与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂相关的标志物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了在用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）治疗的患者中监测药效（PD）标志物的差别基因表达的方法、通过测量PD标志物测定细胞对CDKI的敏感性的方法，以及筛选候选CKDI的方法。
【专利说明】与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂相关的标志物
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物基因组学领域，以及药效标志物的用途，所述药效标志物用于以下患者对治疗的应答、癌症敏感性和化合物筛选。
【背景技术】
[0002]蛋白激酶构成了在结构上相关的负责控制细胞内多种信号转导过程的酶的大家族。(Hardie,G.和 Hanks, S.The Protein Kinase Facts Book, I 和 II, Academic Press,San Diego, CA:1995)。可以通过激酶磷酸化的底物，将它们分类至家族(例如，蛋白-酪氨酸、蛋白丝氨酸/苏氨酸、脂类等)。
[0003]许多疾病都与蛋白激酶介导的上述事件所引发的异常细胞应答相关。这些疾病包括但不限于，自身免疫疾病、炎性疾病、骨病、代谢疾病、神经系统疾病和神经变性疾病、癌症、心血管疾病、过敏反应和哮喘、阿尔茨海默病、病毒性疾病和激素相关的疾病。例如，已经成功地将Gleevec (酪氨酸激酶抑制剂)用于慢性髓性白血病和胃肠间质瘤的治疗。
[0004]细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合体是一类目标靶激酶。CDK参与细胞周期进程和细胞转录，并且生长控制的丧失与疾病中异常的细胞增殖相联系(Malumbres和Barbacid, Nat.Rev.Cancer2001,1:222)。已经显示，细胞周期蛋白依赖性激酶的活性的增加或者暂时地异常激活会导致人类肿瘤的发展(Sherr C.J.，Sciencel996，274:1672-1677)。事实上，人类肿瘤的发展通常与⑶K蛋白自身或其调节子的改变相关(Cordon-Cardo C.，Am.J.Pathol.1995 ； 147 (3):545-560 ；Karp J.E.和 Broder S.，Nat.Med.1995；1:309-320 ；Hall M.，Adv.Cancer Res.1996 ；68:67_108)。
[0005]⑶K7和⑶K9分别在转录起始和延伸中发挥关键作用(参见例如，Peterlin和Price2006, Cell23:297-305, Shapir0.J.，Clin.0ncol.2006 ；24:1770-83)。通过下调抗凋亡蛋白如MCLl的转录，CDK9的抑制与直接诱导造血谱系的肿瘤细胞的凋亡相联系(Chao S.-H.，J.Biol.Chem.2000 ；275:28345-28348 ；Chao, S.-H.，J.Biol.Chem.2001 ；276:31793-31799 ；Lam, Genome Biology20012:1-11 ；Chen, Blood2005 ； 106:2513 ；MacCallum,Cancer Res.2005 ；65:5399 jPAlvi，Blood2005 ；105:4484)。在实体瘤细胞中，通过CDK9活性的下调导致的转录抑制与细胞周期CDK如CDKl和2的抑制的协同作用来诱导凋亡(Cai, D.-P.，Cancer Res.2006，66:9270)。通过CDK9或CDK7抑制的转录对肿瘤细胞类型具有选择性非增殖作用，其取决于具有短半寿期的mRNA，例如套细胞淋巴瘤中细胞周期蛋白Dl的转录。一些转录因子如Myc和NF- κ B选择性招募⑶Κ9到其启动子，并且依赖于这些信号途径活化的肿瘤可能对CDK9抑制是敏感的。
[0006]某些CDK抑制剂通过抑制正常未转化细胞的细胞周期进程的能力，而用作化疗保护剂(chemoprotective agent) (Chen, J., Natl.Cancer Instit.，2000 ;92:1999_2008)。在使用细胞毒性剂之前用CDK抑制剂预处理癌症患者可以降低通常与化疗相关的副作用。通过选择性CDK抑制剂的作用，可保护正常增殖的组织免于细胞毒效应。
[0007]发现指示治疗是有效的药效(PD)标志物可以是有价值的。可以将此类标志物用于监测正在接受治疗的那些患者的应答。如果ro标志物指示患者没有对治疗适当地应答，那么可以增加、减少或者完全中断施用的剂量。因此，存在研发与CDK抑制剂相关的ro标志物的需求。该方法确保患者接受最适当的治疗。[0008]在研发CDK抑制剂中，ro标志物可以帮助了解施用后作用的机制。作用机制可能涉及细胞周期中调节机制的复杂级联，并且可以在药物研发的临床前的阶段进行这种分析，以测定候选CDK抑制剂的特定活性。在药效研究中特别感兴趣的是鉴定有活性的特定标志物，例如本文中所公开的标志物。
[0009]发明概述
[0010]本发明涉及分析表2中所鉴定的若干基因，所述基因作为CDK抑制剂(下文中称为“⑶KI”)活性的特定药效(PD)标志物。特别地，本发明涉及在⑶KI治疗后上调或下调所鉴定的基因的表达。可将ro标志物用于确定患者接受了正确的疗程。本发明是“个体化医疗”的实例，其中基于对患者特异的功能基因组标记来治疗患者。
[0011]本发明包含监测患者对治疗应答的方法。该方法包括以下步骤:将任意(any与any one不同)⑶KI施用给患者，并测量从患者获得的生物样品的基因表达。基于检测来自表2的至少一种生物标志物的基因表达，来评价患者的应答。与基线比较，至少一种H)标志物的表达水平的检测和/或改变，可以指示患者对治疗的应答。表达水平的模式的改变可以指示有利的应答或者不利的应答。
[0012]附图简述
[0013]图1显示用⑶KI (7)或⑶KI⑶处理的细胞的IC50值。
[0014]图2显示了用⑶KI (7)处理后，两种不同细胞系中的差别基因表达。
[0015]图3显示了当用⑶KI (8) XDKI(Il)或放线菌素D处理细胞时，MEPCE表达的降低。
[0016]图4显示了用⑶KI (7)处理后，MEPCE和LARP7蛋白水平的差异表达。
[0017]图5显示了用⑶KI (7)处理的肺癌细胞系中，参与凋亡调节的基因的差别基因表达。
[0018]图6显示了当用⑶KI (7)处理时，狗白细胞中MEPCE表达的降低。
[0019]图7显示了当用⑶KI (7)处理时，狗白细胞中MYC表达的降低。
[0020]图8显示了当用⑶KI (7)处理时，狗白细胞中MCLl表达的降低。
[0021]图9显示了当用⑶KI (12)处理时，狗白细胞中MEPCE表达的降低。
[0022]图10显示了当用⑶KI (12)处理时，狗白细胞中MYC的表达未降低。
[0023]图11显示了当用⑶KI (12)处理时，狗白细胞中MCLl的表达未降低。
[0024]发明详述
[0025]在一个方面，本公开涉及分析表2中所鉴定的若干基因，所述基因可作为药效(PD)标志物。CDKI治疗后ro标志物表达的增加或减少指示抑制剂是有效的。基于检测来自表2的至少一种ro标志物的差别基因表达，来评价患者的应答。与基线相比，至少一种PD标志物的表达水平的检测和/或改变，指示了⑶KI活性，并且这与患者对治疗的应答相关。表达水平的模式的改变可以指示有利的患者应答或者不利的患者应答。
[0026]因此，本公开提供了监测患者对用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(⑶KI)进行的治疗的应答的方法，该方法包括:
[0027]a)施用至少一种CDKI ；[0028]b)在生物样品中测量选自表2的至少一种药效(PD)标志物的差别基因表达，所述生物样品从已经施用⑶KI的患者获得；和
[0029]C)将至少一种ro标志物的差别基因表达与对照样品中至少一种ro标志物的基因表达比较。
[0030]在本方法中，PD标志物选自:MEPCE (SEQ ID NO:1)、MCLl (SEQ ID NO:3), MYC(SEQ ID NO:5),HEXIMl (SEQ ID N0:7)、LARP7 (SEQ ID N0:9)或 WHSC2 (SEQ ID NO: 11)。
[0031]在本方法中，TO标志物是MEPCE (SEQ ID NO:1)。
[0032]在本方法中，测量至少 一种H)标志物的核酸或蛋白质。
[0033]在本方法中，至少一种ro标志物的基因表达是降低的。
[0034]在本方法中，测量至少两种ro标志物的基因表达。
[0035]本方法还包括在施用⑶KI之前，从患者获得生物样品。
[0036]在本方法中，生物样品获自肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC。
[0037]在本方法中，CDKI抑制CDK9。
[0038]在本方法中，⑶KI选自表1。
[0039]在本方法中，⑶KI以治疗有效量施用。
[0040]在本方法中，调整后续施用给患者的⑶KI的治疗有效量。
[0041]在本方法中，在至少两个不同的时间点测量H)标志物的差异表达。
[0042]在本方法中，在第I小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复步骤b)和c)。
[0043]在本方法中，在步骤a)施用两种不同的⑶ΚΙ。
[0044]在本方法中，同时施用两种不同的⑶ΚΙ。
[0045]在本方法中，在不同的时间点施用两种不同的CDKI。
[0046]测定细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)的敏感性的方法，该方法包括:
[0047]a)将细胞与至少一种⑶KI接触；
[0048]b)测量与⑶KI接触的细胞中的选自表2的至少一种药效(PD)标志物的差别基因表达；和
[0049]c)将差别基因表达与来自未处理的或经安慰剂处理的对照细胞的基因表达比较。
[0050]在本方法中，PD标志物选自:MEPCE (SEQ ID NO:1)、MCLl (SEQ ID NO:3), MYC(SEQ ID NO:5),HEXIMl (SEQ ID N0:7)、LARP7 (SEQ ID N0:9)或 WHSC2 (SEQ ID NO: 11)。
[0051]在本方法中，TO标志物是MEPCE (SEQ ID NO:1)。
[0052]在本方法中，测量至少一种H)标志物的核酸或蛋白质。
[0053]在本方法中，至少一种ro标志物的基因表达是降低的。
[0054]在本方法中，测量至少两种ro标志物的基因表达。
[0055]在本方法中，所述细胞获自肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC。
[0056]在本方法中，CDKI抑制CDK9。
[0057]在本方法中，⑶KI选自表1。[0058]在本方法中，在至少两个不同的时间点测量ro标志物的差异表达。
[0059]在本方法中，在第I小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复步骤b)和c)。
[0060]在本方法中，在步骤a)所述细胞接触两种不同的CDKI。
[0061]在本方法中，所述细胞同时接触两种不同的CDKI。
[0062]在本方法中，所述细胞在不同的时间点接触两种不同的CDKI。
[0063]筛选⑶KI候选物的方法，该方法包括:
[0064]a)将细胞与⑶KI候选物接触；
[0065]b)在与⑶KI候选物接触的细胞中测量选自表2的至少一种药效(PD)标志物的差别基因表达；和
[0066]c)将用⑶KI候选物接触的细胞的至少一种ro标志物的差别基因表达与用取自表I的⑶KI接触的细胞的至少一种ro标志物的差别基因表达以及未处理的或经安慰剂处理的细胞的至少一种ro标志物的差别基因表达比较。
[0067]在本方法中，PD标志物选自:MEPCE (SEQ ID NO:1)、MCLl (SEQ ID NO:3), MYC(SEQ ID NO:5),HEXIMl (SEQ ID N0:7)、LARP7 (SEQ ID N0:9)或 WHSC2 (SEQ ID NO: 11)。
[0068]在本方法中，ro标志物是MEPCE (SEQ ID NO:1)。
[0069]在本方法中，测量至少 一种H)标志物的核酸或蛋白质。
[0070]在本方法中，至少一种ro标志物的基因表达是降低的，指示⑶κι候选物是⑶K抑制剂。
[0071]在本方法中，筛选是针对⑶K9抑制剂的。
[0072]在本方法中，将⑶KI候选物的差别基因表达与选自表1的⑶KI的差别基因表达比较。
[0073]在本方法中，细胞获自肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC。
[0074]在本方法中，在至少两个不同的时间点测量ro标志物的差异表达。
[0075]在本方法中，在第I小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复步骤b)和c)。
[0076]可以将本文中提及的ro标志物用于监测患者对治疗的应答。例如，取决于如通过表2中公开的ro标志物的差异表达所测量的患者对CDKI的应答，可以调整剂量、引入其他治疗、预示和防止毒性反应或其他不利事件、或者中断治疗。
[0077]紅
[0078]如在说明书和权利要求中所用，除非上下文明确指出，单数形式“一个”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
[0079]全部数字指定，例如，pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其通过0.1的增量(+)或(一)而改变。应当理解，尽管并不总是明确指明，但术语“约”处于全部数值指定的前面。也应当理解，尽管并不总是明确指明，但本文中所述的试剂仅仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。
[0080]术语“药效标志物”或“ro标志物”在本文中可互换使用。药效标志物是基因，并且核酸或多肽水平的存在、不存在或差异表达用于测定施用的CDKI是否有效。例如，细胞与任一种⑶KI接触后，当与接触⑶KI抑制剂前或者经安慰剂处理/未处理对照的MEPCE表达相比时，MEPCE基因的mRNA表达是降低的。
[0081]术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并指任意长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的多聚形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组的多核苷酸、分枝的多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多聚体组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。所述术语还指双链和单链分子。除非另外指明或要求，本发明的任何多核苷酸的实施方案包括双链形式和已知的或预测构成双链形式的两条互补的单链形式的每一条链。
[0082]“基因”指含至少一个可读框(ORF)的多核苷酸，其在转录和翻译后能编码特定的多肽或蛋白质。可以将多核苷酸序列用于鉴定与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。
[0083]“基因产物”或备选地“基因表达产物”指基因转录和翻译时产生的氨基酸(例如，肽或多肽)。
[0084]术语“多肽”可与术语“蛋白质”互换使用，并在广义上指两个或多个亚基氨基酸(subunit amino acid)的化合物、氨基酸类似物或拟肽。亚基可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可以通过其他键，例如酯、醚等连接。
[0085]如本文中所用，术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，以及D和L旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。如果肽链很短，那么通常将三个或三个以上氨基酸的肽称为寡肽。如果肽链很长， 那么通常将肽称为多肽或蛋白质。
[0086]术语“分离”意为与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段在天然状态下通常与其相关的组分、细胞组分及其他分离。在本发明的一个方面，分离的多核苷酸与在自然或天然环境，例如在染色体上通常与其相关的3’和5’连续核苷酸分离。本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要“分离”，以将其与其天然存在的对应物区分开来。此外，“浓缩的”、“分离的”或“经稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在的对应物区分开来，因为与天然存在的对应物相比，每一体积的浓缩物或者分子数在“浓缩的”形式中更多或者在“分离的”形式中更少。在一级序列或者例如糖基化模式上不同于天然存在的对应物的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要以分离形式存在，因为可以通过一级序列或者备选地，通过另一特征如糖基化模式与其天然存在的对应物区分开来。因此，将非天然存在的多核苷酸提供为不同于分离的天然存在的多核苷酸的单独实施方案。将在细菌细胞中产生的蛋白质提供为区别于从真核细胞分离的天然存在的蛋白质的单独实施方案，在天然状态下所述真核细胞产生所述蛋白质。
[0087]当在多核苷酸操作的上下文中使用时，“探针”指寡核苷酸，其提供为通过与靶标杂交，检测可能存在于目的样品中的靶标的试剂。通常，探针包含标记或者杂交反应之前或之后标记可以结合的方法。合适的标记包括但不限于，放射性同位素、突光色素、化学发光化合物、染料和蛋白质包括酶。
[0088]“引物”是通常具有游离的3’ -OH基的短的多核苷酸，其通过与靶标杂交，与目的样品中可能存在的靶标或“模板”结合，从而促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。“聚合酶链反应”(“PCR”)是这样的反应:使用由“上游”和“下游”引物组成的“一对引物”或“一套引物”，聚合的催化剂如DNA聚合酶以及一般热稳定聚合酶，复制组成靶多核苷酸的拷贝。PCR方法是本领域熟知的，并且例如在PCR:A Practical Approach, M.MacPherson等人，IRLPress at Oxford University Press (1991)中教导。产生多核苷酸的复制拷贝的全部过程，例如PCR或基因克隆在本文中总称为“复制”。还可以将引物用作杂交反应，例如DNA或RNA 印迹分析中的探针(Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(1989))。 [0089]如本文中所用，“表达”指DNA转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
[0090]当将“差异表达”应用于基因时，指从该基因转录和/或翻译的mRNA或者由该基因编码的蛋白质产物的差异产生。与正常或对照细胞的表达水平相比，差异表达基因可以是过量表达或者低表达(underexpress)。然而,如本文中所述,过量表达是增加的基因表达，并且通常比在正常或对照对应细胞或组织中检测到的基因表达高至少1.25倍，或备选地至少1.5倍，或备选地至少2倍，或备选地至少4倍。如本文中所用，低表达是降低的基因表达，并且通常比在正常或对照对应细胞或组织中检测到的基因表达低至少1.25倍，或备选地至少1.5倍，或备选地至少2倍，或备选地至少4倍。术语“差异表达”还指在细胞或组织中可以检测到表达，而在对照细胞或组织中不能检测到表达。
[0091]由于基因的过量表达或者基因拷贝数的增加，可以存在基因的高表达水平。由于负调节子的下调或缺失，基因还可以翻译成更多的蛋白质。
[0092]“基因表达谱”指多个样品中出现的至少一种ro标志物的表达的模式，并且反映了这些样品例如组织型样品对特定处理、或者细胞中特定生物学过程或途径的激活应答所共有的性质。此外，基因表达谱区分共有共同性质的样品和没有共同性质的那些样品，这比通过将样品随机分配成两组实现的准确性更高。可以将基因表达谱用于预测未知状态的样品是否共有这样的共同性质。期望的是在至少一种ro标志物的水平与典型谱之间有一些变化，但在统计学上，表达水平与典型谱在整体上相似是不可能的，因为在不共有表达谱所反映的共同性质的样品中，只能偶然观察到相似性。
[0093]术语“cDNA”指互补DNA，即用酶如逆转录酶将细胞或生物中存在的mRNA分子制备成cDNA。“cDNA”文库是细胞或生物中存在的全部mRNA分子的集合，用逆转录酶将所述mRNA全部转变成cDNA分子，然后插入到“载体”(在添加外源DNA后可以继续复制的其他DNA分子)中。用于文库的示例性载体包括噬菌体、感染细菌的病毒，如λ噬菌体。然后可以针对特定的目的cDNA (和由此得到的mRNA)探测文库。
[0094]如本文中所用，可互换使用的“固相支持物”或“固相支持体”并不限于特定类型的支持体。相反，本领域普通技术人员可以获得并且已知大量的支持体。固相支持体包括硅胶、树脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉纱、塑料珠、氧化铝凝胶、微阵列和芯片。如本文中所用，“固相支持体”还包括合成的抗原呈递基质、细胞和脂质体。基于期望的最终用途和不同方案的适用性，可以选择合适的固相支持体。例如，对于肽合成，固相支持体可以涉及树脂，例如聚苯乙烯(例如，获自Bachem Inc., Peninsula Laboratories的PAM-r树脂)、polyHIPE(R)?树脂(获自Aminotech,加拿大)、聚酰胺树脂(获自PeninsulaLaboratories)、用聚乙二醇嫁接(graft)的聚苯乙烯树脂(TentaGelR?, Rapp Polymere,Tubingen,德国)或者聚二甲基丙烯酰胺树脂(获自Milligen/Biosearch, California)。
[0095]还可以将多核苷酸与固相支持体连接，用于高通量筛选测定。例如，PCTW097/10365公开了高密度寡核苷酸芯片的构建。也参见，美国专利N0.5，405，783 ；5，412，087和5，445，934。使用该方法，在衍生的玻璃表面上合成探针，以形成芯片阵列。将光保护的核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，经光刻用掩模通过光解选择性去保护，并与第二个所保护的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去保护过程，直到完成期望的探针。
[0096]作为实例，通过使用基于芯片如Affymetrix HG-U133-Plus-2GeneChips?来测量信使RNA的水平，可以评估转录活性。因此，在可重复的系统中，有可能高通量、实时定量大量目的基因的RNA。
[0097]术语“严格杂交条件”指这样的条件，在所述条件下核酸探针可以与其靶序列特异性杂交，而不与其他序列杂交。确定杂交的严格性的条件包括:温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度。改变这些因素之一会影响另一因素，并且本领域技术人员理解，可以改变条件以维持期望的严格水平。高度严格杂交的实例是:65°C -68°C,0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者42°C，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50%甲酰胺(参见Sambrook，上文)。“中等严格”杂交的实例是条件:50°C -65 °C，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者370C -50°C，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和20%甲酰胺。当期望适量的核酸错配时，使用中等严格条件。本领域技术人员理解，洗涤是杂交条件的一部分。例如，洗涤条件可以包括02.X-0.1X SSC/0.1%SDS和42°C-68°C的温度，其中增加温度增加了洗涤条件的严格性。
[0098]当在两条单链多核苷酸之间以反向平行构型发生杂交时，称该反应为“退火”，并且将这些多核苷酸描述为“互补”。如果在第一多核苷酸的链之一和第二多核苷酸之间发生杂交，那么双链多核苷酸与另一多核苷酸可以是“互补的”或者“同源的”。根据通常公认的碱基配对规则，按照相对链 中期望彼此形成氢键的碱基的比例，可以量化“互补性”或“同源性”(一种多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度)。
[0099]多核苷酸或多核苷酸区(多肽或多肽区)与另一序列具有“序列同一性”的确定百分比(例如，80%、85%、90%、95%、98%或99%)指的是，当比对时，在比较的两个序列中，碱基(或氨基酸)的百分比是相同的。可以使用本领域已知的软件程序，例如Current Protocolsin Molecular Biology, Ausubel 等人，eds.，(1987) Supplement30, section7.7.18, Table7.7.1中描述的那些程序进行这种比对并确定同源性和序列同一性百分比。优选地，将默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，并使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，且使用以下的默认参数:遗传密码=标准；过滤=无；链=两条；截断=60 ;期望值=10 ；Matrix=BL0SUM62 ;描述=50个序列；排序=高得分；数据库=非冗余的。
[0100]术语“细胞增殖性病症”应当包括表征为异常细胞生长和/或分裂或者功能丧失的正常生理功能的调节异常。“细胞增殖性病症”的实例包括但不限于，增生、瘤形成、组织转化或多种自身免疫病症，例如以T细胞凋亡的调节异常为特征的那些疾病。
[0101]如本文中所用，术语“赘生性细胞”、“肿瘤性疾病”、“瘤形成”、“肿瘤”、“肿瘤细胞”、“癌症”、“癌细胞”(可互换使用)指表现出相对自主生长的细胞，以致它们表现出以细胞增殖控制(即，下调细胞分裂)的显著丧失为特征的异常生长表型。赘生性细胞可以是恶性的或者良性的。转移的细胞或组织指的是细胞可以侵入并破坏邻近的机体结构。
[0102]术语“癌症”指癌症疾病，其包括例如癌(例如，肺癌、黑素瘤、骨髓病症(例如，髓细胞白血病、多发性骨髓瘤和红白血病)、淋巴细胞白血病、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌和肉瘤(例如，骨肉瘤)。术语“PBMC”指外周血单核细胞，并包括“PBL” -外周血淋巴细胞。
[0103]“抑制”肿瘤生长表示当与未与⑶KI化合物接触的肿瘤生长相比，肿瘤细胞生长的减慢。可以通过本领域已知的任何方法评估肿瘤细胞生长，其包括但不限于测量肿瘤大小、使用3H-胸苷掺入测定法确定肿瘤细胞是否正在增殖、通过FDG-PET(氟代脱氧葡萄糖正电子成像术)成像测量葡萄糖吸收、或者计数肿瘤细胞。“抑制”肿瘤细胞生长指的是以下状态的任一种或者全部:减缓、延迟和终止肿瘤生长，以及肿瘤缩小。
[0104]“组合物”是活性剂和另一载体的组合，所述载体例如惰性的(例如，可检测的试剂或标记)或者有活性的化合物或组合物，如佐剂、稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂溶剂、防腐剂、辅助剂等。载体还可以包含单独的或者组合的按重量或体积为1-99.99%的药物赋形剂和添加剂，例如:可以单独或者组合存在的蛋白质、肽、氨基酸、脂和糖(例如，糖，包括单糖和寡糖；衍生的糖如糖醇、糖醛酸、酯化的糖等；以及多糖或糖聚合物)。糖赋形剂包括例如，单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如蜜三糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)和肌醇。
[0105]示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲容量中发挥功能的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。
[0106]术语“载体”还包括缓冲剂或pH调整剂；一般地，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐；Tris、氨丁三醇盐酸盐(tromethamine hydrochloride)或磷酸盐缓冲液。其他载体包括聚合的赋形剂/高分子添加剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(聚合的糖)、葡聚糖结合剂(例如，环糊精，如2-轻丙基-正交(quadrature)-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯如TWEEN20?和TWEEN80?)、脂(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA )。
[0107]如本文中所用，术语“可药用载体”包括任一种标准的可药用载体，例如磷酸缓冲盐水溶液、水和乳剂，如油/水或水/油乳剂，以及多种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂，以及可应用于体内的任何上述载体。载体、稳定剂和佐剂的实例参见RemingtonJ s Pharmaceutical Science., 15th Ed.(Mack Pub1.C0., Easton (1975)和 thePhysician’ s Desk Reference, 52nd ed.，Medical Economics, Montvale, N.J.(1998)中。
[0108]“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。可以在一次或多次施用或应用或给药时施用有效量。
[0109]“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，其指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人类。哺乳动物包括但不限于，小鼠、猿猴、人、家畜、运动动物和宠物。
[0110]如本文中所用，细胞周期蛋白D激酶的“抑制剂”降低了细胞周期蛋白D激酶的效应。这种抑制可以包括例如，激酶活性的降低或者转录延伸的减少。
[0111]目前，已经将许多基因鉴定为⑶KI的ro标志物。可以将本文中所鉴定的一种或多种ro标志物的基因表达的减少或增加用于确定⑶κι是否具有期望的作用，例如，施用⑶KI后基因表达的降低或低表达。作为实例，用⑶KI处理2小时后，MEPCE的基因表达的降低可以提供⑶KI是否有效的信息。⑶KI PD标志物的列表见于表2中。
[0112]⑶K抑制剂(⑶KI)是化合物，其是⑶K9的抑制剂，并且可将其与本发明方法结合。由于CDK9是转录延伸的下游效应子，所以可以将CDKI用于在人类或动物(其中显示了 CDK9的抑制)中使用的药物组合物中，例如用于治疗肿瘤和/或癌细胞生长。特别地，可将此类化合物用于治疗人类癌症，因为这些癌症的进程至少部分依赖于转录延伸，因此对于通过干扰CDK9活性来进行治疗是敏感的。可将CDKI化合物用于治疗例如癌(例如，肺癌、黑素瘤、骨髓病症(例如，髓细胞白血病、多发性骨髓瘤和红白血病)、淋巴细胞白血病、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌和肉瘤(例如，骨肉瘤)。⑶KI化合 物的列表见于表1中。
[0113]表1-CDKI化合物
[0114]
【权利要求】
1.监测患者对用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)进行治疗的应答的方法，所述方法包括: a)施用至少一种⑶KI； b)在生物样品中测量选自表2的至少一种药效(PD)标志物的差别基因表达，所述生物样品从已经施用⑶KI的患者获得；和 C)将至少一种ro标志物的差别基因表达与对照样品中至少一种ro标志物的基因表达比较。
2.权利要求1的方法，其中所述ro标志物选自:MEPCE(SEQ ID NO:1),MCLl (SEQ IDN0:3)、MYC (SEQ ID NO:5),HEXIMl (SEQ ID N0:7)、LARP7 (SEQ ID N0:9)或 WHSC2 (SEQID N0:11)。
3.权利要求1的方法，其中所述I3D标志物是MEPCE(SEQ ID N0:1)。
4.权利要求1的方法，其中测量所述至少一种ro标志物的核酸或蛋白质。
5.权利要求1的方法，其中所述至少一种ro标志物的基因表达是降低的。
6.权利要求?的方法,其中测量至少两种ro标志物的基因表达。
7.权利要求1的方法，其进一步包括在施用所述⑶KI之前从所述患者获得生物样品。
8.权利要求1的方法，其中所述生物样品从肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢 癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC获得。
9.权利要求1的方法，其中所述⑶KI抑制⑶K9。
10.权利要求1的方法，其中所述⑶KI选自表1。
11.权利要求1的方法，其中以治疗有效量施用所述CDKI。
12.权利要求10的方法，其中调整后续施用于患者的CDKI的所述治疗有效量。
13.权利要求1的方法，其中至少在两个不同的时间点测量所述ro标志物的差异表达。
14.权利要求1的方法，其中在第I小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复所述步骤b)和c)。
15.权利要求1的方法，其中在步骤a)施用两种不同的CDKI。
16.权利要求14的方法，其中同时施用两种不同的CDKI。
17.权利要求14的方法，其中在不同的时间点施用两种不同的CDKI。
18.测定细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)的敏感性的方法，所述方法包括: a)将细胞与至少一种⑶KI接触； b)在与所述CDKI接触的所述细胞中测量选自表2的至少一种药效(PD)标志物的差别基因表达；和 c)将所述差别基因表达与来自未处理的或经安慰剂处理的对照细胞的基因表达比较。
19.权利要求18的方法，其中所述H)标志物选自MEPCE(SEQID NO:1),MCLl (SEQ IDNO:3)、MYC (SEQ ID NO:5),HEXIMl (SEQ ID NO:7)、LARP7 (SEQ ID NO:9)或 WHSC2 (SEQID NO:ll)。
20.权利要求18的方法，其中所述H)标志物是MEPCE(SEQ ID NO:1)。
21.权利要求18的方法，其中测量所述至少一种H)标志物的核酸或蛋白质。
22.权利要求18的方法，其中所述至少一种H)标志物的基因表达是降低的。
23.权利要求18的方法，其中测量至少两种ro标志物的基因表达。
24.权利要求18的方法，其中所述细胞从肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC获得。
25.权利要求18的方法，其中所述⑶KI选自表1。
26.权利要求18的方法，其中至少在两个不同的时间点测量所述H)标志物的差异表达。
27.权利要求18的方法，其中在第I小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复所述步骤b)和c)。
28.权利要求18的方法，其中在步骤a)所述细胞与两种不同的CDKI接触。
29.权利要求18的方法，其中所述细胞同时与两种不同的CDKI接触。
30.权利要求18的方法，其中所述细胞在不同的时间点与两种不同的CDKI接触。
31.筛选⑶KI候选物的方法，所述方法包括: a)将细胞与CDKI候选物接触； b)在与CDKI候选物接触的细胞中测量选自表2的至少一种药效(PD)标志物的差别基因表达；和 C)将用CDKI候选物接 触的细胞的至少一种ro标志物的差别基因表达与用取自表1的CDKI接触的细胞的至少一种PD标志物的差别基因表达以及未处理的或经安慰剂处理的细胞的至少一种ro标志物的差别基因表达比较。
32.权利要求31的方法，其中所述H)标志物选自:MEPCE(SEQ ID NO:1), MCLl (SEQID NO: 3), MYC (SEQ ID NO: 5), HEXIMl (SEQ ID NO: 7), LARP7 (SEQ ID NO:9)或 WHSC2(SEQ ID NO:11)。
33.权利要求31的方法，其中所述I3D标志物是MEPCE(SEQ ID ΝΟ:1)。
34.权利要求31的方法，其中测量所述至少一种H)标志物的核酸或蛋白质。
35.权利要求31的方法，其中所述至少一种H)标志物的基因表达降低，指示所述CDKI候选物是CDK抑制剂。
36.权利要求31的方法，其中所述筛选针对CDK9抑制剂。
37.权利要求31的方法，其中将所述CDKI候选物的差别基因表达与选自表1的CDKI的差别基因表达比较。
38.权利要求31的方法，其中所述生物样品从肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌或PMBC获得。
39.权利要求31的方法，其中至少在两个不同的时间点测量所述H)标志物的差异表达。
40.权利要求31的方法，其中在第I小时、第2小时、第3小时、第4小时、第8小时、第16小时、第24小时和第48小时重复所述步骤b)和c)。
【文档编号】C12Q1/68GK103476949SQ201280015901
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年3月28日 优先权日:2011年3月28日
【发明者】M·福雷, Z·高, J·萨顿, G·K·于 申请人:诺瓦提斯公司