变性的最主要原因，呈X连锁隐性遗传。本病以内层视网膜裂开致黄斑区微囊样车轮状改变为特征，约50%的病例同时伴有周边部视网膜劈裂及视野缺损。先天性视网膜劈裂症具有明显家族性发病特点，男性发病，女性携带者无临床症状。导致先天性视网膜劈裂症的原因是先天性视网膜劈裂基因RSl基因突变。因此，基因突变的筛查与检测对于疾病的早期诊断、遗传咨询、发病机制研究均具有十分重要的意义。本实用新型将样本采集、先天性视网膜劈裂症致病基因突变体检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。本实用新型基于直接测序技术，可以对PCR产物直接进行DNA序列分析，明确突变位点，是现有基因突变检测方法中最直接最准确的方法，且可以实现机械化自动化，使测序工作更加简便快捷，结果判读更直观落。
发明内容本实用新型的目的是提供一种先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测试剂盒。为实现以上目的，本实用新型提供了一种先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体，包装盒体内的中间设有口腔拭子，口腔拭子的一侧设有样本保存管和含有PCR扩增试剂的试管，另一侧设有含有PCR产物纯化试剂的试管和含DNA测序试剂的试管。本实用新型将样本采集、先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。本实用新型基于直接测序技术，可以对PCR产物直接进行DNA序列分析，明确突变位点，是现有基因突变检测方法中最直接最准确的方法，且可以实现机械化自动化，使测序工作更加简便快捷，结果判读更直观。
图1为本实用新型提供的一种先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测试剂盒结构示意图。
具体实施方式
[0009]为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例如图1所示，为本实用新型提供的一种先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测试剂盒的结构示意图，包括带盒盖的包装盒体1，包装盒体I内的中间设有口腔拭子2，口腔拭子2的一侧设有样本保存管3和含有PCR扩增试剂的试管4，另一侧设有含有PCR产物纯化试剂的试管5和含DNA测序试剂的试管6。测试步骤如下:步骤1:采集检测样品用口腔拭子2在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次，保证采集到足量的细胞样本，采集完毕，样本保存于样本保存管3中。步骤2:采用硅胶吸附法抽提样本的基因组DNA。步骤3:PCR扩增PCR 扩增试剂(总体积为 Iml)的成分包含:20mM Tris-HCL (PH8.0)UOOmM KCL、500uM dNTPs、3mM MgCl2 溶液、0.1U Taq DNA 聚合酶/ul。第I外显子正向和反向引物:正向引物:ggctcagccaaagacctaag反向引物:aactggaaagccatccacac第2外显子正向和反向引物:正向引物:tccagaaggggtgttggtag反向引物:tggagacagggtttcaccat第3外显子正向和反向引物:正向引物:tgaggctggattaatagctcaa反向引物:taaagatgggggtagcgttc第4外显子正向和反向引物:正向引物:gcaaagcagatgggtttgtt反向引物:ccaccacgccagttaatttt第5外显子正向和反向引物:正向引物:gtctctcggtgactcggtatg反向引物:gcagatgatccactgtgctg第6外显子正向和反向引物:正向引物:gggctagctccagaaaggaa反向引物:acccagcactgcagttacaa然后在ABI9700型PCR扩增仪上进行，分为6个反应孔，每个反应孔放入上述6对RS引物，每对正反向引物各0.5ul (引物浓度为lOumol/L)，各加入检测样品2ul，PCR反应液7.5ul，去离子水4.5ul，反应孔总体积15ul。反应条件为95°C预热10分钟；再进行35个循环的95°C、45秒，60°C、45秒，72°C、60秒；72°C、7分钟后，降温至4°C。步骤4 =PCR产物纯化[0038]每一个反应孔反应体系总体积为7ul，由PCR产物纯化试剂4ul和PCR产物3ul组成。反应条件为:37°C、60分钟；80°C、15分钟。步骤5 =DNA测序反应每一个反应孔反应体系总体积为5ul，由PCR纯化产物Iul、DNA测序试剂Iul、测序引物Iul和去离子水2ul组成。反应条件为:96°C 2分钟；25个循环的96°C、10秒；50°C、5 秒；60°C、4 分钟；60°C、4 分钟。反应结束后每管加入Iul 125mM乙二胺四乙酸EDTA和无水乙醇15ul，室温沉淀15分钟；3650转/分，4°C离心30分钟，轻轻倒去上清液；每孔加30ul 70%乙醇，3650转/分，4°C离心15分钟，倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8ul，上测序仪。步骤4:结果分析在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果。1.未检出突变:未发现RSl基因存在突变；2.检出突变:发现RSl基因第6外显子上存在突变。
权利要求1.先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体(I)，包装盒体(I)内的中间设有口腔拭子(2 )，口腔拭子(2 )的一侧设有样本保存管(3 )和含有PCR扩增试剂的试管(4)，另一侧设有含有PCR产物纯化试剂的试管(5)和含DNA测序试剂的试管(6)。
专利摘要本实用新型公开了一种先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体，包装盒体内的中间设有口腔拭子，口腔拭子的一侧设有样本保存管和含有PCR扩增试剂的试管，另一侧设有含有PCR产物纯化试剂的试管和含DNA测序试剂的试管。本实用新型将样本采集、先天性视网膜劈裂症致病基因突变检测位点整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。
文档编号C12M1/34GK203021564SQ20122073898
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者乐涵骏, 张奕, 傅咏南 申请人:上海中优医药高科技有限公司