生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法

生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法
【专利摘要】在一个方面，本发明提供了一种生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法，所述方法包括所述重组酶在真核宿主细胞中的细胞内表达的步骤。
【专利说明】生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及能够水解叶绿素和叶绿素衍生物的酶的生产。
【背景技术】
[0002]叶绿素是一种绿色色素，其广泛发现于整个植物界，多存在于藻类和蓝藻细菌中。叶绿素是光合作用所必需的，并且是地球上发现的最丰富的有机金属化合物之一。因而许多来自植物的产品(包括食物和饲料)含有相当多的叶绿素。
[0003]例如，得自含油种子(例如大豆、棕榈种子或油菜籽(卡诺拉油菜)、棉籽、葵花籽、葡萄籽和花生)的植物油通常含有一些叶绿素。然而，通常不期望植物油中存在高含量的叶绿素色素。这是因为叶绿素使油带上难看的绿色，并且在储存期间可引起油的氧化，从而导致油的变质。 [0004]已采用各种方法以除去植物油中的叶绿素。在产油过程的多个阶段，包括种子破碎、油萃取、脱胶、碱处理和漂白步骤，都可除去叶绿素。然而，漂白步骤通常对于将叶绿素残留量降至可接受含量是最为有效的。在漂白期间，加热油并使其通过吸附剂以除去叶绿素和影响成品油外观和/或稳定性的其他有色化合物。用于漂白步骤的吸附剂通常为粘土。
[0005]在可食用油加工行业中，采用上述步骤通常会将加工油中的叶绿素含量降至介于0.02至0.05--111之间。然而，漂白步骤由于漂白粘土的夹带作用会增加加工成本和降低油产量。粘土的使用可能会将许多有用的化合物(例如类胡萝卜素和生育酚)也从油中除去。另外粘土的使用也很昂贵，这尤其是因为用过的粘土(即废料)的处理困难、危险(易于自燃)，因而处理成本高。因而已进行了用其他办法从油中除去叶绿素的尝试，例如使用叶绿素酶。
[0006]在植物中，叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)被认为参与叶绿素降解，并催化叶绿素中酯键的水解而生成脱植基叶绿素和叶绿醇。WO 2006009676描述了可降低组合物中叶绿素污染的一种工业方法，例如用叶绿素酶处理植物油。此方法中产生的水溶性脱植基叶绿素也是绿色，但是可通过水萃取法或二氧化硅处理除去。
[0007]叶绿素通常在用于产油的种子中以及从种子提取油的过程中部分降解。一种常见的修饰为卟啉(二氢卟酚)环失去镁离子形成称为脱镁叶绿素的衍生物(参见图1)。卟啉环上高极性镁离子的丢失导致脱镁叶绿素与叶绿素相比在理化性质上显著不同。通常在加工过程中，油中的脱镁叶绿素比叶绿素含量更丰富。脱镁叶绿素呈淡绿色，可通过与用于叶绿素类似的方法从油中除去，例如WO 2006009676中所述通过由具有脱镁叶绿素酶活性的酶催化的酯酶反应。在某些条件下，一些叶绿素酶能够水解脱镁叶绿素以及叶绿素，因此适于除去这两种污染物。脱镁叶绿素水解的产物为红色/褐色的脱镁叶绿酸和叶绿醇。脱镁叶绿酸也可由脱植基叶绿素(即叶绿素水解之后)失去镁离子生成(参见图1)。WO2006009676教导了通过与脱植基叶绿素类似的方法(例如通过水萃取法或二氧化硅吸附)除去脱镁叶绿酸。[0008]脱镁叶绿素还可通过含油种子收获和储存期间植物酶的活性或者通过精制油期间的加工条件(即热)进一步降解为焦脱镁叶绿素(参见“Behaviour of ChlorophyllDerivatives in Canola Oil Processing，，，JAOCS, Vol, n0.9 (Sept.1993) pages837-841 ( “卡诺拉油加工过程中叶绿素衍生物的行为”，《美国油脂化学协会杂志》，第9卷，1993年9月，第837-841页))。一种可能的机制是脱镁叶绿素碳环上甲酯键的酶水解，然后不稳定中间体向焦脱镁叶绿素的非酶转化。据报道来自藜(Chenopodium album)的名为脱镁叶绿酸酶的28-29kDa酶能够催化脱镁叶绿酸上类似的反应，以产生不含叶绿醇的焦脱镁叶绿素衍生物，称为焦脱镁叶绿酸(参见图1)。焦脱镁叶绿酸比脱镁叶绿酸极性低，导致焦脱镁叶绿酸与脱镁叶绿酸相比具有降低了的水溶解度和增加了的油溶解度。
[0009]取决于加工条件，在加工期间植物油中焦脱镁叶绿素可比脱镁叶绿素和叶绿素含量都更为丰富(参见表9中的Bailey’s工业用油和脂肪产品(2005年)的2.2卷，第6版，Fereidoon Shahid1、John Wiley和Sons编辑)。这部分地是由于在植物材料的收获和储存期间叶绿素中镁的丢失。如果使用90°C或更高温度下的长时间热处理，油中焦脱镁叶绿素的量可能会增加并且可能高于脱镁叶绿素的量。也可通过在压榨和萃取之前加热含油种子以及精制过程中油脱胶和碱处理降低叶绿素含量。还观察到油中的磷脂可与镁络合，从而降低叶绿素的量。因而在许多植物油中与焦脱镁叶绿素(和脱镁叶绿素)相比，叶绿素为相对少量的污染物。
[0010]因而需要大规模生产叶绿素酶和相关酶，特别是用于炼油的方法。来自普通小麦(Triticum aestivum)(小麦(wheat))的叶绿素酶已在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组地表达，如在 Arkus et al (2005), Arch.Biochem.Biophys 438:146-155 (Arkus 等人，2005年，《生物化学与生物物理学集刊》，第438卷，第146-155页)中所述。然而，通过此细菌表达方法获得的重组叶绿素酶的产率较低，通常为大约每升几毫克。
[0011]仍然需要一种用于生产叶绿素酶和相关酶，特别是用于适合在植物油精炼中使用的酶的快速大规模表达的改进的方法。

【发明内容】

[0012]在一个方面，本发明提供了一种优选以高收率生产能够水解叶绿素或一种或多种叶绿素衍生物的重组酶的方法，其包括在宿主细胞(例如，微生物和/或真核宿主细胞)中进行细胞内表达重组酶的步骤。所述宿主细胞通常为真核生物，包括酵母，例如，酵母属(Saccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp)、汉逊酵母属(Hansenula)和丝状真菌，例如曲霉菌属(Aspergillus sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)以及金孢子菌属(Chrysosporium)。
[0013]在一个实施例中，所述宿主细胞为真菌细胞，例如木霉属(Trichoderma)、曲霉菌属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、酵母属、镰刀菌属。优选宿主细胞来自木霉属，例如，里氏木霉(Trichoderma reesei)。
[0014]在具体的实施例中，该重组酶具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性，例如，叶绿素酶活性。
[0015]重组酶可包括选自GHSXGG(SEQ ID NO:36)、DPVXG(SEQ ID NO:37)和 YGHXD (SEQID NO:38)的一种、两种或二种氣基酸序列。[0016]在一些实施例中，编码重组酶的基因来自植物，例如，拟南芥(Arabidopsisthaliana)、甘蓝(Brassica oleracea)、蓖麻(Ricinus communis)> 银杏(Ginkgobiloba)、毛果杨(Populus trichocarpa)、葡萄(Vitis vinifera)、毛竹(Phyllostachysheterocycla)、高梁(Sorghum bicolor)、槽豆(Glycine max)、发财树(Pachiramacrocarpa)、普通小麦(Triticum aestivum)、舌甘澄(Citrus sinensis)、玉米(Zeamays)、藜(Chenopodium album)、北美云杉(Picea sitchensis)或藻类，例如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
[0017]该重组酶优选包含如在SEQ ID NO:1至18的任意一个中所定义的多肽序列，或其功能性片段或变体。所谓“功能性片段或变体”意指为功能性酶(例如，具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的酶)的片段或变体。通常，功能性片段或变体在至少50个氨基酸残基上与SEQ ID NO:1至18的任意一个具有至少75%的序列同一性。
[0018]该重组酶优选由如在SEQ ID NO:19至35的任意一个中所定义的核酸序列、或其功能性片段或变体编码。所谓“功能性片段或变体”通常指编码功能性酶(例如，具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的酶)的片段或变体。通常，功能性片段或变体在至少50个核苷酸残基上与SEQ ID NO: 19至35的任意一个具有至少75%的序列同一性。
[0019]在一个实施例中，该方法还包括裂解所述宿主细胞并且从裂解物中回收所述重组酶。优选使用洗涤剂裂解宿主细胞。优选地，洗涤剂处理与热处理相结合以选择性地回收重组酶。在可供选择的实施例中，宿主细胞用有机酸处理以便例如杀灭该细胞。优选将有机酸处理与热处理步骤相结合。在另一个实施例中，通过均化任选结合洗涤剂、有机酸或热处理步骤裂解宿主细胞。
[0020]在另一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含编码能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶的核酸序列，所述序列可操作地连接到适于引导酶在宿主细胞(例如，微生物和/或真核宿主细胞)中的·细胞内表达的一个或多个控制序列。优选该表达载体适于在真核宿主细胞中表达酶。
[0021]优选该表达载体包含如在SEQ ID NO:19至34的任意一个中所定义的核酸序列或其功能性片段或变体，所述功能性片段或变体在至少50个核苷酸残基上与SEQ ID NO:19至35的任意一个具有至少75%的序列同一'丨生。
[0022]在另一个方面，本发明提供了一种(例如，微生物的和/或真核的)宿主细胞，其包含如上所定义的表达载体。优选该宿主细胞为真菌细胞。
[0023]在另一个方面，本发明提供了一种能够水解叶绿素或一种或多种叶绿素衍生物的重组酶，其可通过如上所定义的方法，例如通过将含有如上所定义的所关注的叶绿素酶基因的表达载体引入(例如，微生物的和/或真核的)宿主细胞中而获得。
[0024]优选该重组酶包含如在SEQ ID NO:1至18的任意一个中所定义的多肽序列或其功能性片段或变体，所述功能性片段或变体在至少50个氨基酸残基上与SEQ ID N0:1至18的任意一个具有至少75%的序列同一'丨生。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1示出涉及本发明中所生产的叶绿素和衍生物以及酶的各反应。[0026]图2A示出了基于与AtCLH2和其他已知的和推定的叶绿素酶的蛋白质序列相似性的树状图。来自单子叶植物(禾本类，例如小麦、竹子、高粱、玉米)的叶绿素酶聚集在一起，而2个甘蓝(Brassica oleracea)叶绿素酶在两个分开的聚类中。
[0027]图2B示出了来自多种叶绿素酶的氨基酸序列的比对。保守催化残基(Ser-His-Asp)由.表示。活性位点残基、天冬氨酸和组氨酸周围的保守基序是叶绿素酶独有的。含有活性位点丝氨酸的第一基序GHSXGG对于诸如脂肪酶的其他酯酶是通用的。
[0028]图3示出了用于在真菌细胞(木霉属)中生产小麦叶绿素酶的表达构建体。强效的Cbhl启动子用于驱动具有和不具有不同的信号肽的叶绿素酶的表达。
[0029]图4示出了用于普通小麦叶绿素酶表达的真菌菌株(1-12)的筛选。来自不同转化体的胞内细胞抽提物的SDS-PAGE显示不同表达水平的34kDa重组小麦叶绿素酶(箭头)。C=作为对照的未转化菌株。
[0030]图5示出了重组小麦叶绿素酶(核心)的细胞外积聚。SDS-PAGE示出了随着发酵时间而增加的叶绿素酶的细胞外沉积。
[0031]图6示出了重组小麦叶绿素酶的细胞内积聚，其在69小时处显示出蛋白质产量峰值。
[0032]图7示出了用于生产竹子叶绿素酶的表达构建体，并且SDS-PAGE示出了生产重组蛋白的不同转化体。菌株3、5、6、11、12、13、14、15、16、17和18示出了与针对小麦叶绿素酶的抗体交叉反应的条带。
[0033]图8示出了用于转化真菌细胞的表达构建体。这些构建体含有编码来自芸苔属植物、蓖麻籽和橹豆的叶绿素酶的合成基因。
[0034]图9示出了表达来自芸苔属植物(1-6)、蓖麻籽(7-14)和橹豆(15_23)的叶绿素酶的菌株的筛选。不同的转化体显示不同水平的重组蛋白。针对小麦叶绿素酶的抗体用于确定来自其他植物的叶绿素酶。
[0035]图10示出了含有编码来自发财树和杨树的叶绿素酶的合成基因的构建体。与针对杨树叶绿素酶表达菌株33-40的较高水平表达相比，转化体#24-32显示针对发财树叶绿素酶的低表达水平。
[0036]图11示出了具有针对来自葡萄的叶绿素酶基因的可检测表达水平的菌株41-49。
[0037]图12-29示出了用于在里氏木霉中表达的叶绿素酶氨基酸序列。删除加下划线的氨基酸序列以生产蛋白质的截短形式。
[0038]图30-46示出了采用优化用于在真菌生产宿主中表达的密码子编码叶绿素酶的合成基因序列。
【具体实施方式】
[0039]在一个方面，本发明涉及酶(诸如，在微生物和/或真核细胞中的叶绿素酶)的细胞内表达。已惊奇地发现例如与已知的原核(细菌)表达方法相比，在诸如真菌的真核生物中的细胞内表达迅速导致活性酶的高收率。具体地讲，已表明在诸如真菌的真核生物中，细胞内表达较快并且得到比分泌到细胞外介质中更高的酶收率。
[0040]真菌细胞膜由厚的、坚韧的和刚性的细胞壁围绕，所述细胞壁可阻止细胞内重组产物的提取。细胞壁由围绕细胞质膜的不同聚合物(甲壳质、葡聚糖和甘露糖蛋白)组成。可认为提取技术涉及苛刻的条件，其可能潜在地损坏所需的重组产物(减少其功能性)或减少重组蛋白的回收率和收率(在使用所需重组产物过程中减少工业效率和提高成本)。此外，诸如细胞壁酶解的一些提取方法可能被认为是昂贵的，而诸如珠子击打和搅拌的物理破裂可引起发泡和样品发热。声波降解法由于噪音、样品发热和自由基的形成损坏所关注的蛋白质而被认为是次佳的。
[0041]如果重组蛋白在宿主细胞中表达之后被分泌，则无需细胞裂解并且可直接从培养基回收酶。由于这些原因，分泌性表达通常被认为是生产在诸如真菌的微生物中的重组蛋白的优选的方法。相比之下，本发明惊人地证实了可使用在诸如真菌的真核生物中的细胞内表达迅速和高收率地生产重组叶绿素酶，并且使用简单和直接的方法可容易地从细胞回收完全功能性的酶。
[0042]在一个方面，本发明涉及一种生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法。
[0043]叶緑素和叶緑素衍牛物
[0044]所谓“叶绿素衍生物”通常是指包含卟啉(二氢卟酚)环和叶绿醇基团(尾)的化合物，包括不含镁含叶绿醇的衍生物，诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。叶绿素和(含叶绿醇的)叶绿素衍生物通常为绿色，这是因为分子中存在卟啉(二氢卟酹)环。镁从卟啉环的丢失意味着脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素颜色上比叶绿素更呈现出偏褐色。
[0045]以本发明方法生产的酶可水解叶绿素和含叶绿醇的叶绿素衍生物以从二氢卟酚环裂解叶绿醇尾部。叶绿素和叶绿素衍生物的水解通常得到诸如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的化合物，它们是不含叶绿醇的叶绿素衍生物。这些化合物仍包含有色卟啉环，脱植基叶绿素呈绿色而脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸则呈红棕色。
[0046]叶绿素或叶绿素衍生物可为a或b形式。因而如本文所用，术语“叶绿素”包括叶绿素a和叶绿素b。类似地,当提及脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸时，兼指a和b形式。
[0047]能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶
[0048]本发明的方法生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶。通常水解叶绿素或叶绿素衍生物”是指水解叶绿素或(含叶绿醇)叶绿素衍生物中的酯键，例如从叶绿素或叶绿素衍生物中的二氢卟酚环上裂解叶绿醇基团。因此该酶通常具有酯酶或水解酶活性。优选地该酶在油相中并且任选地在水相中也具有酯酶或水解酶活性。
[0049]因而该酶可为，例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶。优选地，该酶能够水解叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素中的至少一种、至少两种或全部三种。在一个特别优选的实施例中，该酶具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性。
[0050]以此方法生产的酶可以是具有可水解叶绿素或叶绿素衍生物的活性的任何多肽。所谓“酶”旨在涵盖对叶绿素或叶绿素衍生物具有水解活性的任何多肽，包括例如酶片段
坐寸ο [0051]酶(叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶)活性测定
[0052]可使用任何合适的检测分析技术，例如基于本文所述的检测分析法，检测叶绿素或叶绿素衍生物的水解活性。例如，可使用基于荧光的技术检测水解活性。在一个合适的检测分析中，将要检测其叶绿素或叶绿素衍生物水解活性的多肽在存在底物的情况下温育，并且通过荧光测量法监测产物或底物含量。合适的底物包括例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素。可检测的产物包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸和/或叶绿醇。
[0053]检测叶绿素或叶绿素衍生物水解的检测分析方法公开在例如Ali Khamessanet al.(1994), Journal of Chemical Technology and Biotechnology,60 (I), pages73-81 (Ali Khamessan等人，1994年，《化学技术与生物技术杂志》，第60卷，第I期，第73-81页)；Klein and Vishniac (1961), J.Biol.Chem.236:2544-2547 (Klein 和 Vishniac，1961年，《生物化学杂志》，第236卷，第2544-2547页);以及Kiani et al.(2006), AnalyticalBiochemistry 353:93-98 (Kiani等人，2006年，《分析生物化学》，第353卷，第93-98页)。
[0054]作为另外一种选择，合适的检测分析可在加入推定的酶后基于底物或产物含量的HPLC检测和定量，例如基于如下所述的技术。在一个实施例中，检测分析可按 Homero-Mendez et al.(2005), Food Research International 38(8-9):1067-1072 (Hornero-Mendez等人，2005年，《国际食品研究》，第38卷，第8_9期，第1067-1072页)中所述进行。在另一个实施例中，可使用以下检测分析法:
[0055]向pH 7.0的170 μ I mM HEPES中添加溶解于丙酮的20 μ I 0.3mM叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。将酶溶解于PH 7.0的50mM HEPES中。将10 μ I酶溶液添加到190 μ I底物溶液以引发反应，并在40°C下温育不同时间。通过添加350 μ I丙酮终止反应。离心(在18，OOOg下离心2min)后，通过HPLC分析上清液，并确定(i)叶绿素和脱植基叶绿素(ii)脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸或者(iii)焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸的量。
[0056]一单位酶活性定义为例如采用本文所述的检测分析方法，在40°C下每分钟水解一微摩尔底物(例如叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)的酶的量。
[0057]在一些优选的实施·例中，本发明方法中生产的酶按例如通过本文所述检测分析方法确定的，基于每克纯化酶的活性单位计，具有至少1000U/g、至少5000U/g、至少10000U/g或者至少50000U/g的叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性。
[0058]在一个另外的实施例中，对叶绿素或叶绿素衍生物的水解活性可以使用EP10159327.5中描述的方法确定。
[0059]叶緑素酶
[0060]在一个实施例中，该酶至少能够水解叶绿素。任何能催化叶绿素酯键水解以生成脱植基叶绿素和叶绿醇的多肽都可于该方法中生产。例如，可生产叶绿素酶(chlorophyllase)、叶绿素酶(chlase)或叶绿素脱植基叶绿素水解酶或具有相似活性的多肽(例如，叶绿素-脱植基叶绿素水解酶I或叶绿素酶I (chlase I),或者叶绿素-脱植基叶绿素水解酶2或叶绿素酶2 (chlase 2)，分别参见例如NCBI P59677-1和P59678)。
[0061]在一个实施例中，该酶在酶命名分类(E.C.3.1.1.14)中分类为叶绿素酶。在一个方面，叶绿素酶可为如WO 0229022或WO 2006009676中所述的酶。例如，拟南芥叶绿素酶可按例如NCBI条目匪123753中所述使用。在另一个实施例中，叶绿素酶来自藻类，例如来自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)。
[0062]在另一个实施例中，叶绿素酶来自小麦,例如来自小麦属(Triticum spp.),尤其是来自小麦。在另一个实施例中，叶绿素酶来自衣藻属(Chlamydomonas spp.),尤其是来自莱茵衣藻。[0063]脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶
[0064]在一个实施例中，该酶能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。例如，该酶可为脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)，例如在Schelbert et al.，The PlantCell 21:767-785(2009) (Schelbert 等人，《植物细胞》，第 21 期，第 767-785 页，2009 年)中所述的酶。
[0065]除脱镁叶绿素之外，PPH和相关酶也能够水解焦脱镁叶绿素。然而，PPH对叶绿素是惰性的。如在Schelbert等人的文献中所述，PPH直系同源基因通常存在于真核光合作用生物体。PPH代表在系统发生上区别于叶绿素酶定义的α/β水解酶亚族，这两个族在序列同源性和底物上是不同的。
[0066]在本发明的具体实施例中，该酶可为来自任何物种的任何已知PPH或它们的功能性变体或片段，或可衍生自任何已知的PPH酶。例如，在一个实施例中，酶可以是来自拟南芥的ΡΡΗ(参见图8，NCBI登录号NP_196884、GenBank ID N0.15240707)，或其功能性变体或片段。
[0067]在另一些实施例中，该酶可为来自以下任何一种物种的PPH:拟南芥、毛果杨、葡萄、水稻(Oryza sativa)、玉米、烟草、团藻(Ostreococcus Iucimarinus)、青绿藻(Ostreococcus taurii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、三角褐指藻、莱茵衣藻或微单胞菌属(MiCTomonas sp.) RCC299。例如，该酶可为包含氨基酸序列的多肽，或由核苷酸序列编码的多肽(在表1中所示的以下数据库条目之一中定义)，或者它们的功能性片段或变体:
[0068]表1
[0069]
【权利要求】
1.一种生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法，其包括所述重组酶在真核宿主细胞中的细胞内表达的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞为真菌细胞。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述宿主细胞来自木霉属(Trichoderma)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶为叶绿素酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶包括选自GHSXGG(SEQID NO:36)、DPVXG (SEQ ID NO:37)和 YGHXD (SEQ ID NO:38)的一个或多个氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)、甘蓝(Brassica oleracea)、蓖麻(Ricinus communis)> 银杏(Ginkgobiloba)、毛果杨(Populus trichocarpa)、葡萄(Vitis vinifera)、毛竹(Phyllostachysheterocycla)、高梁(Sorghum bicolor)、槽豆(Glycine max)、发财树(Pachiramacrocarpa)、普通小麦(Triticum aestivum)、舌甘澄(Citrus sinensis)、玉米(Zea mays)、藜(Chenopodium album)、北美云杉(Picea sitchensis)或莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶包含如在SEQID N0:1至18的任意一个中所定义的多肽序列或其功能性片段或变体，所述其功能性片段或变体在至少50个氨基酸残基上与SEQ ID NO:1至18的任意一个具有至少75%的序列同一性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶由在SEQID N0:19至35的任意一个中所定义的核酸序列或其功能性片段或变体编码，所述其功能性片段或变体在至少50个核苷酸残基上与SEQ ID NO: 19至35的任意一个具有至少75%的序列同一性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括裂解所述宿主细胞和从所述裂解物回收所述重组酶。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述宿主细胞暴露于洗涤剂、有机酸、均化和/或热处理。
11.一种真核表达载体，包含编码能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶的核酸序列，所述序列可操作地连接到适于引导所述酶在真核宿主细胞中的细胞内表达的一个或多个控制序列。
12.根据权利要求10所述的表达载体，包含如在SEQID NO: 19至35的任意一个中所定义的核酸序列或其功能性片段或变体，所述其功能性片段或变体在至少50个核苷酸残基上与SEQ ID NO: 19至35的任意一个具有至少75%的序列同一性。
13.—种真核宿主细胞，包含如权利要求10或权利要求11所述的表达载体。
14.根据权利要求12所述的宿主细胞，其为真菌细胞。
15.一种能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶，其通过如权利要求1至9中任一项所述的方法获得。
16.根据权利要求14所述的重组酶，其中所述重组酶包含如在SEQID NO:1至18的任意一个中所定义的多肽序列或其功能性片段或变体，所述其功能性片段或变体在至少50个氨基酸残基上与SEQ ID NO:1 至18的任意一个具有至少75%的序列同一性。
【文档编号】C12R1/885GK103797114SQ201280010050
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年2月16日 优先权日:2011年2月23日
【发明者】S.M.马德赫 申请人:杜邦营养生物科学有限公司