细胞培养系统的制作方法

细胞培养系统的制作方法
【专利摘要】本文所述的本发明的实施方式涉及用于在体外对肠细胞、组织和／或类器官进行培养和／或维持的系统和方法。根据本文所述的方法和系统培养的细胞、组织和／或类器官能够模仿或重现天然肠上皮结构和行为，并能够支持肠菌群的共培养。
【专利说明】细胞培养系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]根据35U.S.C.119(e)，本申请要求美国临时专利申请序列号61/447，540(2011年2月28日提交)的优先权，以引用的方式将其内容各自整体并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本发明是部分在来自美国国立环境卫生科学研究院(National Institute ofEnvironmental Health Sciences)的基金ES016665-01A1的美国政府支持下完成的。美国政府对本发明拥有一定权利。
【技术领域】
[0005]本文所述的本发明的系统和方法涉及肠类器官(intestinal organoid)的体外培养和维持。
【背景技术】
[0006]由于依赖于动物模型的使用，而动物模型代价高、是劳动密集型的、耗时并存在伦理问题，因而药物开发受到阻碍^但更大的顾虑是，动物模型常常预测不到在人体中所得到的结果2_3，在解决与药物和营养物的代谢、转运和口服吸收相关的挑战时，这是特有的问题4_5。由于这些原因，开发人肠功能的体外模型已引起人们越来越多的兴趣，该体外模型包括能够进行跨上皮屏障和转运研究的使用Transwell滤器镶嵌套(filter insert)6—7的细胞培养系统、以及也支持长期培养的小型化微流控模型(miniaturized microf Iuidicmodels) 1(1_14。还有人尝试过通过在水凝胶基底上培养的人肠上皮(例如Caco-2)细胞来在体外重建肠衬里(intestinal lining)的正常三维(3D)构架,所述水凝胶基底经微加工以模拟人肠绒毛的形状、大小 和密度n。然而，现有的体外肠模型均未重现活肠(livingintestine)的机械活动微环境(mechanically active microenvironment)(螺动运动和腔内流体流动)，所述机械活动微环境对于正常器官的生理机能15以及Crohn病和其它肠紊乱的发展16_17是非常关键的。现有体外肠模型的另一个局限是，在培养的肠上皮的腔表面上，活微生物还不能像通常在活肠中那样在延长的一段时间内生长。这是一个关键问题，因为微生物共生体(microbial symbionts)通常对肠屏障功能、药物和化学物质的代谢和吸收、以及对许多疾病都有很大贡献18_22。开发基于活细胞的体外肠模型(模拟人肠的机械特性、结构特性、吸收特性、转运特性和病理生理特性连同其关键微生物共生体)能够加速药物的开发，并可能取代动物试验。

【发明内容】

[0007]本文描述了涉及用于在体外对肠类器官和/或肠上皮细胞进行维持和/或培养的细胞培养系统的系统和方法。本文所述的本发明的实施方式是基于发明人的如下发现:提供流体流动、剪切应力和/或机械应力能够使得肠环境得以实现更生理相关的重现。本文所述的系统和方法可用于对如下项目进行研究或检测的目的:药理学、毒理学、药物开发、药物递送、药物代谢、药物-药物相互作用、药物生物利用度、药物清除、多器官相互作用、诊断、治疗、营养应用、肠屏障生理学、胃肠(GI)疾病模型及其机理、GI道疾病的病因学、伤口愈合、组织再生、组织工程、肠稳态、肠干细胞研究、宿主-微生物相互作用、GI道中的微生物群落(microbial communities)、粘液层中的微生物生物膜(microbial biofilm)以及益生菌疗法。
[0008]一方面，本文所述的发明涉及细胞培养系统，该细胞培养系统包含:(i )流控装置(fluidic device),所述流控装置具有连接至(connected to)流体源的流体通道,所述流体源供应流体至所述流体通道；(ii)膜，所述膜设置于所述通道内、膜支持元件之间，所述膜的至少一部分是柔性的(flexible); (iii)膜应变机制(memberane strain mechanism),所述膜应变机制连结(coupled to)至所述膜支持元件，所述膜应变机制能够移动所述膜支持元件并引起所述膜沿所述膜的至少一个维度拉伸；以及(iv)至少一层肠上皮细胞，所述肠上皮细胞贴附至所述膜的至少一个表面，其中，流经所述流体通道的流体上的剪切应力小于 1.0dyne/cm2。
[0009]在一些实施方式中，流经流体通道的流体上的剪切应力为0.008dyne/cm2至0.08dyne/cm2。在一些实施方式中，流经流体通道的流体上的剪切应力约为0.018dyne/cm2。在一些实施方式中，流经流体通道的流体上的剪切应力可随时间变化。在一些实施方式中，流经流体通道的流体上的剪切应力可随时间从Odyne/cm2变化至1000dyne/cm2。在一些实
施方式中，流经流体通道的流体上的剪切应力可随时间从0.008dyne/cm2变化至0.08dyne/
2
cm ο
[0010]在一些实施方式中， 使膜拉伸0%_50%。在一些实施方式中，使膜拉伸5%_15%。在一些实施方式中，使膜拉伸约10%。在一些实施方式中，使膜拉伸大于15%,以产生肠上皮细胞的异常状况/状态。
[0011]在一些实施方式中，使膜以频率为0.01HZ-2HZ的周期性方式拉伸。在一些实施方式中，使膜以频率为0.05Hz-0.25Hz的周期性方式拉伸。在一些实施方式中，使膜以频率为0.15Hz的周期性方式拉伸。在一些实施方式中，使膜以频率大于0.2Hz的周期性方式拉伸，以产生肠上皮细胞的异常状况/状态。在一些实施方式中，使膜以无规律的方式或间歇性的方式拉伸。
[0012]在一些实施方式中，流体以小于500 μ L/hr的流速流经流体通道。在一些实施方式中，流体以小于100 μ L/hr的流速流经流体通道。在一些实施方式中，流体以OyL/hr-50 μ L/hr的流速流经流体通道。在一些实施方式中，流体以约30 μ L/hr的流速流经流体通道。
[0013]在一些实施方式中，所述系统进一步包含支持多个活细胞附着的至少一种贴附分子(attachment molecule),所述贴附分子涂覆在所述膜的至少一面。在一些实施方式中，所述至少一种贴附分子选自于由下列物质所组成的组:胶原蛋白、I型胶原蛋白、MATRIGEL?、细胞外基质、层粘连蛋白、蛋白聚糖、玻连蛋白(vitronectin)、纤连蛋白(fibronectin)、聚D-赖氨酸、多肽、寡核苷酸、DNA以及多糖。
[0014]在一些实施方式中，肠上皮细胞是哺乳动物细胞或人细胞。在一些实施方式中，肠上皮细胞选自于由下列细胞所组成的组:Caco-2细胞、HT-29细胞、原代小肠上皮细胞、原代大肠上皮细胞、iPS细胞、ESC细胞、干细胞、潘氏细胞(paneth cells)、隐窝细胞(cryptcells)以及粘液分泌细胞(mucus-secreting cells)。在一些实施方式中，所述系统的肠上皮细胞进一步含有绒毛结构。在一些实施方式中，所述系统进一步包含在膜的至少第二表面上的至少一层内皮细胞。
[0015]在一些实施方式中，将膜以如下方式进行设置:该膜将流体通道分成第一细胞培养通道和第二细胞培养通道。在一些实施方式中，所述第一细胞培养通道含有肠上皮细胞。在一些实施方式中，所述第二细胞培养通道含有选自于由下列细胞所组成的组中的细胞:内皮细胞、免疫细胞和结缔组织细胞。
[0016]在一些实施方式中，所述系统进一步包含微生物细胞或病原体。在一些实施方式中，所述微生物细胞在系统中维持至少I天。在一些实施方式中，所述微生物细胞选自于由下列微生物所组成的组:乳杆菌属(Lactobacillus)、拟杆菌属(Bacterioides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、双歧杆菌属(81打(1(^3(^61'；!_11111)、埃希氏菌属(Escherichia)、无色杆菌属(Achromobacter)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、醋酸 1丐不动杆菌(Acinetobactercacoaceticus)、气单胞菌属(Aeromonas)、类产减菌(Alcaligenes faecalis)、芽抱杆菌属(Bacillus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyriviberio f ibrosoIvens)、弯曲杆菌属(Camplyobacter)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridiumdifficile)、索氏梭状芽胞杆菌(Clostridium sordelli)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、类肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigel1ides)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、八叠球菌属(Sarcina)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)λ 咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、韦荣球菌属(VeiIlonella)、弧菌属(Vibrio)、小肠结肠炎耶尔森氏菌`(Yersinia enterocolitica)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、鼠李糖乳杆菌 GG (Lactobacillus rhamnosus GG)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。在一些实施方式中，所述微生物细胞是病原性的。在一些实施方式中，所述病原体选自于由下列病原体所组成的组:肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli)、沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)、志贺氏杆菌属(Shigella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、弧菌属、气单胞菌属、弯曲杆菌属(Campylobacter)、隐孢菌属(Crytosporidia)、球虫(Coccidosis)、沙门氏菌属(Salmonella)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、艰难梭状芽抱杆菌、凯道古沙门氏菌(Salmonella kedougou)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭状芽抱杆菌属(Clostridium)、厚壁菌门(Firmicutes)、痢疾志贺氏菌(Shigelliadysenteriae)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、李斯特菌属(Listeria)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、变形杆菌属(Proteus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌以及空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni);轮状病毒(rotavirus)、诺瓦克样病毒(norwalk-like viruses)、腺病毒(adenoviruses)、星状病毒(astroviruses)、札幌样病毒(sapporo-1 ike viruses)、隆病毒(toroviruses)、冠状病毒(coronaviruses)、小核糖核酸病毒(picornaviruses)、抱疫病毒(herpes viruses)、诺如病毒(noroviruses)、念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、单细胞寄生虫(single-celled parasites)、多细胞寄生虫(mult1-celled parasites)、阿米巴(ameobas)、螺虫(worms)、绦虫(tapeworms)、原虫(protozoans)、吸虫(flukes)、蛔虫(roundworms)、烧虫(pinworms)、钩虫(hookworms)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giradia lamblia)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)。在一些实施方式中，所述微生物细胞是好氧的。在一些实施方式中，所述微生物细胞是厌氧的。在一些实施方式中，所述系统既包含好氧微生物细胞、又包含厌氧微生物细胞。在一些实施方式中，所述微生物细胞存在于第一细胞培养通道中。
[0017]在一些实施方式中，所述系统进一步包含厌氧气体腔室，所述厌氧气体腔室与第一细胞培养通道的至少一部分接触。在一些实施方式中，在流经第一细胞培养通道的流体中建立氧气梯度。
[0018]在一些实施方式中，所述膜为至少部分多孔的。在一些实施方式中，膜中的至少一个孔径(pore aperture)沿宽度维度为0.5 μ m-10 μ m。在一些实施方式中，所述膜包含PDMS0在一些实施方式中，由真空压力引起膜拉伸。
[0019]在一些实施方式中，所述系统进一步包含:(i)装置的第一腔室壁，所述第一腔室壁设置为与至少一个流体通道邻接，其中，所述膜安装至所述第一腔室壁；(ii)第一操作通道，所述第一操作通道与所述第一腔室壁另一侧的至少一个流体通道邻接，其中，在所述第一操作通道和所述至少一个流体通道之间施加的压力差(pressure differential)引起所述第一腔室壁朝第一所需方向弯曲，从而沿由所述膜确定的平面扩张或收缩；以及(iii)真空系统，所述真空系统在 所述至少一个流体通道和至少一个操作通道之间提供压力差，其中，所述膜响应所述压力差而延所述平面拉伸。在一些实施方式中，所述系统进一步包含:装置的第二腔室壁，所述第二腔室壁设置为与至少一个流体通道邻接，其中，所述膜的另一端安装至所述第二腔室壁；以及第二操作通道，所述第二操作通道设置为与所述第二腔室壁另一侧的至少一个流体通道邻接，其中，所述第二操作通道和所述至少一个流体通道之间施加的压力差引起所述第二腔室壁朝第二所需方向弯曲，从而沿由所述膜确定的平面扩张或收缩。
[0020]在一些实施方式中，流控装置包括微流控芯片(microfluidic chip)。
[0021]在一些实施方式中，所述系统连接至或连结至第二细胞培养系统，所述第二细胞培养系统含有非肠来源的细胞或组织。在一些实施方式中，所述第二细胞培养系统含有肝细胞或组织。
[0022]一方面，本文所述的发明涉及肠类器官的制造方法，所述方法包括:向本文所述的细胞培养系统提供适于对肠上皮细胞进行维持的流体，以使得所述流体与所述肠上皮细胞接触；以及对所述肠上皮细胞进行体外培养。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述细胞至少培养到绒毛结构明显。[0023]一方面,本文所述的发明涉及用于对肠效应剂(effector agent)进行评价的系统，所述系统包含本文所述的细胞培养系统。[0024]一方面，本文所述的发明涉及对肠治疗进行评价的方法，所述方法包括:将本文所述的细胞培养系统中的细胞与至少一种候选肠治疗效应剂接触；以及对所述系统中细胞的响应进行测量，以确定所述至少一种候选肠效应剂的效果。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1描绘了人肠绒毛的结构重现。多孔膜被肠上皮和毛细血管内皮包围。
[0026]图2描绘了芯片肠(gut-on-a-chip)的一个实施方式的结构示意图，突出显示了由多孔PDMS膜分隔成顶层(紫色)和底层(粉色)的双层细胞培养微通道和位于该双层细胞培养通道旁边的两个真空腔室(天蓝色)。
[0027]图3A-图3D描绘了一系列示意图，所述示意图示出了在芯片肠的一个实施方式中随时间通过重复图3A至图3D而进行的机械拉伸。通过真空通道上由真空驱动的负压对芯片肠施加周期性拉伸，以在细胞单层上施加规定的机械应变(mechanical strain)。
[0028]图4A-图4D描绘了在微通道中建立Caco-2单层的放大图像。将Caco_2细胞接种到微通道内后(图4A)，使细胞得以贴附至微通道中的多孔膜表面上1.5小时(图4B)，然后以30 μ L/hr的恒定流速灌注培养基48小时。在约48小时后，微通道中得到汇合的单层(图4C)。图4D中描绘了多孔膜上的Caco-2单层的放大图像。重复孔的直径为10 μ m，间距为30 μ m。
[0029]图5描绘了用于如下目的的芯片肠装置的一个实施方式的示意图:将在柔性多孔膜(孔直径为10 μ m,间距为30 μ m,厚度为30 μ m) —侧上的肠上皮与另一侧上的毛细血管内皮或淋巴管内皮进行共培养。
[0030]图6A-图6C描绘了芯片肠中转运实验的示意图。图6A描绘了表示在恒定流动下的机械形变(mechanical deformations)的“动态条件(dynamic condition)” 的不意图。图6B描绘了在恒定流动下无机械形变的“流控条件(fluidic condition)”的示意图。图6C描绘了示出传统Transwell系统的“静态条件(static condition)”的示意图,其中，既不存在机械形变也没有流动。
[0031]图7描绘了芯片肠装置中的细胞旁标志物(paracellular marker) FITC-葡聚糖(FD20，20kDa)的表观渗透系数(Papp)的图表，所述芯片肠装置的顶部微通道的多孔膜表面上含有Caco-2单层。静态条件、流控条件和动态条件的实验方案阐释于图6A-图6C中。在动态条件(N=4)中，在FD20转运实验之前，在30 μ L/h的恒定灌注流下施加具有20%伸长量的周期性拉伸12小时。在流控条件(N=4)中，在没有任何拉伸运动的情况下施以30 μ L/h的恒定灌注流(即只有剪切应力)。在动态条件和流控条件这两种条件下，从底部微通道的出口收集样品约I小时，然后将等分样品(aliquot) (10 μ L)进行稀释以测量荧光，荧光处于荧光强度相对于FD20浓度呈线性的区域。在静态条件(Ν=4)中，转运实验在Transwell系统中进行。误差棒示出标准误。
[0032]图8描绘了芯片肠装置中的细胞旁标志物萤光黄(Lucifer yellow，LY)的表观渗透系数(Papp)的图表，所述芯片肠装置的顶部微通道的多孔膜表面上含有Caco-2单层。静态条件、流控条件和动态条件的实验方案描述于图6A-图6C中。在动态条件中，在LY转运实验前，在30 μ L/h的恒定灌注流下施加具有5% (N=I)或15% (N=I)伸长量的周期性拉伸12小时。在流控条件(N=2)中，在没有任何拉伸运动的情况下施以30 μ L/h的恒定灌注流(即只有剪切应力)。在动态条件和流控条件这两种条件下，从底部微通道的出口收集样品约I小时，然后将等分样品(10 μ L)进行稀释以测量荧光，荧光处于荧光强度相对于LY浓度呈线性的区域。在静态条件(Ν=4)中，转运实验在Transwell系统中进行。误差棒示出标准误。在所述图表中，y轴具有刻度分栏(scale break)以继续显示出柱状图的全部范围。
[0033]图9描绘了芯片肠装置中的FD20的表观渗透系数(Papp)的图表，所述芯片肠装置的顶部微通道的多孔膜表面上含有Caco-2单层，底部微通道的多孔膜的相对一侧的表面上含有HMVEC单层。静态条件、流控条件和动态条件的实验方案在图6A-图6C中说明。在动态条件(N=2)中，在FD20转运实验前，在30 μ L/h的恒定灌注流下施加具有15%伸长量的周期性拉伸12小时。在流控条件(N=5)中，在没有任何拉伸运动的情况下施以30 μ L/h的恒定灌注流(即只有剪切应力)。在动态条件和流控条件这两种条件下，从底部微通道的出口收集样品约I小时，然后将等分样品(IOyL)进行稀释以测量荧光，荧光处于荧光强度相对于FD20浓度呈线性的区域。在静态条件(Ν=3)中，转运实验在Transwell系统中进行。误差棒示出标准误。在所述图表中，y轴具有刻度分栏以继续显示出柱状图的全部范围。
[0034]图10描绘了在Transwell中获得的罗丹明123 (Rhol23) (Caco-2细胞中渗透性糖蛋白(permeability glycoproteins,P-gp)的底物)的表观渗透系数(Papp)的图表，所述Transwell的多孔膜(孔大小为0.4 μ m)表面上含有培养了 21天的Caco-2单层。为了抑制Caco-2细胞中的外排转运(efflux transport),在一些实验设置中使用了 Ρ-gp的抑制剂维拉帕米(verapamil)。这一静态转运分析的实验方案描述在图6C中。对于Rhol23从顶端侧(apical side, AP)到基底侧(basolateral side, BL)的转运实验(N=6),将溶于培养基中的Rhol23 (终浓度为100 μ M，200 μ L)替换于Transwell的AP侧，而在Transwell的BL侧加入新鲜培养基(700 μ L)。对于Rhol23从BL侧到AP侧的外排实验(N=6)，将溶解在培养基中的Rhol23 (终浓度为 100 μ Μ，700 μ L)替换于Transwell的BL侧，而将新鲜培养基(200 μ L)替换于Transwell的AP侧。为了检测P-gp抑制效果，在Transwell的AP和BL侧都施加溶解在培养基中的维拉帕米(终浓度为300 μ Μ)，然后进行以从AP到BL (Ν=6)或者从BL到AP (Ν=6)的方式进行的转运实验。误差棒示出标准误。
[0035]图11描绘了微流控芯片肠装置中的Rhol23 (Caco-2细胞中P_gp的底物)的表观渗透系数(Papp)的图表。流控条件和动态条件的实验方案于图6A和图6B中说明。无论是对于在流控条件(N=I)还是对于在动态条件(N=I，15%伸长量)下进行的Rhol23从AP侧到BL侧的转运实验，在顶部微通道中使溶解在培养基中的Rhol23 (终浓度为100 μ M)以30 μ L/h的流速流动，而在底部微通道中以30 μ L/h的流速灌注新鲜培养基。无论是对于在流控条件(N=I)还是在动态条件(N=I，15%伸长量)下进行的Rhol23从BL侧到AP侧的转运实验，在底部微通道中使溶解在培养基中的Rhol23 (终浓度为100 μ M)以30 μ L/h的流速流动，而在顶部微通道中以30 μ L/h的流速灌注新鲜培养基。在动态条件和流控条件这两种条件下，在顶部微通道和底部微通道的出口处收集样品约I小时，然后将等分样品(IOyL)进行稀释以测量荧光，所述荧光处于荧光强度相对于Rhol23浓度呈线性的区域。对于动态条件，在实验前施加具有15%伸长量的机械应变。
[0036]图12A-图12E描绘了人芯片肠装置的一个实施方式。图12A描绘了芯片肠装置的示意图，所述示意图示出了水平穿过中央微通道中部、由肠上皮细胞内衬(lined)的ECM涂覆的柔性多孔膜；以及两侧的全高度真空腔室。图12B描绘了由透明PDMS弹性体(elastomer)组成的芯片肠装置的照片。为使这些通道可视化，使用注射泵分别将蓝色染料和红色染料通过管线(tubing)灌注至上部微通道和下部微通道(由箭头指示方向)。图12C描绘了芯片肠的顶部通道和底部通道(均为150 μ m高)的剖面图；方形插图显示多孔膜(孔10 μ m，比例尺为20 μ m)的一部分的俯视图。图12D描绘了在不存在(左)或存在(右)机械应变(30%;箭头指示方向)的情况下，芯片肠内培养的肠单层的示意图(上)和相差图像(下)，所述机械应变通过对真空腔室施加吸力而产生。红色轮廓和蓝色轮廓标示出机械应变施用前(红色)后(蓝色)单个Caco-2细胞的形状(比例尺20 μ m)。注意到细胞朝所施加的张力的方向扭曲。图12E描绘了作为由真空控制器施加的压力的函数，在ECM涂覆的柔性多孔PDMS膜(空心圆)以及贴附的肠上皮细胞(实心圆)中产生的机械应变的定量。
[0037]图13描绘了本文所述装置的一个实施方式的微加工过程的示意图。所述芯片肠微装置可由三个PDMS层(上层、多孔膜和下层)制成，将所述三个PDMS层顺序粘合并进行修饰，以制成具有上层(蓝色)通道和下层(橙色)通道的中央细胞培养通道以及侧面的两个真空腔室。在制造全高度腔室的过程中，可将横跨真空腔室(灰色)的多孔PDMS膜区域进行物理撕除。
[0038]图14A-图14D描绘了不同细胞培养装置中的Caco-2上皮细胞的形态。图14A描绘了在静态Transwell系统中培养了 21天的Caco-2上皮细胞的形态。图14B-图14C描绘了在存在微流控流动(30 μ L/hr ； μ F)、且不施加(图14Β)或施加(图14C)周期性机械应变(10% ；0.15Ηζ ； μ F+St)的情况下，在芯片肠中培养了 3天的Caco-2上皮细胞的形态。示意图(左)显示系统布局(layout);荧光视图(中)显示上皮单层中紧密连接蛋白闭合蛋白(occludin)的分布；以及共聚焦荧光视图(右)显示上皮的垂直剖面，所述视图突出显示了细胞的形状和极性(细胞核为蓝色，F-肌动蛋白为绿色)。(图14B)和(图14C)中的白色小圈规则阵列是在上皮单层下方显现的孔；白色虚线标示锚定基底的顶部(比例尺为20μπι)。图14D描绘了在静态Transwell培养、或者在不存在(μ F)或存在(μ F+St)机械应变的微流控芯片肠中生长的Caco-2细胞的`平均高度的图表(*p〈0.001)。
[0039]图15A-图15B阐释了由芯片肠中培养的Caco_2细胞自发形成的肠绒毛。图15A描绘了在存在流动和周期性应变(30 μ L/hr, 10%应变，0.15Hz)的情况下，Caco-2细胞单层在培养58小时、132小时和170小时时的相差视图。注意到早期可见的平坦上皮单层在晚期呈现具有焦内区域和焦外区域的起伏性质，这表明绒毛的形成。图15B描绘了 170h时起伏的上皮区域的垂直剖面的共聚焦荧光视图，该视图证实肠绒毛的存在，所述肠绒毛由具有基底核(蓝色)和顶端粘蛋白(apical mucin)表达(洋红色)的持续极化柱状上皮细胞(consistently polarized columnar epithelial cell)(标记了 F-肌动蛋白(绿色))排列而成(被隐窝(crypt)分隔)。白色小圈的规则阵列是上皮单层下显现的孔，比例尺为20μπι。
[0040]图16Α-图16C描绘了对在Transwell (静态)、或者在不存在(μ F)或存在(μ F+St)周期性应变的微流控芯片肠中培养的Caco-2单层的肠屏障功能和分化进行的评价。图16A描绘了通过测量Caco-2单层的TEER而定量得到的上皮紧密连接完整性(tightjunctional integrity)。图16B描绘了通过对穿过Caco-2单层转运的突光葡聚糖进行定量而测量得到的表观细胞旁渗透性(Papp),所述Caco-2单层在静态条件下培养了 5天或21天；或者，所述Caco-2单层在不存在(μ F)或存在(μ F+St)周期性应变的微流控芯片肠中培养了 5天(***p〈0.05)。图16C描绘了通过测量Caco-2细胞中的刷状缘氨基肽酶(brushborder aminopeptidase)活性而评估出的肠细胞分化,该Caco-2细胞在静态条件下培养了5天或21天；或者，该Caco-2细胞在不存在(μ F)或存在(μ F+St)周期性应变的微流控芯片肠中培养了 5 天(*p〈0.001，**p〈0.01)。
[0041]图17Α-图17Ε描绘了在芯片肠中的人肠上皮单层上长期微生物共培养的结果。将鼠李糖乳杆菌GG (LGG)(最初从人肠中分离的细菌)在芯片肠中生长的Caco-2单层的表面上进行培养。图17A描绘了从共培养了 96小时的LGG和Caco-2细胞的上方获得的低倍镜(左)视野和高倍镜(右)视野下的相差视图，所述相差视图示出了暴露于连续流体流动后仍紧密贴附于Caco-2细胞单层的顶端表面(apical surface)的LGG细胞的微菌落(白色箭头)(所有视图中的比例尺均为20μπι)。图17Β描绘了对与LGG共培养96小时的Caco-2单层同时进行的活/死细胞染色，表明事实上所有的上皮细胞都保持存活(绿色)。图17C描绘了在Transwell (静态)或具有周期性应变(μ F+St，40 μ L/hr，10%细胞应变，0.15Hz)的微流控芯片肠中，不存在(空心圆)或存在(实心圆)LGG细胞的情况下所培养的Caco-2单层的屏障功能。需要注意的是，误差棒小于符号的尺寸(*P〈0.01，**p〈0.05)。图17D描绘了对与Caco-2细胞共培养了 96小时的活LGG细胞的功能进行的评估，所述评估通过对如下细胞中的β_半乳糖苷酶的催化活性进行测量而进行:与在具有机械应变的芯片肠中的Caco-2细胞共培养的LGG细胞(+LGG，40 μ L/hr，10%细胞应变，0.15Hz);或者单独培养的Caco-2细胞(作为对照)(*p〈0.01)。图17E描绘了在多种条件下检测到的荧光量(对钙黄绿素AM裂解的测量)的图表，这表明图17B中的荧光染色是由活Caco-2细胞所提供的，而不是活LGG细胞所造成的假象。
[0042]图18A-图18C说明了对于在Caco-2细胞中控制细胞形状和极性，流体流动是关键因素。在不存在周期性应变、使用流速为10 μ L/hr (图18A)或100 μ L/hr (图18B)的芯片肠中培养了 20h的Caco-2单层的垂直剖面的共聚焦荧光视图证明，较高的流速(30μ L/hr-100 μ L/hr)特异性诱导柱状上皮的形成和极化。图18C描绘了对在不存在机械应变的情况下，在10 μ L/hr或100 μ L/hr下培养的Caco-2细胞的平均高度进行的定量(*，ρ〈0.0001，比例尺:20μπι)。
[0043]图19描绘了对单独培养的活LGG细胞和Caco_2细胞中的β -半乳糖苷酶活性的评估。活LGG细胞活跃地(actively)裂解β -半乳糖苷酶底物0NPG，并造成邻硝基苯酚产物的光密度逐步增高(实心圆);而人Caco-2上皮细胞并未显示出任何特异性的β -半乳糖苷酶活性(实心方形)。在所有时间点上，LGG相对于Caco-2细胞的活性差异都具有显著性(ρ〈0.001)。
[0044]图20描绘了适于本文所述的系统的自动化控制的计算机系统的示意图。
[0045]图21描绘了如本文所述的系统的一个实施方式的图解视图。
[0046]图22k-图22D描绘了可用于对本文所述的系统的膜施加应变的替代机制的一些实例。
[0047]图23描绘了本文所述的系统的一个实施方式的示意图。虚线圈中的数字为对具体特征的测量值(以4 111计)。【具体实施方式】
[0048]为了方便起见，此处收集了本文在申请文件、实施例和所附权利要求中所用的若干术语。除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出，下列术语和短语不排除所述术语或短语在其所属领域已具有的含义。提供所述定义以辅助描述【具体实施方式】，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不意味着限制所请求保护的发明。除非另有定义，本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属【技术领域】中的一般技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0049]本文所使用的术语“包含/包括(comprising或comprises)”涉及组合物、方法及其各自的组成部分，所述组成部分对所述方法或组合物是必要的，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。
[0050]本文所使用的术语“基本上由…组成”涉及给定的实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响该实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的要素。
[0051]术语“由…组成”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。
[0052]除非上下文中明确地另有所指，本申请文件和所附权利要求中所用的单数形式“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。因此，例如，提及“所述方法/该方法(the method)”时，其包括一种或多种本文中所述的方法和/或步骤类型和/或本领域技术人员阅读本公开后将变得显而易见的方法和/或步骤类型等。相似地，除非上下文明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本文公开的实践或测试中，合适的方法和材料在下文中有所描述。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempli gratia),并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
[0053]细胞生物学和分子生物学中常用术语的定义可在如下著作中找到:“The MerckManual of Diagnosis and Therapy，，，第 19 版，Merck Research Laboratories 出版，2006 (ISBN0-911910-19-0) ；Robert S.Porter 等(著)，The Encyclopedia of MolecularBiology, Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN0-632-02182-9) ；Crowther J.R.的The ELISA guidebook (Methods in molecular biologyl49) (2000)。分子生物学中常用术语的定义也可在如下著作中找到:Benjamin Lewin, Genes X, Jones&BartlettPublishing 出版，2009 (ISBN-10:0763766321) ;Kendrew 等(著)，Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。
[0054]除非另有说明，本发明使用标准程序完成，例如，所述标准程序在如下文献中有所描述:美国专利号:4，965, 343 和 5, 849, 954 ；Sambrook 等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual (第三版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y., USA (2001) ;Davis 等，Basic Methods in Molecular Biology, ElsevierScience Publishing, Inc.,New York, USA (1995)；Current Protocols in Cell Biology(CPCB) (Juan S.Bonifacino 等著，John Wiley and Sons, Inc.) ；R.1an Freshney 所著的Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,出版商:Wiley-Liss,第 5 版(2005);以及 Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology,第 57 卷，JennieP.Mather和David Barnes著,Academic Press,第一版，(1998),通过引用的方式将上述所有文献整体并入本文。
[0055]本文所使用的术语“降低(decrease)”和“减少(reduce/reduced/reduct ion)”通常都是指相对于参比而言减少有统计学显著性的量。然而，为避免疑义，“减少(reduce/reduction)”或“降低(decrease)”通常表示与缺乏给定处理的情况相比降低至少10%,并可包括例如，与缺乏给定处理的情况相比降低至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或上至并包括，例如，给定实体(entity)或参数的完全缺乏，或与缺乏给定处理的情况相比降低在10%-99%之间的任意量。
[0056]本文所使用的术语“增加(increased/increase)”或“增强(enhance)”通常都意味着增加有统计学显著性的量；为避免任何疑义，术语“增加(increased/increase)”或“增强(enhance)”表示相对于参比水平增加至少10%，例如，增加至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或上至并包括增加100%，或相对于参比水平增加在10%-100%之间的任意量；或相对于参比水平增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍，或相对于参比水平增加在2倍-10倍之间的任意量，或增加更大量。
[0057]本文所使用的术语“维持(maintaining)”或“培养(culturing)”是指使组织或细胞群的生活力继续。被维持的组织将具有代谢活跃的细胞群。这些细胞的数量能在至少3天的时间内大致稳定或能够增长。
[0058]本文使用的术语“ 微流控装置”和“微流控芯片”可互换使用，是指具有包含于其中或其上的微流控结构的结构或基底。在一些实施方式中，芯片能够以可拆卸的方式连接至微流控系统。
[0059]本文所使用的术语“干细胞”表示未分化的、并具有分化成所期望细胞类型(例如内皮细胞或肠上皮细胞)能力的细胞。
[0060]本文所使用的术语“胚胎干细胞”是指具有全能性(totipotent)并且来源于受精之后妊娠结束前所形成的组织的细胞，所述组织包括取自妊娠期间任意时间(通常但没必要非在约10-12周妊娠前)的胎儿组织、胚胎前期组织(例如，囊胚)或胚胎组织。胚胎干细胞可直接从适合的组织(包括但不限于人组织)或从已建立的胚胎干细胞系中获得。在一个实施方式中，根据Thomson等所述获得胚胎干细胞(美国专利号5，843，780和6，200, 806 ；Science282:1145，1998 ；Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff，1998 ；Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.92:7844，1995，通过引用的方式将其整体并入本文)。
[0061]本文所使用的术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”可互换使用，是指来源于已分化的细胞的多能细胞。例如，根据Takahashi等所述的方法(Cell，126:663-676，2006)，iPSC可通过过表达转录因子(如0ct4、Sox2、c-Myc以及Klf4)而获得。其它用于生成iPSC的方法在例如如下文献中有所描述:Takahashi等，Cell, 131:861-872，2007和Nakagawa等，Nat.Biotechnol.26:101-106，2008，通过引用的方式将其整体并入本文。
[0062]术语“统计显著(statisticallysignificant)”或“显著地(significantly)”表示统计显著性，并且通常意味着正常或较低的标志物浓度以下两个标准差(2SD )。这个术语表示统计学上存在差异的证据。它被定义为当无效假设实际上是真时做出做出否决该无效假设的决定的可能性。通常利用P值来作出决定。
[0063]除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1%。
[0064]除非文中明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非上下文明确地另有所指，词语“或(or)”意在涵盖“和(and)”。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本文公开的实践或测试中，合适的方法和材料在下文中有所描述。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempli gratia),并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
[0065]在本文中，在对本发明的各方面的描述中对其它术语进行定义。
[0066]在整个申请文件和附图中，本文所述的细胞培养系统可互换地被称为“芯片肠”。图5描绘了本文所述的细胞培养系统的一个实施方式。根据本文所述的发明的一些实施方式，所述细胞培养系统可包含流控装置，所述流控装置具有连接至流体源的流体通道10，所述流体源供应流体至流体通道10。流体通道10的大小和形状可根据所需类器官的大小和形状和/或待提供的流体的体积和流速而改变。
[0067]本文所使用的“流控装置”是指具有任意大小或取向(orientation)的装置，所述装置包含一个或多个流体通道，并适合于活细胞培养。在下文所述的流体流动范围内，所述流控装置能够移动任意量的流体，例如，流控装置可以是微流控装置或是能够移动较大体积流体的装置。本文所使用的术语“通道”是指位于基底内或基底上的任何毛细管、通道、管(tube)或槽(groove)。通道可以是微通道`，即大小适于微体积的液体通过的通道。
[0068]流体源可以是含有一定体积流体的储液池(reservoir)或其它容器，以致于使流体可从流体源中流出并流经流控装置的一个或多个通道。可通过任何引导流体的手段(例如管线、管道(piping)、通道等)将所述流体源连结至流控装置的一个或多个通道。流控装置和/或流体源可包含端口(port)。本文使用的术语“端口 ”是指本文所述的细胞培养系统的一部分，该部分为流体和/或细胞进入或/离开系统、和/或进入和/或离开系统的一部分提供途径。所述端口可具有接纳和/或固定(secure)与流控系统或微流控系统的管、连接件(connection)、或转接件(adaptor)的连接的尺寸和形状，并且在与流控系统或微流控系统相连时允许流体和/或细胞通过。
[0069]根据本发明的多种实施方式，流体穿过流体通道10从流体源流向流体收集储液池(未示出)。无论是正流体压力或负流体压力，还是两者皆有，均可用于引起流体流过流体通道10。根据本发明的一些实施方式，可对流体源中的流体加压，并可在流体源和流体通道10之间提供阀门以控制流体向通道的流入。根据本发明的一些实施方式，可将真空源连接至流体通道10的出口端口，以牵引流体流过流体通道10。根据本发明的一些实施方式，可用重力来使流体流过流体通道10。例如，可抬高流体源至装置上方，并将流体收集储液池置于所述装置下方，从而提供使得流体流过流体通道10的流体压力。可用处于流体源处或流体流路中的阀门来控制流体的流速。根据本发明的一些实施方式，可用一个或多个泵来使得流体从流体源流经流体通道10。
[0070]为说明的目的，图21示出了根据本发明的一个实施方式的系统100的图解视图。系统100可包含连接至微流控装置5 (例如，如在图3、图5、图6和图12中所示的)的一个或多个流体源(例如，32和34)，所述微流控装置5包含可连接至一个或多个流体收集储液池(例如，36和38)的一个或多个流体通道10。在一些实施方式中，流体源32和流体源34可以是容纳和供应流体的简单塑料容器，或可以是具有两个以上分隔区室的容器以容纳和供应不同的流体。在一些实施方式中，可通过将源容器连接至加压气体52(例如，空气或其它非活性气体)或其它流体(例如，水、介质)供给来对流体源34加压，所述压力使得流体流出源34，进入装置5，并流过流体通道10。在这一实施方式中，源容器可以是足以承受压力的密封的金属容器或塑料容器。在一些实施方式中，可将流体收集储液池38连接至真空源54，所述真空使得流体流入装置5，并经流体通道10流向流体收集储液池38。除加压或真空外或作为加压或真空的替代，可抬高流体源32、流体源34的容器，从而对微流控装置5提供正压。在本发明的一些实施方式中，可提供阀门44和阀门48来控制经过装置5的流体流动。可将阀门44和阀门48连接至控制系统(例如，计算机系统700)，以允许对阀门和流体流动进行自动化控制。
[0071]在本发明的一些实施方式中，所述系统可包含一个或多个泵42、泵46，以将流体从流体源32泵至微流控装置5，并经流体通道10流至流体收集储液池36。在本发明的一些实施方式中，可以使用一个泵(例如，42或46)。在本发明的其它实施方式中，可以使用两个以上的泵42和泵46。可将泵42和泵46连接至控制系统(例如，计算机系统700)，以允许对泵和流体流动进行自动化控制。泵42和泵46可以是任何动力式泵(dynamic pump)或容积式泵(displacement pump),例如,注射泵、螺动泵和正排量容积式泵。
[0072]根据本文所述的发明的一些实施方式以及如图5中所描绘的，细胞培养系统可进一步包含膜20，该膜20设置于通道中并附着(attached to)至一个或多个膜支持元件22、膜支持元件24。在一些实施方式中，膜20可将流体通道10分成第一细胞培养通道12和第二细胞培养通道14。第一细胞 培养通道和第二细胞培养通道可以是任意取向。通过非限制性实例的方式，分隔细胞培养通道的膜20可沿单个平面水平延展，例如图5中所描述的，以使得一个细胞培养通道位于另一个细胞培养通道的正上方。或者，分隔细胞培养通道的膜20可沿单个平面垂直延展，以使得两个细胞培养通道处于并排排列，而不是一个通道在另一个通道的上方。或者，分隔细胞培养通道的膜20可以是管状膜和/或柱状膜，以使得第一细胞培养通道位于由膜所形成的管内，而第二细胞培养通道包括了膜和流体通道10的壁之间的空间。根据本文所述的细胞培养系统的一些实施方式，膜支持元件可连结至膜应变机制26，该应变机制26能够移动膜支持元件并引起膜沿膜的至少一个维度拉伸。
[0073]在一些实施方式中，所述膜为至少部分柔性的。在一些实施方式中，所述膜在至少一个维度上是柔性的，例如，所述膜可在一个维度、或两个维度、或三个维度上被拉伸。膜可由任何部分柔性的生物相容性材料制成。在一些实施方式中,所述膜可由PDMS制成。生物相容性材料的更多实例在下文中描述。
[0074]在一些实施方式中，所述膜为至少一部分多孔的。在一些实施方式中，所述膜的孔直径可为0.5 μ m-10 μ m。在一些实施方式中，所述膜的孔直径可为约10 μ m。在一些实施方式中，所述膜的孔直径可为约5μπι。在其中需要细胞跨膜迁移(例如免疫细胞)的实施方式中，直径约为5μπι的孔特别有用。在一些实施方式中，所述孔可以是不规则间隔的。在一些实施方式中，所述孔可以是规则间隔的。在一些实施方式中，所述孔可间隔5μπι或更远，例如，间隔5 μ m、间隔10 μ m、间隔25 μ m、间隔50 μ m、间隔100 μ m、间隔1000 μ m、间隔5mm或间隔更远。
[0075]在一些实施方式中，所述膜可以是平面的。在一些实施方式中，所述膜可以是柱状的。在一些实施方式中，所述膜的厚度为15 μ m以上，例如，厚度为15 μ m以上、厚度为20 μ m以上、厚度为25μπι以上、厚度为30μπι以上、厚度为35μπι以上或厚度为40μπι以上。在一些实施方式中，所述膜的厚度可为15μηι-40μηι。在一些实施方式中,所述膜的厚度可为25 μ m-30 μ m。在一些实施方式中，所述膜的厚度可为约30 μ m。[0076]在一些实施方式中，膜20附着至流体通道中的至少两个膜支持元件22、24。本文所用的“膜支持元件”是细胞培养系统中膜附着的部分。膜支持元件可以是流体通道的壁或单独的结构(例如支柱(post)、一系列支柱、夹钳(clamp)、或流体通道包含的端口)。在一些实施方式中，膜支持元件22、膜支持元件24可以改变位置、改变取向和/或弯曲，由此向膜20给予应变或移动。在一些实施方式中，至少一个膜支持元件连结至膜应变机制。在一些实施方式中，第一膜支持元件连结至膜应变机制，第二支持元件不连结至膜应变机制。在一些实施方式中，两个以上膜支持元件连结至膜应变机制。本文所用的“膜应变机制”是指引起膜支持元件22、膜支持元件24改变位置、改变取向和/或弯曲的手段，由此引起膜在至少一个方向上拉伸。膜应变机制可以通过移动或弯曲膜支持元件引起膜拉伸。膜应变机制的非限制性实例包括连接至泵、活塞等的流体腔室、真空腔室等。
[0077]如图3、图5、图6和图12所示，膜应变机制可包含一个或多个真空腔室26，该真空腔室26引起流体通道10的壁22、壁24向外弯曲，从而使得附着在所述壁上的膜20在流体通道10的壁22和壁24间被拉伸。在另一个实施方式中，膜20可以在静止位置(in therest position)在流体通道10的壁22和壁24之间拉伸，并可对腔室26施加正压以引起壁22和壁24向内弯曲，从而减少和/或去除膜20上的应变。也可以用其它机制来对膜20施加应变。根据本发明，可在流体通道10周围提供其它通气腔室(pneumatic chamber),以在膜20上提供局部应变、或者沿不同维度对膜20施加应变。
[0078]图22A-图22D示出了可用于给膜20上施加应变的另一个机制的一些实例。图22A示出了本发明的一个实施方式，其中，膜20附着至装置5的壁22和壁24，并且所述壁22和壁24中的一个或两个为柔性的且连接至马达(motoiOM，这使得所述壁能够弯曲，从而在膜20上施加应变。根据本发明，马达M可以是能够对壁22和壁24施力的任何装置，包括例如气缸或液压缸、电动马达和导螺杆(lead screw)、或缆索(cable)和滑轮(pulley)、或螺线管(solenoid)。在需要额外的力的情况下,可使用利用杠杆和/或机械效益(mechanicaladvantage)的机制，例如偏心机制(over-center mechanism)。
[0079]根据本发明的另一个实施例，马达M例如可通过如图22B所示的流体通道10中的狭槽(slot)或其它开口直接连结至自由被拉伸的膜20。可提供密封以防止流体从流体通道10渗漏出。在一些实施方式中，可将所述膜连结至缆索或绳索(cord)，可将所述缆索或绳索拉紧以给膜上施加应变，并且可提供一个或多个滑轮以使得所述缆索或绳索易被拉紧。例如，可通过用电动马达将缆索或绳索缠绕在滑轮上，来拉紧缆索和绳索。在另一个实施方式中，可通过将膜20缠绕在平行于膜20的一个边缘延伸的轴(shaft)上对膜20施加应变。
[0080]根据本发明的另一个实施方式，流体通道10可由两个刚性元件22和24形成，其中，一个元件22在另一元件24内滑动(如图22C所示)。如前文所述,可用马达M来使元件22相对于元件24移动，并对膜20施加应变，所述膜20连结至或附着于元件22和元件24的另一边缘。在一些实施方式中，可将沿重叠表面的密封件或波纹管(bellows)用于对流体通道10进行密封。
[0081]根据本发明的另一个实施方式,流体通道10可由柔性壳(housing)形成,其中，膜20在两侧壁22和24之间延伸。在这一实施方式中，可对流体通道10的顶部和/或底部施力，以引起所述侧壁22和侧壁24向外弯曲，从而对膜20施加应变。造成应变的力可由流经流体通道10的流体来给予帮助，其将使顶壁和底壁一起向侧面延伸。如图22D所示，在这一实施方式中，可将侧壁22和侧壁24配置成沿侧壁的预先设定部分弯曲，例如，侧壁22和侧壁24接触流体通道10的顶壁和底壁的地方，以及膜20连结至或附着至侧壁22和侧壁24的地方。在这一实施方式中，例如可沿流体通道10的纵轴(从入口端口延伸至出口端口)对流体通道顶部和/或底部循序(sequentially)施加压力，以模拟螺动运动。
[0082]在图5所示的实施方式中，膜支持元件22和膜支持元件24包含流体通道10的第一壁和第二壁，并且膜应变机制26是真空腔室。所述膜安装至第一腔室壁(第一膜支持元件)22和第二腔室壁(第二膜支持元件)24。各操作通道26邻接于各膜支持元件22和膜支持元件24，从而使得相对于流体通道10和另一操作通道26而言，操作通道26位于膜支持元件22和膜支持元件24的另一侧。通过真空对各操作通道26施加压力差(相对于流体通道10)，从而引起膜支持元件向所需方向弯曲，由此引起膜20朝该方向扩张或收缩。各操作通道26连接至能提供压力差的真空系统。操作通道26可连接至同一真空系统或不同的真空系统。操作通道26可经由操作通道中的端口和管线连接至真空系统。
[0083]在一些实施方式中，使膜拉伸0%_50%。在一些实施方式中，使膜拉伸5%_15%。在一些实施方式中，使膜拉伸约10%。在一些实施方式中，为了产生肠上皮细胞的异常状况和/或状态，使膜拉伸大于15%。在一些实施方式中,所述膜能够拉伸超过20%。在一些实施方式中，可使膜以无规律的方式或间歇性的方式拉伸。在一些实施方式中，可使膜以周期性的方式拉伸。在一些实施方式中，可使膜以频率为0.01Ηζ-2Ηζ的周期性方式拉伸。在一些实施方式中，可使膜以频率为0.05Hz-0.25Hz的周期性方式拉伸。在一些实施方式中，可使膜以频率低于0.2Hz的周期性方式拉伸。在一些实施方式中，可使膜以频率为0.01Hz-0.18Hz的周期性方式拉伸。在一些实施方式中，可使膜以频率为约0.15Hz的周期性方式拉伸。在一些实施方式中，可使膜以频率为约0.15Hz的周期性方式拉伸。在一些实施方式中，为了产生肠上皮细胞的异常状况和/或状态(例如建立肠过强收缩(hypercontractility)的模型)，可使膜以频率为大于0.2Hz的周期性方式拉伸。
[0084]在一些实施方式中，细胞培养系统可以是微流控系统。本文所用的术语“微流控系统”是指能够进行微升和/或纳升体积的流体操作的机器。如图12B所示的细胞培养系统的实施方式所描绘的，微流控系统可包含微流控芯片50，所述微流控芯片50可至少包含本文所述的细胞培养系统的通道以及膜元件。在本发明的一些实施方式中，可对芯片50的大小和形状进行选择，以使所述芯片能够用于特定的微流控系统。在一些实施方式中，可对芯片50的大小、形状和构造进行选择，以使所述芯片可用来替代特定的微流控系统中由制造者或供应者提供的其它芯片。在一些实施方式中，芯片50可包含一个或多个入口端口 60，所述入口端口 60通过一个或多个微流控通道10连接至一个或多个出口端口 62。可提供必要的合适大小和形状的端口 60和端口 62，来接纳特定微流控系统的管和/或连接件。在一些实施方式中，可将(一个或多个)入口端口 60和(一个或多个)出口端口 62连接，以使进入(一个或多个)入口端口 60的流体在到达(一个或多个)出口端口 62前能够经过部分或全部的(一个或多个)流体通道10。在一些实施方式中，可将多个端口连接至流体通道。在图12B中所描绘的实施方式中，两个细胞培养通道各自宽1，000 μ m、长10，000 μ m、高150 μ m。操作通道44和操作通道46高330 μ m、宽1，684 μ m、长9，089 μ m。膜20是30 μ m厚、并具有直径为10 μ m且间距为25 μ m (从中心到中心进行测量)的孔的PDMS膜。在一些实施方式中，芯片 50 可为 15, 000 μ m 宽、25，000 μ m 长、5，000 μ m 高。
[0085]图23描绘了本文所述系统的一个实施方式。在这一实施方式中，流体通道10为1,000 μ m宽、 .10，000 μ m长、330 μ m高；两个细胞培养通道各自为1，000 μ m宽、10，000 μ m长、150μπι高。真空腔室26为1，684 μ m宽、9，089 μ m长、330 μ m高。膜20为30μπι厚、并具有直径为10 μ m且间距为25 μ m (从中心到中心进行测量)的孔的PDMS膜。
[0086]可用比例限定流体通道10与细胞培养通道12和细胞培养通道14的尺寸。在一些实施方式中，流体通道10的高宽比可为1:2以上，例如1:2以上、1:2.5以上、1:3以上或1:35以上。在一些实施方式中，流体通道10的高宽比约为1:3。在一些实施方式中，流体通道10的高宽比可为1:5以上，例如，1:5以上、1:10以上、1:20以上或1:30以上。在一些实施方式中，流体通道10的高宽比可约为1:30。在一些实施方式中，流体通道10的宽度与真空腔室26的宽度比可为1:0.75以上，例如，1:0.75以上、1:1以上、1: 1.25以上、1:1.5以上或1:1.75以上。在一些实施方式中，流体通道10的宽度与真空腔室26的宽度比可为1:1至1:2。在一些实施方式中，流体通道10的宽度与真空腔室26的宽度比可约为1:1.68。
[0087]在一些实施方式中，细胞培养通道12以及细胞培养通道14的宽高比可为1:5以上，例如，1:6以上、1:7以上、1:10以上、1:15以上、1:20以上或1:30以上。在一些实施方式中，细胞培养通道12以及细胞培养通道14的宽高比可为1:6至1:20。在一些实施方式中，细胞培养通道12以及细胞培养通道14的宽高比可约为1:10。在一些实施方式中，细胞培养通道12以及细胞培养通道14的高宽比可为1:5以上，例如，1:5以上、1:6以上、1:7以上、1:8以上、1:10以上或1:15以上。在一些实施方式中，细胞培养通道12以及细胞培养通道14的高宽比可为1:5至1:10。在一些实施方式中，细胞培养通道12以及细胞培养通道14的高宽比可约为1:6.67。在一些实施方式中，细胞培养通道12以及细胞培养通道14的高宽比可为1:20以上，例如，1:20以上、1:25以上、1:30以上、1:40以上、1:50以上、1:60以上、1:70以上、1:80以上1:100以上。在一些实施方式中，细胞培养通道12以及细胞培养通道14的高宽比可为1:20至1:100。在一些实施方式中，细胞培养通道12以及细胞培养通道14的高宽比可约为1:66.67。
[0088]本文所述的细胞培养系统的结构(例如，膜、端口和/或膜支持结构)例如可通过刻蚀、3-D打印、加工(machining)或微加工形成。在一些实施方式中，本文所述的细胞培养系统是非刻蚀的。在一个实施方式中，图12B中所描绘的细胞培养系统的实施方式可按如下方式形成。所述细胞培养系统可由柔性透明的聚二甲基硅氧烷(PDMS ；Sylgard,Dow Corning)聚合物制成。对齐的(aligned)上下层微通道可具有相同的大小(150 μ m高X 1，OOO μ m宽)，并由30 μ m厚的PDMS膜分隔，该PDMS膜具有直径为10 μ m、间距为25 μ m(中心至中心)的圆孔(图12A-图12C)。如图13中所示，可通过在微加工的反向通道设计(inverse channel design)的模具(由光刻胶(SU-8100, Microchem, Newton, MA)制成)上浇注PDMS预聚物(PDMS与固化剂之比为15:lw/w)，分别对上下微通道层进行制备。多孔膜(图12C，右侧插图)可通过如下步骤制备:在微加工的硅片(包含圆柱的柱阵列)(ΙΟμπι直径 X 30 μ m 高，间距 25? μ m ;MEMS and Nanotechnology Exchange, Reson, VA)上烧注 PDMS预聚物，用固化的、平的、硅烷化的PDMS支持层覆盖所述预聚物，在该装置(setup)上放置3kg的重物，然后将该聚合物在60°C下固化12小时。在将多孔PDMS膜和支持层从所述片上剥离后，可将多孔膜的表面暴露于由实验室电晕处理机(laboratory corona treater,BD-20AC, Electro-Technic Products, Inc., Chicago, IL)生产的等离子体，上层微通道层也可进行相同处理。然后，可立即将多孔PDMS膜和上层微通道层的等离子处理表面放置为共形接触(conformal contact)。整个装置在80°C下的过夜孵育使得两个PDMS层不可逆地粘合。然后，可将PDMS支持层自PDMS多孔膜底部剥离，并将该膜位于旁边真空腔室的部分用镊子撕除，以形成全高度中空的真空腔室。随后可将经撕除的PDMS膜所暴露的表面和下层PDMS微通道层(与上层形状相同)的上表面暴露于等离子体,在立体镜(Zeiss DiscoveryV20Stereo Microscope, Carl Zeiss MicroImaging Gmb,Germany)下将其对齐、压在一起，然后在80°C下过夜固化，从而制成整个粘合装置，所述装置在主微通道的两侧各有中空的真空腔室(图12A和图13)。可使用无针座(hub-free)不锈钢钝头针(18G ;Kimble Chase,Vineland, NJ)将管线(Tygon3350silicone tubing, ID1/32”，0D3/32”，Beaverton, MI)由流体介质和真空源分别连接至上层微流控通道和下层微流控通道。这允许对中央微通道中培养基的流动进行控制，并允许在计算机控制下对向侧面通道施加的真空进行调节，以产生周期性机械应变，从而模拟蠕动运动(图12D)。
[0089]根据设计和应用需求，本文所述的细胞培养系统可由生物相容性柔性材料或生物相容性非柔性材料构成。应该注意的是，图中所描绘的设计是示例性的，本文所述的细胞培养系统不限于图中所示 的构造。该细胞培养系统和/或其部分可由柔性材料构成，所述柔性材料包括但不限于生物相容性材料，例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚氨酯(polyurethane)或聚酰亚胺。该细胞培养系统和/或其部分也可由非柔性材料(例如，玻璃、硅、聚砜类、硬塑料等，以及上述材料的组合)构成。
[0090]生物相容性聚合物是指对生物功能没有毒性作用或伤害作用的材料。生物相容性聚合物包括天然聚合物或合成聚合物。生物相容性聚合物的实例包括但不限于胶原蛋白，聚(α-酯)如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚原酸酯、聚酸酐和上述物质的共聚物，聚乙醇酸和丙交酯乙交酯共聚酯(polyglactin)，纤维素醚，纤维素，纤维素酯，氟化聚乙烯(fluorinated polyethylene),酹醒树脂(phenolic),聚~4~甲基戍烯，聚丙烯腈，聚酰胺，聚酰胺酰亚胺(polyamideimide),聚丙烯酸酯,聚苯并噁唑,聚碳酸酯，聚芳醚腈(polycyanoarylether),聚酯，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮(polyetheretherketone),聚醚酰亚胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟烯烃(polyfluoroolefin),聚酰亚胺,聚烯烃，聚噁二唑(polyoxadiazole),聚苯醚(polyphenylene oxide),聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，多硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚，聚三唑(polytriazole),聚氨酯，聚乙烯，聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride),再生纤维素,聚硅氧烷(silicone),脲醒(ureaformaldehyde),丙交酯乙交酯共聚酯或上述材料的共聚物或物理共混物(blend)。
[0091]生物相容性材料例如还可以是金属基底上的陶瓷涂层。但是，任何类型的涂层材料和涂层可由如下不同类型的材料构成:金属、陶瓷、聚合物、水凝胶或上述材料的任意组合。生物相容性材料包括但不限于氧化物、磷酸盐/酯(phosphate)、碳酸盐/酯(carbonate)、氮化物或碳氮化物(carbonitride)。在氧化物中，下列氧化物为优选:钽氧化物、铝氧化物、铱氧化物、锆氧化物或钛氧化物。基底由如下材料构成:例如，金属、陶瓷、聚合物或这些物质的任意组合。金属(例如不锈钢、镍钛合金(Nitinol)、钛、钛合金或铝)以及陶瓷(例如氧化锆，氧化铝或磷酸钙)为特别感兴趣的。
[0092]可使用以下方法使生物相容性聚合物成形:例如,溶剂烧铸(solvent casting)、压塑成型(compression molding)、拉细丝(filament drawing)、格栅(meshing)、浙滤(leaching)、织造(weaving)和涂覆。在溶剂烧铸中，将处于合适的溶剂(例如二氯甲烧)中的一种或多种聚合物的溶液烧铸为分支模式的浮雕结构(branching pattern reliefstructure)0溶剂蒸发后得到薄膜。在压塑成型中，将聚合物在上至30，000磅每平方英寸的压力下压制成合适的图案。拉细丝涉及由熔融聚合物拉丝，而格栅涉及通过将纤维压缩成毡状(felt-like)材料而形成格栅。在浙滤中，将含有两种材料的溶液铺展成接近RUG最终形式的形状。然后，使用溶剂将其中一种组分溶解掉以形成孔(见Mikos，美国专利号5，514，378，在此通过引用的方式将其并入)。在成核(nucleation)中，将RUG形状的薄膜暴露于放射性裂变产物(radioactive fission products),所述放射性裂变产物产生福射损坏材料(radiation damaged material)的径迹(track)。然后,用酸或碱对聚碳酸酯板进行蚀刻，使得辐射损坏材料的径迹变成孔。最后，可用激光穿过多种材料对各洞进行成形和灼烧，以形成具有均一孔大小的RUG结构。涂覆是指用材料(例如，液化的共聚物(聚-DL-丙交酯-共一乙交酯50:5080mg/mL 二氯甲烧))涂覆或渗透聚合物结构，以改变该结构的机械性能。可在一层或多层进行涂覆，直到获得所需的机械性能。可将这些成形技术组合使用，例如，可对聚合物基质同时进行织造、压塑成型以及胶合。此外，可将经不同工艺而成形的不同聚合物材料结合在一起形成复合形状(composite shape)。该复合形状可为层状(laminar)结构。例如，可使聚合物基质附着于一种或多种聚合物基质，以形成多层聚合物基质结构。附着可通过以液态聚合物胶合或缝`合(suturing)完成。此外,可将所述聚合物基质制成固体块状，并用激光或其它标准加工技术将其塑造成其所需的最终形式。激光成形是指使用激光除去材料的过程。
[0093]流经本文所述的细胞培养系统的一个或多个流体通道的流体可是适于对肠细胞进行维持或培养的任何流体。在一些实施方式中，流体通道被分为第一细胞培养通道和第二细胞培养通道，并可使得相同流体或不同流体流经各通道。如果第一细胞培养通道含有肠上皮细胞，流经第一细胞培养通道的流体可为适于对肠上皮细胞进行维持或培养的流体。如果第二细胞培养通道含有内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞，流经第二细胞培养通道的流体可为适于对内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞进行维持或培养的流体。如果细胞培养系统中存在微生物细胞，流体应为适于对微生物细胞进行维持或培养的流体，例如，所述流体不应含有微生物细胞对其敏感的抗生素。流体可含有细胞培养基、溶液、缓冲液、营养物、示踪化合物、染料、抗微生物剂或对将在本文所述的细胞培养系统中培养的细胞不具毒性的其它化合物。本领域普通技术人员非常清楚适于对肠细胞、肠上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞、以及微生物细胞进行培养或维持的流体。通过非限制性实例的方式，适于对肠上皮细胞进行维持或培养的流体可包括:含有4.5g/L葡萄糖、且补充有20%胎牛血清(FBS ;Gibco )、100单位/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素(Gibco)、100 μ g/mL NormocinC Invivogen, San Diego, CA)以及 25mM HEPES 的 Dulbecco，s Modified Eagle Medium (DMEM ;Gibco, Grand Island, NY);或含有 4.5g/L 葡萄糖、且补充有 20% 胎牛血清(FBS ;Gibco)以及 25mM HEPES 的 Dulbecco’s Modified EagleMedium(DMEM ；Gibco, Grand Island, NY)。
[0094]在一些实施方式中，流经细胞培养系统的一个或多个腔室的流体受到剪切应力。在一些实施方式中，可对流体流动和/或系统设计进行调整来获得所需的剪切应力。在一些实施方式中，流体在细胞培养系统的一个或多个腔室中所经受的剪切应力可为与在哺乳动物的肠中遇到的剪切应力等同的剪切应力。在一些实施方式中，流体在细胞培养系统的一个或多个腔室中所经受的剪切应力可为与在患有肠紊乱的哺乳动物的肠中遇到的剪切应力等同的剪切应力。通过非限制性实例的方式，肠紊乱可为疾病或梗阻(blockage)。在一些实施方式中，剪切应力可小于或等于0.3dyne/Cm2。在一些实施方式中，剪切应力可小于0.ldyne/cm2。在一些实施方式中，剪切应力可为0.0008dyne/cm2至0.08dyne/cm2。在一些实施方式中，剪切应力可为0.010dyne/cm2至0.026dyne/cm2。在一些实施方式中，剪切应力可约为0.018dyne/cm2。在一些实施方式中，可对剪切应力和/或流体流速进行调节，来产生肠上皮细胞的异常状态和/或状况，例如，建立肠腔内容物的“排出(flush-out)”模型。
[0095]在一些实施方式中，在肠上皮细胞在细胞培养系统中培养期间,剪切应力可大致相同。在一些实施方式中，在肠上皮细胞在细胞培养系统中培养期间，剪切应力可增大和/或减小，例如，剪切应力可减小一段时间，以使新加入的细胞能贴附至膜和/或已存在的细胞。在一些实施方式中，剪切应力可以以有规律的、周期性的模式变化。在一些实施方式中，剪切应力可以以无规律的模式变化。在一些实施方式中，剪切应力可随时间从Odyne/cm2变化至1000dyne/cm2。在一些实施方式中，剪切应力可随时间从0.0008dyne/cm2变化至 0.08dyne/cm2。
[0096]在一些实施方式中，流经本文所述的细胞培养系统的一个或多个通道的流体流速可为与在哺乳动物的肠中遇到的流体流速等同的流体流速。在一些实施方式中，细胞培养系统的一个或多个腔室中的流体流速可为与在患有肠紊乱的哺乳动物的肠中遇到的流体流速等同的流体流速。通过非限制性实例的方式，肠紊乱可为疾病或梗阻。在一些实施方式中，流体流速可小于或等于500μ L/hr，例如，其可为500μ L/hr、400y L/hr、300y L/hr、200 μ L/hr> 100 μ L/hr>50 μ L/hr> 10 μ L/hr或更低。在一些实施方式中，流体流速可小于或等于100 μ L/hr。在一些实施方式中,流体流速可小于或等于50 μ L/hr。在一些实施方式中，流体流速可为O μ L/hr-50 μ L/hr。在一些实施方式中，流体流速可小于40 μ L/hr。在一些实施方式中，流体流速可小于35 μ L/hr。在一些实施方式中，流体流速可为O μ L/hr-39 μ L/hr。在一些实施方式中，流体流速可为O μ L/hr-35 μ L/hr。在一些实施方式中，流体流速可为O μ L/hr-30 μ L/hr。在一些实施方式中，流体流速可约为30 μ L/hr。在一些实施方式中，在肠上皮细胞在细胞培养系统中培养期间，流体流速可大致相同。在一些实施方式中，在肠上皮细胞在细胞培养系统中培养期间，流体流速可增大和/或减小，例如，流体流速可减小一段时间，以使得新加入的细胞能贴附至膜和/或已存在的细胞。在一些实施方式中，流体的流速可以以有规律的、周期性的模式变化。在一些实施方式中，流体流速可以以无规律的模式变化。
[0097]在一些实施方式中，对从流体源流经流体通道10的流体流动或膜应变机制26进行的控制可为自动化的。在对来自流体源的溶液的流动或膜应变机制的控制为自动化的实施方式中，可使用注射泵或螺线管。在其它实施方式中，可将一个或多个计算机设备或系统用于控制流体流动或膜应变机制26。可替代地或附加地，可将计算机装置连结至流体源或端口 60，以对来自流体源的流体流动进行控制。可替代地或附加地，可将计算机装置连结至膜应变机制，以使膜支持元件22、膜支持元件24的移动和膜20的拉伸自动化。例如，可将计算机装置用于对真空操作通道中的压力进行控制。
[0098]图20示出了以计算机系统700为示例性形式的机器的图解表示，在该计算机系统700中，可执行引起机器对本文所述的流体流动或膜拉伸进行此类控制的一组指令。在另一个实施方式中，机器作为独立计算机装置进行操作，或可(例如通过联网)连接至其它机器。所述机器可包括个人计算机(PC)、平板电脑、个人数字助理(PDA)、移动电话、网络设备(web appliance)、网络路由器、交换机或桥接器，或能够执行一组指令(顺序执行或其它方式)的任何机器，所述指令指定该机器进行动作。此外，虽然仅表示出了一台机器，术语“机器”也应被理解为包括机器的任意集合，所述机器的集合单独地或联合地执行一组(或多组)指令，来实施本文讨论的一种或多种方法学。
[0099]根据一些实施方式，所述计算机系统700包含处理器750 (例如，中央处理单元CPU)、图形处理单元(GPU)或二者兼有)、主存储器760 (例如，只读存储器(ROM)、闪存、动态随机存取存储器(DRAM)(如同步DRAM (SDRAM)或Rambus DRAM (RDRAM)等)、和/或静态存储器770 (例如闪存、静态随机存取存储器(SRAM)等)，上述部分经由总线795彼此通讯。
[0100]根据一些实施方式，计算机系统700可进一步包含视频显示单元710 (例如，液晶显示器(IXD)、发光二极管显示器(LED)、电致发光显示器(ELD)、等离子体显示面板(PDP)、有机发光二极管显示器(0LED)、表 面传导电子发射显示器(SED)、纳米晶体显示器、3D显示器或阴极射线管(CRT))。根据一些实施方式，计算机系统700也可包含字母数字输入装置715 (例如，键盘)、光标控制装置720 (例如，鼠标或控制器)、磁盘驱动单元730、信号发生装置740 (例如，扬声器)和/或网络接口装置780。
[0101]磁盘驱动单元730包含在其上存储了一组或多组指令(例如，软件736)的计算机可读介质734，所述指令用以执行本文所述的任何一项或多项方法学或功能。在由计算机系统700、主存储器760和处理器750执行软件736的过程中，该软件736还可全部或至少部分驻留(reside)于主存储器760和/或处理器750中。处理器750和主存储器760也可分别构成具有指令754和指令764的计算机可读介质。软件736可进一步通过网络接口装置780在网络790内传输或接收。
[0102]尽管在示例性实施方式中示出的计算机可读介质734为单个介质，术语“计算机可读介质”应理解为包含存储一组或多组指令的单个介质或多个介质(例如，集中式数据库或分布式数据库和/或相关的缓存或服务器)。术语“计算机可读介质”也应理解为包括任何如下介质:所述介质能够存储、编码或携带用于由机器执行的一组指令，并使得机器执行公开的实施方式的任何一种或多种方法学。因此，术语“计算机可读介质”应理解为包括但不限于固态存储器、以及光介质和磁介质。
[0103]应理解的是，本文所述的关于对流体流动和膜应变机制进行自动化控制的过程和技术并非固有地与任何特定仪器相关联，并可由组件的任意合适组合实施。此外，根据本文所述的教导，可使用多种类型的通用装置。构建专门的装置来实施本文所述的功能也可是有优势的。本领域技术人员将明白的是，硬件、软件和固件的多种不同组合都将适于实践所公开的实施方式。
[0104]在一些实施方式中，所述膜的至少一面涂覆有至少一种支持多个活细胞贴附的贴附分子。在一些实施方式中，所述膜的一面涂覆有至少一种支持多个活细胞贴附的贴附分子。在一些实施方式中，膜的两面均涂覆有至少一种支持多个活细胞贴附的贴附分子。在一些实施方式中，一种或多种贴附分子涂覆所述膜，例如，一种贴附分子、两种贴附分子、三种贴附分子、四种贴附分子或更多种贴附分子。在一些实施方式中，将贴附分子以凝胶、溶液、水凝胶、或不经由与膜化学结合而贴附于膜的其它组合物施加于膜上。在一些实施方式中，所述贴附分子化学结合至膜上，例如，共价键合或交联。在一些实施方式中，制成(例如聚合)在膜中嵌入有贴附分子的膜。在一些实施方式中，贴附分子可为细胞外基质的成分。在一些实施方式中，贴附分子可为由肠上皮细胞表面上的分子结合的分子。在一些实施方式中，贴附分子可为结合肠上皮细胞表面上的分子的分子。贴附分子类型的非限制性实例包括胶原蛋白、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、VIII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、X型胶原蛋白、XI型胶原蛋白、XII型胶原蛋白、XIII型胶原蛋白、XIV型胶原蛋白、细胞外基质、MATRIGEL?、层粘连蛋白、蛋白聚糖、玻连蛋白、纤连蛋白、聚D-赖氨酸、弹性蛋白、透明质酸、糖胺聚糖(glycoasaminoglycans)、整合素、多肽、寡核苷酸、DNA和/或多糖。在一些实施方式中，所述贴附分子获得自哺乳动物。在一些实施方式中，合成或从转基因生物中获得所述贴附分子。在一些实施方式中，所述贴附分子是人来源的。在一些实施方式中，所述贴附分子是哺乳动物来源的，例如，鼠科动物来源或灵长类动物来源的。本领域的一般技术人员非常清楚贴附分子的糖类和肽序列的合成或制备方法。贴附分子也为可商购获得的，例如MATRIGEL?(Cat No356234 ；BD Biosciences Franklin Lakes，NJ)或层粘连蛋白(Cat N0.354232 ；BD Biosciences Franklin Lakes, NJ)。在一些实施方式中，贴附分子的浓度可为10 μ g/mL 至 1，000 μ g/mL,例如，10 μ g/mL>50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL、300 μ g/mL、500 μ g/mL、l，000 μ g/mL或其间的任意值。在一些实施方式中，所述膜涂覆有包含I型胶原蛋白和MATRIGEL?的混合物。在一些实施方式中，所述膜涂覆有包含50 μ g/mL I型胶原蛋白和300 μ g/mL MATRIGEL?的混合物。在一些实施方式中，所述膜涂覆有包含50 μ g/mL I型胶原蛋白和SOOyg/mLMATRIGEL?的1:1 (v:v)混合物。在一些实施方式中，所述膜涂覆有包含溶于无血清DMEM中的50 μ g/mL I型胶原蛋白和300 μ g/mLMATRIGEL?的1:1 (v:v)混合物。在一些实施方式中，所述膜涂覆有包含溶于无血清DMEM中的50 μ g/mL来自大鼠的I型胶原蛋白和300 μ g/mL MATRIGEL?的1:1 (v:v)混合物。
[0105]在本文所述的细胞培养系统的一些实施方式中，至少一层肠上皮细胞贴附至膜的至少一个表面。在一些实施方式中，一层或多层肠上皮细胞贴附至膜，例如，一层肠上皮细胞、两层肠上皮细胞、三层肠上皮细胞、或更多层肠上皮细胞。在一些实施方式中，肠上皮细胞贴附至膜的一面。在一些实施方式中，肠上皮细胞贴附至膜的两面。在一些实施方式中，所述肠上皮细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方式中，肠上皮细胞为人细胞。在一些实施方式中，肠上皮细胞为原代细胞、原代小肠细胞、原代大肠细胞、小肠细胞、大肠细胞、培养的细胞、传代细胞、永生化细胞、转基因细胞、基因修饰的细胞、癌细胞或来自患有肠癌的动物的细胞、来自患有肠疾病或紊乱的动物的细胞、干细胞、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、潘氏细胞、隐窝细胞、粘液分泌细胞、Caco-2细胞或HT-29细胞。在一些实施方式中，本文所述的细胞培养系统中的肠上皮细胞含有绒毛结构。
[0106]在一些实施方式中，本文所述的细胞培养系统包含第一细胞培养通道和第二细胞培养通道，其中，第一细胞培养通道含有肠上皮细胞。在一些实施方式中，本文所述的细胞培养系统包含第一细胞培养通道和第二细胞培养通道，其中，第一细胞培养通道含有肠上皮细胞，第二细胞培养通道含有内皮细胞、免疫细胞、肌肉细胞和/或结缔组织细胞。在一些实施方式中，细胞培养通道中的细胞贴附至所述膜暴露于该细胞培养通道的表面。
[0107]在一些实施方式中，一层或多层内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞贴附至所述膜，例如，一层、两层、三层或更多层内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞。在一些实施方式中，所述内皮细胞为肠内皮细胞。在一些实施方式中，所述内皮细胞为毛细血管内皮细胞。在一些实施方式中，所述内皮细胞为淋巴管内皮细胞。在一些实施方式中，所述内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞为原代细胞、原代小肠细胞、原代大肠细胞、成纤维细胞、小肠细胞、大肠细胞、培养的细胞、传代细胞、永生化细胞、转基因细胞、基因修饰的细胞、癌细胞或来自患有肠癌和/或内皮癌的动物的细胞、来自患有肠疾病或紊乱的动物的细胞、干细胞、胚胎干细胞(ESC)、或诱导多能干细胞(IPSC)。
[0108]本文所用的“免疫细胞”为适应性免疫或体液免疫中涉及的免疫系统的任何细胞。免疫细胞的非限制性实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、浆细胞样树突状细胞(PDC)、髓样树突状细胞(MDC)、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞、NKT细胞、CD4+T细胞，⑶8+T细胞、粒细胞或上述细胞的前体。`
[0109]本文使用的“结缔组织细胞”涉及如下动物组织:所述动物组织支持器官、填充器官间的空间、或执行机械功能(如，将肌肉与骨骼连接(肌腱和韧带))或提供低摩擦的承重表面(如，在关节软骨中)。结缔组织的特征为它们相对无血管的基质以及它们的低细胞密度。最丰富的结缔组织是网状基质(reticular stroma)、肌肉、脂肪组织、软骨和骨。结缔组织进一步的实例包括但不限于，间充质、粘膜结缔组织、蜂窝组织(areolar)(疏松结缔组织(loose))、弹性组织或血液。涵盖在“结缔组织”定义中的为终末分化细胞以及具有分化成结缔组织细胞和组织的潜能的前体细胞。
[0110]在一些实施方式中，本文所述的细胞培养系统含有微生物细胞和/或病原体。在一些实施方式中，所述微生物细胞和/或病原体可与肠上皮细胞存在于同一细胞培养通道。在一些实施方式中，所述微生物细胞和/或病原体可存在于第一细胞培养通道。在一些实施方式中，所述微生物细胞可为在健康动物的肠(intestine或gut)中存在的微生物细胞。在一些实施方式中，所述微生物细胞和/或病原体可为在不健康动物(例如，患有肠疾病或紊乱的动物)的肠中存在的有机体。在一些实施方式中，所述微生物细胞和/或病原体可为引起或造成肠疾病或紊乱的有机体。[0111]在一些实施方式中，所述微生物细胞是好氧的。在一些实施方式中，所述微生物细胞是厌氧的。在一些实施方式中，本文所述的细胞培养系统既含有好氧微生物细胞、又含有厌氧微生物细胞。在一些实施方式中，将所述微生物细胞在本文所述的细胞培养系统中培养至少I天。可将本文所述的细胞培养系统中的微生物细胞培养用于肠菌群环境建模和/或重现。在一些实施方式中，本文所述的细胞培养系统中的微生物细胞培养不降低肠上皮细胞的存活率，例如，向细胞培养系统中引入微生物细胞后，肠上皮细胞存活率减少了不到10%。
[0112]微生物细胞可为细菌细胞，所述细菌细胞包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌二者。在本文所述的细胞培养系统中有用的细菌细胞的非限制性实例包括:乳杆菌属、拟杆菌属、瘤胃球菌属、消化球菌属、消化链球菌属、双歧杆菌属、埃希氏菌属、无色杆菌属、发酵氨基酸球菌、醋酸钙不动杆菌、气单胞菌属、粪产碱菌、芽孢杆菌属、溶纤维丁酸弧菌、弯曲杆菌属、大肠弯曲杆菌、艰难梭状芽胞杆菌、索氏梭状芽胞杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、黄杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、类志贺邻单胞菌、痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、布氏瘤胃球菌、八叠球菌属、金黄色葡萄球菌、咽峡炎链球菌、韦荣球菌属、弧菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG、短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
[0113]在一些实施方式中，所述微生物细胞为病原性的。在一些实施方式中，所述微生物细胞为肠病原体。所述病原性微生物细胞的非限制性实例包括:肠毒性大肠杆菌、沃氏嗜胆菌、志贺氏杆菌属、耶尔森氏菌属、邻单胞菌属、弧菌属、气单胞菌属、弯曲杆菌属、隐孢菌属、球虫、沙门氏菌属、幽门螺杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、凯道古沙门氏菌、拟杆菌属、梭状芽孢杆菌属、厚壁菌门、痢疾志贺氏菌、肠道沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、李斯特菌属、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、变形杆菌属、霍乱弧菌、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、以及空肠弯曲杆菌。已对肠病原体进行了完善的研究和描述(参见例如，MicrobialPathogenesis and the Intestinal Epithelial Cell—Gail A.Hecht—2003—ASMpress)。通过引用的方式将该 书中所述的肠病原体并入本文。
[0114]在一些实施方式中，所述细胞培养系统包含病原体。本文使用的“病原体”可包括已知导致任何肠紊乱或疾病或与任何肠紊乱或疾病有关的病毒、细菌、真菌和寄生虫。微生物病原体在上文中论述。肠的病毒病原体的非限制性实例包括轮状病毒、诺瓦克样病毒、腺病毒、星状病毒、札幌样病毒、隆病毒、冠状病毒、小核糖核酸病毒、疱疫病毒和诺如病毒。肠的真菌病原体的非限制性实例包括念珠菌属、曲霉属和白色念珠菌。肠的寄生虫的非限制性实例包括单细胞寄生虫、多细胞寄生虫、阿米巴、蠕虫、绦虫、原虫、吸虫(扁形虫(f Iatworms ))、蛔虫、蛲虫、钩虫、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫和溶组织内阿米巴。
[0115]在本文所述的细胞培养系统的一些实施方式中，所述系统可包含与第一细胞培养通道的至少一部分接触的厌氧气体腔室。在一些实施方式中，所述厌氧气体腔室包含第一细胞培养通道未被流体占据的部分。在一些实施方式中，所述厌氧气体腔室是第一细胞培养通道上部的细胞培养系统中的空处(void)或空间，并具有与第一细胞培养通道中流体的上表面接触的至少一个端口、间隙(gap)或其它方式。在一些实施方式中，在流经第一细胞培养通道的流体中建立氧气梯度。在一些实施方式中，可通过如下方式在第一细胞培养通道中创建厌氧和/或缺氧条件:在引入肠上皮细胞以及任选的微生物细胞后，将第一细胞培养通道密封，使得第一细胞培养通道仅有的出入点为所述膜上的孔。然后，可将流体提供至第二细胞培养通道。供给第二细胞培养通道的流体可为充氧的或去氧的。
[0116]在一些实施方式中，在进入第一细胞培养通道前，对提供给至少第一细胞培养通道的流体进行去氧。通过非限制性实例的方式，去氧可通过如下方式完成:真空除气、膜除气、用非活性气体替代或与具有还原剂的溶液接触。在一些实施方式中，第一细胞培养通道。在一些实施方式中，流经第一细胞培养通道的流体中的氧气水平为8 X 10_2mol/L以下；例如，4X lCT2mol/L以下、8X lCT3mol/L以下或4X lCT3mol/L以下。在一些实施方式中，各细胞培养通道中的氧气水平相同。在一些实施方式中，使无氧的(anaerobic)非活性气体流经一个或多个细胞培养通道。在一些实施方式中，好氧微生物和厌氧微生物的共培养可降低细胞培养通道中的局部氧气浓度。
[0117]可将本文所述的细胞培养系统用于对非肠细胞、组织和/或因子对本文所述的细胞培养系统所含有的细胞的影响进行研究。在一些实施方式中，将第一细胞培养系统(包含本文所述的细胞培养系统)连接至或连结至任何设计的第二细胞培养系统，该第二细胞培养系统含有非肠上皮细胞的细胞或组织。在一些实施方式中，第二细胞培养系统所含有的细胞或组织为肝细胞和/或肝组织。在一些实施方式中，向流经本文所述的细胞培养系统的流体通道(含有肠上皮细胞)的流体中引入第二细胞培养系统流出物的一部分和/或来源于非肠上皮细胞的细胞的因子(如，信号分子、生长因子或激素)。然后，可对本文所述的第一细胞培养系统中的肠上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞、和/或微生物细胞的响应进行测定。在下文中对肠上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞和/或微生物细胞的响应、以及对上述响应进行测定和/或测量的方法进行描述。
[0118]在一些实施方式中，通过下述方式将细胞引入至本文所述的细胞培养系统:将细胞加入流体中，然后使所述流体流经待引入所述细胞的流体通道和/或细胞培养通道。在一些实施方式中，为了增强细胞贴附，使所述细胞流入所述通道，然后使流体流动暂停，以允许所述细胞贴附至所述膜、贴附分子和/或已经存在于该通道中的其它细胞。在一些实施方式中，为了增强细胞贴附，可将所 细胞培养系统暂时旋转或改变方向，以使想要让细胞贴附的表面成为通道的底面。在一些实施方式中，流体流动的改变或细胞培养系统方向的改变持续2分钟以上，例如，2分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟或更长时间。在一些实施方式中，流体流动的改变或细胞培养系统方向的改变持续约I小时。在一些实施方式中，流体流动的改变或细胞培养系统方向的改变持续约90分钟。
[0119]在一些实施方式中，本文描述了肠类器官的制造方法，该方法包括:向本文所述的细胞培养系统提供适于对肠上皮细胞进行培养和/或维持的流体，以使得所述流体与所述肠上皮细胞接触；以及对所述肠细胞进行体外培养。适于对肠上皮细胞进行培养和/或维持的流体的实例已在上文中描述。在一些实施方式中，所述肠类器官的制造方法进一步包括:在第一细胞培养通道中培养肠上皮细胞，并在第二细胞培养通道中培养内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞。在一些实施方式中，使分隔两个细胞培养通道的膜拉伸。在一些实施方式中，流经细胞培养通道的流体的流速约为30 μ L/hr。在一些实施方式中，剪切应力约为0.02dyne/cm2o在一些实施方式中，以约0.15Hz的频率将所述膜沿平面拉伸约10%。在一些实施方式中，所述肠上皮细胞是Caco-2细胞。在一些实施方式中，所述微生物细胞是鼠李糖乳杆菌GG (LGG)细胞。在一些实施方式中，将所述肠上皮细胞至少培养到绒毛结构出现。
[0120]在一些实施方式中，可通过如下方式将本文所述的细胞培养系统用于对干细胞向成熟肠细胞的分化进行研究:向本文所述的细胞培养系统中引入干细胞(例如，iPSC、成体干细胞或ESC)。可任选地向细胞培养系统中加入分化因子和/或候选分化因子，并测定其对干细胞分化的作用。
[0121]在一些实施方式中，本文所述的细胞培养系统包含用于对肠治疗、功能和/或病理学进行研究的系统。在一些实施方式中，细胞培养系统中的细胞可从患有肠紊乱(例如，乳糜泻(celiac)、Crohn病、溃疡性结肠炎或肠易激综合征)的受试者中获得。在一些实施方式中，可对细胞培养系统的条件进行更改以模拟肠紊乱。通过非限制性实例的方式，可通过如下方式对肠紊乱进行模拟和/或建模:向所述细胞培养系统中引入病原性微生物细胞；向所述细胞培养系统中引入高水平的微生物细胞；或者使流速增加来模拟腹泻。
[0122]在一些实施方式中，本文所述的细胞培养系统包含对肠效应剂进行评价的系统。在一些实施方式中，本文描述了对肠效应剂进行评价的方法，所述方法包括:将本文所述的细胞培养系统的肠上皮细胞与至少一种候选肠效应剂接触；以及对细胞培养系统中细胞的响应进行测量，以确定所述至少一种候选肠效应剂的效果。
[0123]在一些实施方式中，肠效应剂可为化合物、混合物或有机体。候选肠效应剂可为已知调节肠上皮细胞和/或可存在于肠内的微生物的行为的试剂；或者，所述肠效应剂可为待检测其是否能够调节肠上皮细胞和/或可存在于肠内的微生物的行为的试剂。在一些实施方式中，肠效应剂为治疗或药物。在一些实施方式中，肠效应剂是病原体和/或毒素。肠效应剂的非限制性实例为治疗剂、小分子、营养药、止泻药、益生菌、天然肠菌群和/或微生物、食品、维生素、病原体和毒素。在一些实施方式中，所述肠效应剂是可向受试者或患者口服给药的试剂。
[0124]在一些实施方式中，可将本文`所述的细胞培养系统的细胞与一种或多种肠效应剂接触，例如，一种效应剂、两种效应剂、三种效应剂或更多种效应剂。在一些实施方式中，将本文所述的细胞培养系统的肠上皮细胞与一种或多种肠效应剂接触。在一些实施方式中，将本文所述的细胞培养系统的微生物细胞或病原体细胞与一种或多种肠效应剂接触。在一些实施方式中，将本文所述的细胞培养系统的内皮细胞、免疫细胞或结缔组织细胞与一种或多种肠效应剂接触。通过非限制性实例的方式，可将本文所述的细胞培养系统的肠上皮细胞与两种以上肠效应剂接触，以测定该两种药物是否相互作用，或测定药物是否调节天然肠菌群。
[0125]在一些实施方式中，可对本文所述的细胞培养系统中细胞的响应进行测量，来对至少一种候选肠效应剂的作用进行测定。在一些实施方式中，对肠上皮细胞的响应进行测量。在一些实施方式中，对微生物细胞的响应进行测量。在一些实施方式中，对内皮细胞、免疫细胞和/或结缔组织细胞的响应进行测量。测量细胞响应可包括但不限于对如下方面的变化进行测定:形态学、存活率、细胞数量、代谢率、转录、翻译、标志基因的表达、报告基因的水平、转运、屏障功能、紧密连接的形态学、和/或细胞层渗透性。测量细胞响应可包括但不限于对如下方面进行测定:细胞对肠效应剂的吸收率、细胞对肠效应剂的代谢率、细胞对肠效应剂的分泌率或肠效应剂穿过一层或多层细胞的穿透率。测量细胞响应可包括但不限于对细胞如何代谢肠效应剂进行测定。绒毛形成前或形成后，可通过如下方式对细胞的药物代谢功能进行分析:使用被活性CYP3A4酶转化成发光形式的化学底物或发光(Iuminogenic)底物，对CYP3A4的酶活进行测量。用于CYP3A4活性的测定法已为本领域所熟知，用于对CYP3A4活性进行检测的底物可商购获得，例如，Luciferin-1PA (Cat NoV9001 ；Promega Madison, WI)。测量细胞响应的非限制性实例可包括:使用共聚焦显微镜对细胞形态进行测定、使用免疫荧光显微镜对蛋白质水平进行测定、和/或使用连结至Ag/AgCl 电极线(直径 0.008" ；A-M systems, Inc.，Sequim, WA)的电压欧姆表(voltage-ohmmeter) (87V Industrial Multimeter,Fluke Corporation,Everett,WA)通过对跨上皮电阻(TEER)进行测量来对由顶端紧密连接的建立而形成的肠上皮细胞单层的完整性进行测定。
[0126]可将本文所述的方法和细胞培养系统用于就如下目的对肠效应剂进行检验或检测:药理学、毒理学、药物开发、药物递送、蛋白或肽递送、药物代谢、抗生素作用、药物包衣的适用性和降解性、IgA转运、筛选基因修饰生物体的致敏性和毒性、药物-药物相互作用、药物的生物利用度、药物清除、多器官的相互作用、纳米毒理学、诊断、治疗、营养应用、肠屏障生理学、胃肠(GI)疾病模型及其机制、GI道疾病的病因学、伤口愈合、组织再生、组织工程、肠稳态、肠干细胞研究、宿主-微生物相互作用、GI道中的微生物群落、粘液层中的微生物生物膜和益生菌疗法。
[0127]在一些实施方式中，为药物开发、药物递送、药物代谢和药物清除研究的目的，可将本文所述的方法和细胞培养系统与具有药物转运体多样性的细胞共同使用。
[0128]对本公开的实施方式的描述不意味着穷举或将本公开限制在所公开的确切形式。尽管本文出于说明目的对本公开的【具体实施方式】和实施例进行了描述，本领域技术人员将会认识到，各种等同修改均有可能落入本公开的范围内。例如，虽然将方法的步骤或功能以给定顺序给出，其它实施方式可以不同顺序来实施功能、或实际上同时实施功能。本文所提供的本公开的教导可以适当的方式应用于其它程序或方法。可将本文所述的各种实施方式组合以提供进一步的实施方式。 如有需要的话，可对本公开的方面进行修改，以利用上述参考和应用中的组合、功能和概念，来提供本公开更进一步的实施方式。可根据本公开的详细描述,来对本公开进行上述改变和其它改变。
[0129]任何前述实施方式中的具体要素均可进行组合或替代其它实施方式中的要素。此外，尽管与本公开的特定实施方式相关的优势已经在这些实施方式的上下文中给出，其它实施方式也可表现出此类优势，但不是所有实施方式都必须展现出此类优势，才能落入本公开的范围。
[0130]为描述和公开的目的，通过引用的方式将所标明的所有专利和其它出版物明确并入本文，例如，此类出版物中描述的可与本发明一起使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于 申请人:可得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
[0131]通过下文的实施例对本发明进行进一步说明，所述实施例不应视为是限制性的。
[0132]本发明的一些实施方式可由以下编号段落中的任一项进行限定。
[0133]1.一种细胞培养系统,所述系统包含:[0134]流控装置，所述流控装置具有连接至流体源的流体通道，所述流体源供应流体至所述流体通道；
[0135]膜，所述膜设置于所述通道内、膜支持元件之间，所述膜的至少一部分是柔性的；
[0136]膜应变机制，所述膜应变机制连结至所述膜支持元件，所述膜应变机制能够移动所述膜支持元件并引起所述膜沿所述膜的至少一个维度拉伸；以及
[0137]至少一层肠上皮细胞，所述肠上皮细胞贴附至所述膜的至少一个表面，
[0138]其中，流经所述流体通道的流体上的剪切应力小于1.0dyne/cm2。
[0139]2.如段I所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力为0.008dyne/cm2 至 0.08dyne/cm2。[0140]3.如段1-2中任一项所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力约为 0.01Sdyne/cm2。
[0141]4.如段1-3中任一项所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力可以随时间变化。
[0142]5.如段4所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力可随时间从 Odyne/cm2 变化至 1000dyne/Cm20
[0143]6.如段4-5中任一项所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力可随时间从0.008dyne/cm2变化至0.08dyne/cm2。
[0144]7.如段1-6中任一项所述的系统，其中，使所述膜拉伸0%_50%。
[0145]8.如段1-6中任一项所述的系统，其中，使所述膜拉伸5%_15%。
[0146]9.如段1-8中任一项所述的系统，其中，使所述膜拉伸约10%。
[0147]10.如段1-9中任一项所述的系统，其中，使所述膜拉伸大于15%，以产生所述肠上皮细胞的异常状况/状态。
[0148]11.如段1-10中任一项所述的系统，其中，使所述膜以频率为0.01Hz-2Hz的周期性方式拉伸。
[0149]12.如段1-11中任一项所述的系统，其中，使所述膜以频率为0.05Hz-0.25Hz的周期性方式拉伸。
[0150]13.如段1-12中任一项所述的系统，其中，使所述膜以频率为0.15Hz的周期性方式拉伸。
[0151]14.如段1-12中任一项所述的系统，其中，使所述膜以频率大于0.2Hz的周期性方式拉伸，以产生所述肠上皮细胞的异常状况/状态。
[0152]15.如段1-14中任一项所述的系统，其中，使所述膜以无规律的方式或间歇性的方式拉伸。
[0153]16.如段1-15中任一项所述的系统，其中，所述流体以小于500μ L/hr的流速流经所述流体通道。
[0154]17.如段1-16中任一项所述的系统，其中，所述流体以小于100 μ L/hr的流速流经所述流体通道。
[0155]18.如段1-17中任一项所述的系统，其中，所述流体以O μ L/hr-50 μ L/hr的流速流经所述流体通道。
[0156]19.如段1-18中任一项所述的系统，其中，所述流体以约30 μ L/hr的流速流经所述流体通道。
[0157]20.如段1-19中任一项所述的系统，所述系统进一步包含至少一种贴附分子，所述贴附分子支持多个活细胞附着，所述贴附分子涂覆在所述膜的至少一面。
[0158]21.如段20所述的系统，其中，所述至少一种贴附分子选自于由下列物质所组成的组:
[0159]胶原蛋白、I型胶原蛋白、MATRIGEL?、细胞外基质、层粘连蛋白、蛋白聚糖、玻连蛋白、纤连蛋白、聚D-赖氨酸、多肽、寡核苷酸、DNA和多糖。
[0160]22.如段1-21中任一项所述的系统，其中，所述肠上皮细胞是哺乳动物细胞或人细胞。
[0161]23.如段1-22中任一项所述的系统，其中，所述肠上皮细胞选自于由下列细胞所组成的组:
[0162]Caco-2细胞、HT-29细胞、原代小肠上皮细胞、原代大肠上皮细胞、iPS细胞、ESC细胞、干细胞、潘氏细胞、隐窝细胞以及粘液分泌细胞。
[0163]24.如段1-23中任一项所述的系统，其中，所述系统的所述肠上皮细胞进一步含有绒毛结构。
[0164]25.如段1-24中任一项所述的系统，其中，所述系统进一步包含在所述膜的至少第二表面上的至少一层内皮细胞。
[0165]26.如段1-25中任一项所述的系统，其中，所述膜以如下方式进行设置:所述膜将所述流体通道分成第一细胞培养通道和第二细胞培养通道。
[0166]27.如段26所述的系统，其中，所述第一细胞培养通道含有肠上皮细胞。
[0167]28.如段26-27中任一项所述的系统，其中，所述第二细胞培养通道含有选自于由下列细胞所组成的组中的细胞:
[0168]内皮细胞、免疫细胞和结缔组织细胞。
[0169]29.如段1-27中任一项所述的系统，其中，所述系统进一步含有微生物细胞或病原体。
[0170]30.如段29所述的系统，其中，所述微生物细胞在所述系统中维持至少I天。
[0171]31.如段29-30中任一项所述的系统，其中，所述微生物细胞选自于下列微生物所组成的组:
[0172]乳杆菌属、拟杆菌属、瘤胃球菌属、消化球菌属、消化链球菌属、双歧杆菌属、埃希氏菌属、无色杆菌属、发酵氨基酸球菌、醋酸钙不动杆菌、气单胞菌属、粪产碱菌、芽孢杆菌属、溶纤维丁酸弧菌、弯曲杆菌属、大肠弯曲杆菌、艰难梭状芽胞杆菌、索氏梭状芽胞杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、黄杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、类志贺邻单胞菌、痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、布氏瘤胃球菌、八叠球菌属、金黄色葡萄球菌、咽峡炎链球菌、韦荣球菌属、弧菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG、短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
[0173]32.如段29-30中任一项所述的系统，其中，所述微生物细胞是病原性的。
[0174]33.如段29或32中任一项所述的系统,其中,所述病原体选自于由下列病原体所组成的组:[0175]肠毒性大肠杆菌、沃氏嗜胆菌、志贺氏杆菌属、耶尔森氏菌属、邻单胞菌属、弧菌属、气单胞菌属、弯曲杆菌属、隐孢菌属、球虫、沙门氏菌属、幽门螺杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、凯道古沙门氏菌、拟杆菌属、梭状芽孢杆菌属、厚壁菌门、痢疾志贺氏菌、肠道沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、李斯特菌属、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、变形杆菌属、霍乱弧菌、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌以及空肠弯曲杆菌；轮状病毒、诺瓦克样病毒、腺病毒、星状病毒、札幌样病毒、隆病毒、冠状病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、诺如病毒；念珠菌属、曲霉属、白色念珠菌；单细胞寄生虫、多细胞寄生虫、阿米巴、蠕虫、绦虫、原虫、吸虫、蛔虫、蛲虫、钩虫、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫和溶组织内阿米巴。
[0176]34.如段29-33中任一项所述的系统，其中，所述微生物细胞是好氧的。
[0177]35.如段29-33中任一项所述的系统，其中，所述微生物细胞是厌氧的。
[0178]36.如段29-35中任一项所述的系统，其中，所述系统既含有好氧微生物细胞、又含有厌氧微生物细胞。
[0179]37.如段29-36中任一项所述的系统，其中，所述微生物细胞存在于所述第一细胞
培养通道中。
[0180]38.如段29-37中任一项所述的系统，其中，所述系统进一步包含厌氧气体腔室，所述厌氧气体腔室与所述第一细胞培养通道的至少一部分接触。
[0181]39.如段38所述的系统，其中，在流经所述第一细胞培养通道的流体中建立氧气梯度。
[0182]40.如段1-39中任一项所述的系统，其中，所述膜是至少部分多孔的。
[0183]41.如段40所述的系统， 其中，所述膜中的至少一个孔径沿宽度维度为0.5 μ m-10 μ m。
[0184]42.如段1-41中任一项所述的系统，其中，所述膜包含PDMS。
[0185]43.如段1-42中任一项所述的系统，其中，由真空压力引起所述膜拉伸。
[0186]44.如段43所述的系统，其中，所述系统进一步包含:
[0187]所述装置的第一腔室壁，所述第一腔室壁设置为与至少一个流体通道邻接，其中，所述膜安装至所述第一腔室壁；
[0188]第一操作通道，所述第一操作通道与所述第一腔室壁另一侧的至少一个流体通道邻接，其中，在所述第一操作通道和所述至少一个流体通道之间施加的压力差引起所述第一腔室壁朝第一所需方向弯曲，从而沿由所述膜确定的平面扩张或收缩；以及
[0189]真空系统，所述真空系统在所述至少一个流体通道和至少一个操作通道之间提供压力差，其中，所述膜响应所述压力差而沿所述平面拉伸。
[0190]45.如段44所述的系统，所述系统进一步包含:
[0191]所述装置的第二腔室壁，所述第二腔室壁设置为与至少一个流体通道邻接，其中，所述膜的另一端安装至所述第二腔室壁；以及
[0192]第二操作通道，所述第二操作通道设置为与所述第二腔室壁另一侧的至少一个流体通道邻接，其中，所述第二操作通道和所述至少一个流体通道之间的压力差引起所述第二腔室壁朝第二所需方向弯曲，从而沿由所述膜确定的平面扩张或收缩。
[0193]46.如段1-45中任一项所述的系统，其中，所述流控装置包括微流控芯片。
[0194]47.如段1-46中任一项所述的系统，其中，所述系统连接至或连结至第二细胞培养系统，所述第二细胞培养系统含有非肠来源的细胞或组织。
[0195]48.如段47所述的系统，其中，所述第二细胞培养系统含有肝细胞或组织。
[0196]49.一种肠类器官的制造方法，所述方法包括:
[0197]向段1-48中任一项所述的细胞培养系统提供适于对肠上皮细胞进行维持的流体，以使得所述流体与所述肠上皮细胞接触；以及
[0198]对所述肠上皮细胞进行体外培养。
[0199]50.如段49所述的方法，所述方法进一步包括将所述细胞至少培养至绒毛结构明显。
[0200]51.一种用于对肠效应剂进行评价的系统，所述系统包含段1-48中任一项所述的细胞培养系统。
[0201]实施例
[0202]实施例1
[0203]“芯片肠”可为含有培养的人肠上皮细胞单层和来自毛细血管和/或淋巴乳糜管的人内皮细胞单层的微流控系统，上述细胞单层由涂覆有细胞外基质(ECM)的柔性多孔膜分隔(可经受类似于肠运动(例如，螺动和分节(segmental)运动)的有节律的机械扭曲)，其被设计用于重现人肠的组织-组织界面和微结构(图1)。“芯片肠”项目的目标是为人对口服递送的化合物、治疗剂、营养药、功能食品、`病原体和毒素的响应提供稳健的、可重现并可预测的体外平台。芯片肠应该在下列领域的广泛应用中均有用:药理学、毒理学、药物开发、药物递送、药物代谢、药物-药物相互作用、药物的生物利用度、药物清除、多器官的相互作用(例如肠和肝)、诊断、治疗、营养应用、肠屏障生理学、胃肠(GI)疾病模型及其机制、GI道疾病的病因学、伤口愈合、组织再生、组织工程、肠稳态、肠干细胞研究、宿主-微生物相互作用、GI道中的微生物群落、粘液层中的微生物生物膜和益生菌疗法，以及潜在地涵盖所有其它GI道相关研究。
[0204]本文描述了使用硅胶(silicone)弹性聚合物(聚二甲基硅氧烷；PDMS)进行的芯片肠原型微流控装置的制造，该微流控装置具有包含双层紧密平行并置的微通道(I, 000 μ mX 10, 000 μ mX 150 μ m=WXLXH)的3D结构。一个微通道代表肠腔，而另一微通道模拟毛细微血管。这些微通道由具有直径为ΙΟμπι的孔的柔性多孔PDMS膜分隔，所述PDMS膜厚为30 μ m(图2)。在微通道旁边，放置了两个真空腔室以给微通道上施加真空驱动的机械应变(图3A-图3D)。在几何结构上对芯片肠进行优化，以使肠上皮细胞上的剪切应力最小化，并使得由于细胞-基底粘附力度不同而在上皮单层剥离中出现的问题最少化。相比于以前所用的工艺，构建工艺也通过开发无蚀刻工艺来制造中空真空腔室而得以成功改善，这是因为PDMS刻蚀工艺在如下方面是有问题的:不同装置间刻蚀效率的不一致、有毒化学品的使用和时间/劳动问题。
[0205]本文所述的实验使用人结肠腺癌Caco-2细胞实施，该Caco_2细胞在已有的商业化药物检测产品中普遍用于对人吸收性肠上皮进行建模。虽然有报道称Caco-2细胞缺乏一些分子转运体和药物代谢酶[2]，并且不能分泌粘液层[3]，但Caco-2细胞系是已良好表征的细胞系，其可重建高屏障功能、紧密连接蛋白的表达、选择渗透性和刷状缘酶的活性(与人小肠功能密切相关)[4]。如图1所阐释的，在涂覆ECM的多孔膜与共培养的Caco-2细胞相对的一侧上，使用人微血管内皮细胞(HMVEC)来形成毛细血管内皮。[0206]为开发用于体外分析人肠功能的这一模型，将多孔PDMS膜组装在微流控装置内，然后，通过如下方式来用ECM对该膜进行涂覆:向微通道中注入溶于DMEM(含有4.5g/L葡萄糖、抗生素、但不含血清)中的I型胶原蛋白和Matrigel的混合物，然后将所述装置在具有5%C02的加湿培养箱中37°C孵育过夜。第二天，将DMEM(含有4.5g/L葡萄糖、抗生素和20%血清(FBS))灌注通过所述通道(30 μ L/h)，然后，在6h的时间内使Caco-2细胞(~5 X IO6细胞/mL)在培养基中流入一个通道(图4A)。在将Caco-2细胞引入顶部微通道后，将所有连接至装置的管线夹紧，然后将细胞在具有5%C02的加湿培养箱中37°C孵育1.5小时，以促进细胞贴附(图4B)。
[0207]在Caco-2细胞贴附至多孔PDMS膜的表面后，向顶部微通道中以30 μ L/h的流速灌注培养基(含有4.5g/L葡萄糖、抗生素和20%FBS的DMEM) 48小时，以建立汇合且分化的Caco-2单层(图4C和图4D)，同时夹紧底部微通道(即，无灌流)。一旦Caco-2单层充分建立(图4C和图4D)，同时以30 μ L/h的流速向顶部微通道和底部微通道灌注培养基(含有4.5g/L葡萄糖、抗生素和20%FBS的DMEM)。在向多孔PDMS膜另一侧接种HMVE细胞之前，使DMEM(含有4.5g/L葡萄糖、抗生素和5%血清):EGM2-MV1:4 (v/v)灌注经过第二通道24小时。然后，将HMVE细胞(~5X IO6细胞/mL)接种进底部微通道，并将所述装置翻转倒置1.5小时，以促进HMVE细胞贴附于与Caco-2单层相对的面上。在HMVEC充分贴附后，以30 μ L/h的流速将培养基同时灌注通过顶部微通道和底部微通道，以维持Caco-2细胞和HMVE细胞的共培养(图5)。通过由注射泵控制的管线灌注培养基，所述注射泵具有20 μ L/h至40 μ L/h的恒定流速，该流速对应于0.012dyne/cm2至0.024dyne/cm2的剪切应力。据报道，在体内观测到的小肠剪切应力为0.008dyne/cm2-0.08dyne/Cm2，这一范围与芯片肠装置的该实施方式中的剪切应力范围相符很好[5-6]。
[0208]当细胞单层在限定的流控条件下完全汇合并稳定后，进行转运实验。以0.15Hz的恒定频率，用周期性拉伸来施加具有上至~26% (~85kPa)的各种伸长百分比的机械应变，所述拉伸由对真空腔室施加负压 来驱动(图3A-图3D)。在开始转运或屏障功能分析实验前，使共培养的Caco-2细胞单层和HMVE细胞单层经受12小时以上的周期性形变。由跨上皮电阻(TEER)大幅增加的测量(数据未示出)发现，对该芯片肠装置施加周期性机械应变来模仿肠的生理性蠕动，显著增强了肠上皮屏障功能。使用装备有欧姆表的Ag/AgCl电极对顶部微通道和底部微通道间的电阻进行监测，然后通过将值与细胞单层的表面积相乘来将电阻转换成TEER值。当使用随时间具有5%的应变增加量来对细胞单层施加伸长量为0%-25%的机械应变24小时时，观察到TEER值立即增加，然后达到较高的平稳值；并且，TEER值随着组织-组织界面的伸长％增加而随时间递增。
[0209]为对穿过细胞单层的分子渗透性进行测量，将溶于培养基中的目标分子引入顶部微通道(即，腔侧)中，同时使新鲜培养基流入底部通道(即，毛细管侧)中。从底部通道间歇性地取出样品并进行分析，以对穿过细胞单层的累积分子转运进行评价(图6A-图6C)。这些研究表明，无论对Caco-2细胞单层单独检测还是对其与HMVE细胞单层的联合进行检测，机械应变增加了荧光分子的细胞旁转运，所述荧光分子包括FITC-葡聚糖(图7和图9)和萤光黄(图8)。基于方程Papp=(dQ/dt)/(A.(；)，对这个组织-组织屏障功能模型中获得的表观渗透性(Papp)进行计算，其中，Q是在接收侧转运的化合物的累积量(vg) ；t是时间(sec) ；A是转运发生所跨越的细胞单层的暴露表面积(cm2) ；C0是供应侧化合物的初始浓度(14/mL)[7]。现在尚未清楚了解如下内容:假定TEER的增加表明较高的连接屏障存在，而机械拉伸为什么使大分子(FD20)和小分子(LY)两者的细胞旁转运均增强。然而，如之前在芯片肺中所观测到的在量子点(quantum dot)转运研究中所观察到的,这可能是由生理相关的胞吞转运响应所造成[I]。
[0210]为对转运体介导的渗透性进行测量，将罗丹明123 (Rhol23)用作众所周知的渗透性糖蛋白(P-gp)外排转运通路的底物，已知Caco-2细胞表达该通路。在使用市售Transwell滤器装置的静态条件下,对由P_gp进行的Rhol23外排所示的Rhol23转运进行观察，这与在'BDAPi转运中Papp值高于在'AP>BL/转运中的Papp值相对应(图10)。同时，当在两个通道中都加入P-gp抑制剂维拉帕米时，从BL侧向AP侧的外排大幅降低(图10)。在通过靶向P-gp证实Caco-2单层中Rhol23运作良好后，将Rhol23应用于芯片肠装置中。在这一初步实验中，在存在或不存在机械应变的情况下，向AP侧或BL侧施加溶于培养基中的Rhol23。在存在机械应变的情况下，Papp值引起增强的渗透性，其比Rhol23外排的Papp值咼。
[0211]基于这些结果，这一芯片肠微流控装置具有作为新型体外肠模型的潜在应用，所述模型用于在存在或不存在机械应变的情况下，对营养吸收、离子转运和纳米颗粒/纳米颗粒缀合物转运进行检测，以对生理相关性进行评价。芯片肠还可用于对药物开发进行研究，所述药物开发研究包括在存在或不存在机械应变的情况下的药物转运(摄入和外排)、药代动力学、药效动力学、代谢、药物-药物相互作用、制剂的吸收效果以及功效、毒理和清除，以使体内相关性最大化。芯片肠装置也可用于基于与肠绒毛结构的拓扑相似性，对肠上皮和其它细胞类型(例如，毛细血管或淋巴管内皮、免疫细胞、结缔组织等)间的相互作用进行研究(图1)。
[0212]所述“芯片肠”也可用于在存在或不存在机械应变的情况下对传统药物的毒理学和纳米尺寸材料的毒理学(即纳米毒理学)进行评价。此外，其是否可通过重现关键组件和病因学因子(包括相关微生物)来用于对GI道疾病(例如,炎症性肠病(如，Crohn病和溃疡性结肠炎)、肠梗阻和肠易激综合征)进行建模。本文所述的系统还允许对肠疾病的发生、进展、终止、核心机制、接种疫苗和开发`潜力药物进行探索，以及说明宿主-微生物相互作用、宿主细胞与微生物的共培养、病原体和益生菌株的相互影响、GI道中的生物膜形成、以及益生菌株对肠上皮细胞和其它类型细胞的正/负作用。此外，可利用“芯片肠”平台上的工程化人类微生物组(microbiome)来显示遗传工程化的微生物组如何能在微生物群落和宿主组织中发挥重要作用以潜在地改善肠健康。芯片肠也可用于研究肠干细胞。可利用微工程化装置中的各种空间结构对肠干细胞生态龛(niche)及其命运进行调整。
[0213]另外，本文所述的系统可与非平面多孔膜共同使用，所述非平面多孔膜更高度地模仿了人肠的绒毛微构造，这具有提供甚至更逼真的肠功能模型的潜能。这可能与分析微生物群落-上皮相互作用和食物吸收的研究特别相关。
[0214]在芯片肠上施加的机械应变证明体内物理微环境的生理相关性，在该微环境中发生在人活肠中的蠕动和分节运动。例如，本文所述的结果显示，相对于静态Transwell培养或使用不存在机械拉伸的传统微流控系统(图7、图8和图9)，肠上皮单层的周期性形变(例如，频率0.15Hz、伸长量0%-25%)引起连接屏障功能的显著提高，同时增加了特定分子的表观渗透性。具有生理机械应变的这一转运结果可为在体外对候选药物进行评价的金标准。[0215]机械应变所产生的效果提供多种关键优势。第一，通过引入来源于人的细胞(如，人肠细胞系、人原代肠细胞或人肠干细胞)，芯片肠展示出更高度模仿人体内的整体肠器官生理学的生理响应。这种生理相关性在药物开发中期中对可靠药物筛选过程进行开发以及对可重复的药代动力学进行开发中将非常有价值。第二，芯片肠可提供器官水平功能性，以显示临近的不同类型的细胞如何有助于在营养物和药物化合物的吸收和转运中进行协同作用。第三，芯片肠能够大幅减小体外模型、原位动物模型和还未完全了解的人体体内之间的信息差距。通过加入人肠微生物或潜在的病原性微生物，芯片肠可用于重建具有关键宿主细胞的人肠中的情况。因为由于显著的物种差异而使得动物模型中的结果经常不能预测出在人中所观测到的药物转运和代谢响应，通过在模仿生理或病理的肠蠕动运动的机械应变下在3D结构中整合多种人器官特异性细胞类型，芯片肠可提供具有强体内相关性的替代体外模型。
[0216]参考文献
[0217]1.Huh.D., et al., Reconstituting organ-level lung functions on a chip.Science,2010.328(5986):P.1662-8.[0218]2.Artursson, P.and R.T.Borchardt, Intestinal drug absorption andmetabolism in cell cultures:Caco_2and beyond.Pharm Res,1997.14(12):p.1655-8.[0219]3.Pontier, C., el al., HT29-M TX and Caco_2/TC7m onolayers as predictivemodels for human intestinal absorption:role of the mucus layer.J Pharm Sci,2001.90(10):p.1608-19.[0220]4.Le Ferrec, E., et al., In vitro models of the intestinal barrier.The report and recommendations of ECVAM Workshop46.European Centre for theValidation of Alternative methods.Altern Lab Anim,2001.29(6):p.649-68.[0221]5.Lentle,R.G.and P.ff.M.Janssen,Physical characteristics of digesta andtheir influence on flow and mixing in the mammalian intestine:a review.Journalof Comparative Physiology B-Biochem ical Systemic and Environmental Physiology,2008.178(6):p.673-690.[0222]6.0lesen, S.P., D.E.Clapham, and P.F.Davies, HEMODYNAM IC SHEAR-STRESS ACTIVATES A K+CURRENT IN VASCULAR ENDOTHELIAL-CELLS.Nature,1988.331 (6152):p.168-170.[0223]7.Artursson, P.,K.Palm,and K.Luthm an,Caco_2monolayers in experimentaland theoretical predictions of drug transport.Advanced Drug Delivery Reviews,2001.46(1-3):p.27-43.[0224]8.Sung, J.H., et al., Microscale3_D hydrogel scaffold for biomimeticgastrointestinal (GI) tract model.Lab Chip,2011.11(3):p.389-92.[0225]实施例2
[0226]开发基于活细胞的体外肠模型(模仿人肠的机制、结构、吸收、转运和病理生理特性及其重要的微生物共生体)可加快药物的开发，并潜在地替代动物实验。本文描述了仿生“人芯片肠”微装置的一个实施方式，所述微装置由两个微流控通道构成，所述两个微流控通道由涂覆有细胞外基质(ECM)的 多孔柔性膜分隔、并内衬有人肠上皮(Caco — 2)细胞，以模拟活肠的复杂结构和生理学。通过如下步骤对肠微环境进行重建:使产生低剪切应力(0.02dyne/cm2)的低流速(30 μ L/hr)流体在微通道中流过,并施加模仿生理螺动运动的周期性应变(10% ；0.15Hz)。在这些条件下，柱状上皮发育(快速极化)，同时生长为褶皱(重现肠绒毛结构)，并对小分子形成高完整性的屏障，这比静态Transwell模型中培养的细胞更好地模拟了整个肠。此外，正常的肠微生物(鼠李糖乳杆菌GG)可成功地在培养的上皮的腔表面共培养延长的时间(>1周)，而不影响肠上皮细胞的存活率，如之前在人中所观察到的，这实际上改善了屏障功能。因此，这一芯片肠在可控的微流控环境(能够用于转运、吸收和毒理研究)中重现了对于人肠功能十分重要的人肠的多种动态物理特征和功能特征，因此，该芯片应该在药物检测以及开发新型肠疾病模型方面具有巨大价值。
[0227]由于依赖于动物模型的使用，而动物模型代价大、是劳动密集型的、耗时并存在伦理问题，因而药物开发进程受到严重阻碍I。但更大的顾虑是，动物模型常常预测不到在人体中所得到的结果2_3，在解决与药物和营养物的代谢、转运和口服吸收相关的挑战时，这是特有的问题4_5。由于这些原因，开发人肠功能的体外模型已引起人们越来越多的关注，该体外模型包括能够进行跨上皮障碍和转运研究8_9的使用Transwell滤器镶嵌套6_7的细胞培养系统，以及也支持长期培养的小型化微流控模型1(1_14。还有人尝试过通过在水凝胶基底上培养的人肠上皮(例如Caco-2)细胞来在体外重建肠衬里的正常三维(3D)构架，所述水凝胶基底经微加工以模拟人肠绒毛的形状、大小和密度n。然而，现有的体外肠模型均未重现活肠的机械活动微环境(蠕动运动和腔内流体流动)，所述机械活动微环境对于正常器官的生理机能15以及Crohn病和其它肠紊乱的发展16_17是非常关键的。现有体外肠模型的另一个局限是，在培养的肠上皮的腔表面上，活微生物还不能像通常在活肠中那样在延长的一段时间内生长。这是一个关键问题，因为微生物共生体通常对肠屏障功能、药物和化学物质的代谢和吸收、以及许多疾病都有很大贡献18_22。因此，本文描述了以人“芯片肠”形式存在的更生理相关的人肠体外模型，所述模型经受蠕动、经历流体流动、并在不影响人细胞存活率的情况下支持微生物菌群生长。
[0228]微装置的设计和制造 。所述芯片肠装置通过采用软光刻技术由柔性透明的聚二甲基硅氧烷(PDMS ;Sylgard, Dow Corning)聚合物制成,该软光刻技术之前用于制造呼吸的芯片肺装置23。对齐的上下层微通道具有相同的大小(150 μ m高X 1，000 μ m宽)，并由30 μ m厚的PDMS膜分隔，该PDMS膜具有直径为ΙΟμπι、间距为25 μ m (中心至中心)的圆孔(图12A-图12C)。如图13所示，通过在微加工的反向通道设计的模具(由光刻胶(SU-8100，Microchem, Newton, MA)制成)上烧注PDMS预聚物(PDMS与固化剂之比为15:lw/w),分别对上下微通道层进行制备。多孔膜(图12C，右侧插图)可通过如下步骤制备:在微加工的硅片(包含圆柱的柱阵列)(10 μ m直径X 30 μ m高，间距25 μ m ;MEMS and NanotechnologyExchange, Reson, VA)上浇注PDMS预聚物，用固化的、平的、硅烷化的PDMS支持层覆盖所述预聚物，在该装置上放置3kg的重物，然后将该聚合物在60°C下固化12小时。在将多孔PDMS膜和支持层从所述片上剥离后，将多孔膜的表面暴露于由实验室电晕处理机(BD-20AC, Electro-Technic Products, Inc., Chicago, IL)生产的等离子体，上层微通道层也可进行相同处理。然后，立即将多孔PDMS膜和上层微通道层的等离子处理表面放置为共形接触。整个装置在80°C下的过夜孵育使得两个PDMS层不可逆地粘合。然后，将PDMS支持层自PDMS多孔膜底部剥离，并将该膜位于旁边真空腔室的部分用镊子撕除，以形成全高度中空的真空腔室。随后将经撕除的PDMS膜所暴露的表面和下层PDMS微通道层(与上层形状相同)的上表面暴露于等离子体，在立体镜(Zeiss Discovery V20Stereo Microscope,Carl Zeiss MicroImaging Gmb, Germany)下将其对齐、并压在一起,然后在80°C下过夜固化，以制成整个粘合装置，该装置在主微通道的两侧各有中空的真空腔室(图12A和图13)。使用无针座不镑钢纯头针(18G ；Kimble Chase, Vineland, NJ)将管线(Tygon3350siliconetubing, ID1/32”, 0D3/32”, Beaverton, MI)由流体介质和真空源分别连接至上层微流控通道和下层微流控通道。这样允许对中央微通道中培养基的流动进行控制，并允许在计算机控制下对向侧面通道施加的真空进行调节，以产生周期性机械应变，从而模拟蠕动运动(图12D)。
[0229]细胞培养。人Caco-2肠上皮细胞(Caco_2BBE人结直肠癌细胞系24)从HarvardDigestive Disease Center获得，并在含有4.5g/L葡萄糖并补充有20%胎牛血清(FBS ;Gibco)、100 单位 /mL 青霉素、100 μ g/mL链霉素(Gibco)、100 μ g/mL NormocinC Invivogen,San Diego, CA)和 25mMHEPES 的 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM ；Gibco,GrandIsland, NY)中生长。从用于将Caco-2细胞与活肠微生物共培养的培养基中去除抗生素。
[0230]在微装置的制造和组装后，通过如下方式对管线和微流控通道进行灭菌:使70%(v/v)乙醇流经装置，并在60°C烘箱中对整个系统进行干燥。然后，将干燥的装置同时暴露在紫外线和臭氧(UV0 Cleaner342, Jelight Company Inc., Irvine, CA)下 30min。将 ECM溶液25_27 (含有处于无血清DMEM中的大鼠I型胶原蛋白(50 μ g/mL，Gibco)和Matrigel(300 μ g/mL, BD Biosciences, Bedford, MA))注射入微通道，并在 37 °C 下孵育 2 小时，这之后用培养基对微通道进行灌注。使用无菌注射器(ImL, Tuberculin slip tip ；BD,Franklin Lakes，NJ)和针头(25G5/8 ;BD)通过轻轻吸拉所述细胞溶液进入上层微通道，来将用胰蛋白酶/EDTA溶液(0.05% ；Gibco)收获的Caco-2细胞铺于ECM涂覆的多孔膜的上表面(1.5 X IO5细胞/cm2)。在这种细胞密度下，在接种进芯片肠装置后，在微通道中既观察不到细胞聚集也观测不到细胞重叠。在~30min内Caco-2细胞贴附至ECM涂覆的PDMS表面，并在I小时内生成细胞-细胞粘附(未示出)。I小时后，在培养的第一天使用注射泵(BS-8000 ；Braintree Scientific Inc., Braintree, MA)将培养基以恒定流速(30 μ L/hr,产生0.02dyne/cm2的剪切应力)持续灌注通过上层通道，以确保Caco-2细胞建立完整的单层，然后以相同速度使培养基流经上下两通道。
[0231]为对Caco-2单层进行周期性形式的机械形变(模仿肠的蠕动运动)，使用计算机控制的 FX5K 张力仪(tension instrument, Flexcell International Corporation,Hillsborough, NC)对连接至真空腔室的管线施加周期性抽吸(图12A，图12B)。该装置能够使芯片肠中的多孔膜的单向伸长达~50%;然而，将更高度模拟上皮细胞在人活肠中经历的体内机械微环境16，28的周期性拉伸方案(10%平均细胞应变，0.15Hz频率)应用于这些研究。首先在一个宽范围(O至~30%应变)对施加的压力、多孔膜基底的扭曲和细胞形变之间的关系进行定量，以表征所述装置的控制参数(图12E)。
[0232]使用含有多孔聚酯膜插入物(0.33cm2,0.4 μ m孔)的Transwell板(Corning Inc.,Lowell, MA)中的Caco-2细胞静态培养进行对照研究，该插入物预先涂覆有在芯片肠装置中所用的相同的I型胶原蛋白和Matrigel的ECM混合物。也将Caco-2细胞以相同的密度(1.5X IO5细胞/cm2)进行铺板，并将Transwell腔室顶端侧和基底侧这两侧的培养基每隔一天进行更新。
[0233]上皮屏障测量。通过如下方式对由顶端紧密连接的建立所得到的人肠上皮细胞单层的完整性进行评价:对紧密连接蛋白闭合蛋白29进行染色(使用共聚焦免疫荧光显微镜)，并对跨上皮电阻(TEER)进行测量。在Transwell培养中，使用连结至筷子状电极的Millicell ERS计(Millipore，Bedford, MA)对TEER进行测量，并通过如下方式对TEER值(Ωοπι2)进行确定:减去在不存在细胞的情况下测得的基线电阻值，然后将所得到的剩余的“比(specific)”电阻值(Ω )乘以细胞培养表面积(cm2)。培养在芯片肠中的Caco-2单层的 TEER 使用连结至 Ag/AgCl 电极线(直径为 0.008'A-M systems, Inc.，Sequim, WA)的电压欧姆表(87V Industrial Multimeter, Fluke Corporation, Everett, WA)进行测量；对照研究证实两种方法得到了类似的TEER结果。再一次，从Caco-2单层测得的结果中减去在无细胞情况下测得的基线电阻值，然后通过将该比电阻值乘以PDMS膜上的细胞培养总表面积，以对比TEER值进行确定(表1)。
[0234]氨基肽酶活性的测量。通过使用L-丙氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐(A4N;Sigma，St.Louis, MO)作为底物，对顶端刷状缘氨基肽酶的比活性进行定量，从而对人肠上皮细胞的功能性进行测量，所述氨基肽酶由分化的人肠Caco-2细胞单层表达3°。在Transwell研究中，将A4N底物溶液(1.5mM，处于培养基中)加入培养了 5天或培养了 21天的细胞顶部腔室，并在37°C下孵育2小时后，将顶部腔室中的溶液(70 μ L)转移到96孔板(黑色/透明平底，BD Falcon,Franklin Lakes,NJ),其中，在酶标仪(SpectraMax M5,Molecular Devices,Sunnyvale, CA)中于405nm下对裂解产物(即，4-硝基苯胺)进行定量，使用培养基作为参t匕。用总活性除以总细胞数得到氨基肽酶的比活性。根据4-硝基苯胺校准曲线，对裂解产物的实际量进行估计。
[0235]为对芯片肠中氨基肽酶的比活性进行测量，使A4N溶液以30μ L/hr的流速流经所述装置的上层微通道，该微通道含有在存在或不存在周期性机械应变(10%应变，频率
0.15Hz)的情况下培养5天的Caco-2单层。将每小时从上层微通道的出口收集到的样品(30 μ L)稀释到与分析TranswelI样`品所使用的体积相同的体积(70 μ L),然后转移到96孔板(黑色/透明平底，BD Falcon)，其中，如上文所述对光密度进行测量。
[0236]细胞旁渗透性测量。在紧密连接完整性建立后(TEER ^ 600 Ω.cm2),通过测量异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FD20 ；20KDa ；Sigma, St.Louis, MO)随时间的转运，来对肠细胞单层的表观渗透系数(Papp，cm/sec)进行测定。在Transwell研究中，向顶部腔室的上皮顶端表面加入FD20 (200yL ;lmg/mL)，每15min从下层腔室中移除等分样品(70yL，总体积为700 μ L)，同时用等体积的新鲜培养基补充。对从下层腔室收集的样品的荧光强度(490nm激发/520nm发射)立即进行测量，以对从细胞顶端转运到基底面的FD20量进行定量。在减掉于单独的培养基中测量所得的基线荧光值后，根据Papp(cm/sec) = (dQ/dt) (I/AC。)来计算表观渗透系数(Papp),其中，dQ/dt是稳态通量(steady-state flux) (g/sec),A是培养的表面积(cm2)，C0是加入到顶端细胞表面的FD20溶液的初始浓度(g/L) 31。
[0237]在使用芯片肠进行的研究中，将FD20溶液灌注通过上层通道，对每小时从下层通道的出口收集的等分样品(30 μ L)进行分析，以对穿过Caco-2细胞旁屏障转运的FD20的量进行定量。在存在中等流速(30 μ L/hr)、暴露或不暴露于周期性机械应变(10%应变，频率为0.15Hz)的情况下，将微通道中的Caco-2单层培养5天。[0238]微生物研究。为了研究人肠上皮细胞-微生物相互作用的生理相关性，从American Type Culture Collection (ATCC53103 ;Manassas, VA)处获得鼠李糖乳杆菌 GG(LGG)株(该菌最初从人肠中分离32)。在转移至Caco-2细胞单层(预培养~4_5天以产生相应的肠屏障完整性(TEER ^ 600 Ω.cm2))顶端表面前，将LGG细胞在无震荡的加湿培养箱(37°C，5%C02)中，在高温灭菌的乳酸杆菌MRS肉汤(BD Diagnostic, Sparks, MD)中生长过夜。在LGG细胞(终细胞密度为~1.0X107CFU/mL)接种前12小时，将细胞培养基换成无抗生素培养基。将Transwell培养中铺于Caco-2细胞顶端表面的LGG细胞孵育1.5hr,用无抗生素培养基进行两次替换小心地洗去未贴附的细胞，然后如所指出的，在相同的培养基中孵育以进行延长的培养。除在贴附期之后以40 μ L/hr的流速将无抗生素培养基灌注通过上下层微通道并伴随周期性拉伸(10%应变，频率为0.15Hz)外，在芯片肠研究中使用相同的方法。
[0239]微生物的β -半乳糖苷酶活性测量。为了对共培养研究中的LGG细胞的存活率和功能进行分析，通过测量培养的微生物裂解酶底物邻硝基苯_β-D-半乳糖苷(0NPG ;Sigma, St.Louis，M0)的能力来对LGG的β -半乳糖苷酶的催化活性进行测定。对于这些研究，在向培养基加入0NPG(30 μ g/mL)前，在芯片肠中对LGG细胞和Caco-2细胞进行共培养，并用无抗生素培养基(40 μ L/hr)灌注48小时。通过如下方式对每小时从上层微通道的出口收集到的样品(30 μ L)进行分析:使用 SpectraMaxM5instrument (Molecular Devices,Sunnyvale, CA)对光密度(420nm)进行测量,从而对LGG细胞中由β -半乳糖苷酶所释放的产物(即，邻硝基苯酚)的量进行定量。根据邻硝基苯酚的校正曲线对裂解产物的量进行估计。
[0240]形态学研究。在Zeiss Axiovert40CFL相差显微镜上使用Moticam2500相机(Motic China Group C0., Ltd.)与成像软件(Motic images plus2.0 ；Motic China GroupC0.，Ltd.)在培养期间对细胞图像进行记录。为使细胞形状和极性可视化，使用异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔环肽(ph alloidin) (Sigma, St.Louis, M0)、4’，6-二脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI ;Molecular Probe, Eugene, OR)和粘蛋白2抗体33 (鼠单克隆抗体；abeam, Cambridge, MA)分别对Caco_2细胞单层中的F-肌动蛋白、细胞核和粘蛋白进行染色，所述Caco-2细胞单层在4%多聚甲醒中进行固定，并用0.3%Triton-X_100 (Sigma,St.Louis,MO)进行通透性处理。荧光染色后，使用装备有光电倍增管并连结至405nm激光和白光激光(489-670nm)的倒置激光扫描共聚焦显微镜(Leica SP5X MP, Germany)对所述细胞进行扫描。为使上皮紧密连接可视化，使用抗闭合蛋白抗体(鼠单克隆抗体-AlexaFluor594 ；Molecular Probe, Eugene, OR)进行免疫染色，并用连结至 CCD 相机(CoolSNAPHQ2,1392X 1040 分辨率；Photometries,Tucson,AZ)的 Zeiss Axio Observer Zl 落射突光显微镜(ep1-fluorescence microscope)对样品进行可视化,并使用MetaMorph图像软件(Molecular Devices)对所记录的图像进行计算机图像分析。
[0241]统计分析。所有结果均以平均值土标准误(SEM)表示。对于定量数据的统计评价，使用 GraphPad InStat3.10 版(GraphPad Software Inc., San Diego CA)进行单因素方差分析(ANOVA)和Tukey-Kramer多重比较检验。当p〈0.05认为差异为统计显著性的。
[0242]剪切应力的计算。剪切应力(τ，dyne/cm2)根据如下方程63: τ =6 μ Q/h2w进行计算，其中，μ是培养基的粘度(g/cm.s), Q是体积流速(volumetric flow rate) (cm3/s),w (cm)和h (cm)分别为微通道的宽和高。
[0243]β_半乳糖苷酶活性的测量。为了对β_半乳糖苷酶的催化活性进行测量，如上所述使用邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(0NPG;Sigma，St.Louis，MO)。在MRS培养基中进行LGG细胞培养，然后在指数生长期收集LGG细胞。将LGG细胞在无抗生素培养基中清洗两次后，将细胞密度在含有ONPG的无抗生素细胞培养基(ONPG终浓度为30 μ g/mL)中调整至~1.0X 108CFU/mL，然后立即将样品在37°C、5%C02下，在加湿环境中进行孵育。将间隔12小时所取得的样品进行离心，在420nm下测量上清液的光密度(SpectraMax M5, MolecularDevices)，将新鲜培养基用作参比。将Caco_2细胞在ECM涂覆的24孔板(Falcon，BD)中培养2周，然后在进行ONPG测定前12小时将培养基换为无抗生素培养基。在将ONPG溶液(30 μ g/mL)加入Caco-2细胞培养板后，间歇地从培养基中取出等分样品，并在420nm下对光密度进行测量。
[0244]结果和讨论
[0245]芯片肠微系统设计。芯片肠微装置的实施方式被设计用于模仿肠的动态机械微环境、支持基于灌注的与微生物共生体的长期细胞培养、以及能够对肠上皮屏障功能进行体外分析。为达到上述目标，微系统设计引入了两层紧密并置的微流控通道，所述通道由ECM涂覆的多孔薄膜分隔(内衬有人Caco-2肠上皮细胞)(图12A)。将培养基(10-100 μ L/min)灌流通过两个微通道，以模仿在人肠中正常经历的流体流动和剪切应力34-36。为了在上皮细胞单层上制造出类似于由人肠蠕动运动所引起的节奏性机械形变，给全高度的中空真空腔室(置于所述微通道的两侧)施加由计算机控制的真空歧管(manifold)调节的周期性抽吸，以对ECM涂覆的多孔弹性膜进行反复拉伸和放松(图12D)。对在这些条件下生长的人肠上皮单层中的细胞形状进行的相差显微镜分析证实，随着抽吸压力水平从Okpa升高至45kPa，基底扭曲和细胞形变也均从0%线性增加至~30% (图12A-图12E)。
[0246]模仿肠微环境对上皮组织的影响。为了对模仿肠物理微环境的生理相关性进行探索，使Caco-2细胞在无流体流动`和机械应变的静态Transwell腔室(图14A)、或者在只有流动的芯片肠微流控装置(图14B)、或者在具有流动和周期性机械应变的芯片肠微流控装置(图14C)中生长。Caco-2细胞通常必须在Transwell系统中生长至少3周,才能展现出分化后的肠屏障功能，因此，我们在这些静态培养中于21天时对细胞进行分析。在初步研究中注意到，在所述微流控装置中定义良好的上皮单层的形成要快得多，因此，相比于用Transwell培养进行的上皮单层功能研究，在所述微流控系统中仅培养3天后即可进行这些研究。
[0247]使用针对抗紧密连接蛋白闭合蛋白的抗体的相差显微研究和免疫荧光显微研究证实了，在所有三种培养条件下，甚至细胞仅在所述微装置中培养了短得多的时间的条件下，Caco-2细胞均形成汇合的多边形上皮单层，并具有发育良好的紧密连接(图14A-图14C)。然而，对F-肌动蛋白分布和细胞核位置进行的共聚焦荧光显微分析显示，在Transwell的静态条件生长的上皮细胞高度扁平化，并且几乎都为鳞状形式(图14A)。相反，在存在或不存在共存的周期性应变的情况下，在存在流速类似于人肠所经受的流速的流体流动(30 μ L/hr ;剪切应力为0.02dyne/cm2) 34’36下生长的细胞的大小几乎为6倍高，因此，显示出具有基底核的极化上皮细胞形式(图14B-图14C)。事实上，在流体流动下得到的细胞具有与已报道的体内健康完整的人肠上皮的细胞37大致相同的柱状形状和大小(30-40 μ m 高)。
[0248]—种可能是,相比于Transwell系统,对细胞形态的这一作用可能是在微通道装置内的放置的假象。然而，当将微流控通道内的流体流速降低到最低水平时(10 μ L/hr),细胞不能在高度上有所增加，并且看起来细胞更像是在静态Transwell系统中38 (图14A);而增加流速至100 μ L/hr并未有超过我们在30 μ L/hr观察到的效果之外的附加效果(图18A-图18C)。因此，在细胞在Transwell系统中甚至3周后仍然保持扁平的条件下，根据在培养3天内这些细胞的高度和极性的增加而衡量出，穿过肠上皮顶端表面的生理性的流体流动和剪切应力的应用促进了细胞分化。此外，由于周期性应变不能产生任何显著的附加效果，流动或剪切应力是这一响应的重要决定因素(图14D)。
[0249]有意思的是，当将Caco-2细胞在具有流动和周期性应变的芯片肠微装置中培养更长时间时，发现初始的平面柱状上皮自发地生长形成起伏和褶皱(图15A)。当通过免疫荧光共聚焦显微镜对垂直剖面进行分析时，发现这些褶皱表现出正常肠绒毛的形态:由具有基底核的极化柱状上皮细胞作为衬里，并由隐窝分隔(图15B)。在这些绒毛状结构中上皮细胞的顶端表面的粘蛋白2染色呈阳性，这是体内这一粘蛋白(mucoprotein)的位置所在39。在这一体外模型中所观察到的绒毛形成的时间(以周为级别)与在体内观察到的绒毛更新速度也是一致的4°_41。确信由Caco-2细胞而来的肠绒毛的自发形成在之前从未有所报道，这一响应(在铺于平面ECM基底之后发生)似乎直接依赖于正常肠机械微环境的重现，所述正常肠机械微环境经受低水平的流体流动(以及剪切应力)以及周期性蠕动运动。
[0250]体外肠屏障功能的重构。肠上皮屏障功能的Transwell模型(通常用作药物筛选应用和细胞生物学研究的工具8，42)涉及在多孔Transwell膜上培养Caco-2细胞，并通过对TEER进行定量来测量紧密连接完整性。因此，对在静态Transwell条件下生长的Caco-2单层的TEER与在芯片肠装置中(存在流动(30 μ L/hr)、且存在或不存在生理性周期应变(10%, 0.15Hz))形成的Caco-2单层的TEER进行了比较。这些研究证明，在所有三种培养条件下生长的细胞在铺板后的第一个6天内TEER都增加，然后在至少另一个4-5天的培养中维持在同样高的水平。然而，在存在或不存在应变的微流控装置中，细胞显示出TEER的峰水平，该峰水平为在静态Transwe ll培养中细胞的TEER水平的3_4倍(图16A)。
[0251]使用荧光葡聚糖(FD20)测量肠上皮的表观渗透系数(Papp),由于紧密连接与孔相关联，该表观渗透系数表征肠上皮的细胞旁屏障功能31。发现无论将Caco-2细胞在Transwell腔室中培养5天或是21天,细胞的Papp值相同(~4X 10_8cm/sec)(图16B)。在仅具有流体流动(30 μ L/hr)的微流控装置中培养了 5天的细胞也表现出类似的Papp ;然而，额外施加周期性机械应变(10%应变，0.15Ηζ+30 μ L/hr流动)引发细胞旁渗透性增加大于4倍(图16B)。
[0252]这些结果与已发表的研究一致，所述研究示出相比于在人或动物肠观测到的体内细胞旁渗透值，Transwell培养中的Caco-2细胞单层表现出较低的细胞旁渗透值43_45。据推测，渗透性的这一低水平可能是由于Transwel静态培养中存在厚的非搅拌流体层，所述层可能限制了扩散46。然后，人们可能会预期流体流动可能会通过产生流体剪切应力(降低了非搅拌扩散层的厚度)而使细胞旁渗透性增加43_4447，但是，单独的流体流动并未改变本文所述系统中的细胞旁渗透性。反而，如本文所述，周期性应变增加了细胞旁渗透性，并且这是在如下条件下发生的:并未改变这些细胞单层中的TEER (图16B与图16A)，这表明机械扭曲可能直接改变细胞旁转运的机制。作为胞吞作用增强的结果，周期性机械应变可使 纳米颗粒跨肺上皮和内皮细胞单层的转运增加23，因此，在本文中可能是相似的机制在发挥 作用。
[0253]接下来，对上皮细胞氨基肽酶的催化活性进行分析，以测定流体流动和机械应变 是否改变了人肠上皮细胞中的细胞分化。相比于在静态Transwell系统中培养5天的细 胞，培养了 21天的Caco-2细胞分化增加了 >7倍（图16C)，所述Caco-2细胞分化通过氨基 肽酶活性的表达来测量，这与在先已发表的结果一致48。重要地，微流控装置中的流体流动 (30uL/hr)下进行的细胞培养大大加快了这一响应，在培养仅5天后氨基肽酶活性产生了 几乎9倍的增加，而且，当所述细胞在同时施加相同流体流动和周期性机械应变（10%应变， 0. 15Hz)的芯片肠中生长时，产生甚至更高的增加。这些结果与过去的研究一致，该研究证 明周期性应变可类似地增加Caco-2细胞中肠分化特异性酶的表达25。
[0254]宿主-微生物菌群共培养。人肠生理最关键的组成之一(还未在体外有效地建模) 是肠腔中正常存在的微生物群落49。为了探索在芯片肠中所生产的高度分化的肠上皮能否 支持微生物菌群的共培养，在Caco-2细胞单层的顶端表面培养正常肠微生物鼠李糖乳杆 菌GG (LGG)，并将在静态条件下的Transwell腔室中培养的细胞用作对照。在具有连续流 动（40ii L/hr)和周期性应变（10%应变，0. 15Hz)下进行微流控共培养96小时后，LGG细胞 的微菌落仍然保持紧密贴附至Caco-2单层的表面（图17A)。分别用钙黄绿素-AM和乙锭均 二聚体_1 (ethidium homodimer-l)对培养物进行的活/死细胞染色证实,在这些条件下 与LGG共培养后，Caco-2上皮细胞保持完全（>95%)存活（图17B)。当将LGG单独培养时， 其表现出细菌特异的半乳糖苷酶活性，而肠上皮细胞并不会表现出该活性（图19)。当 我们测量共培养的顶部腔室中的半乳糖苷酶活性时，该活性仍然也很高，由此证实在 这些培养条件下LGG细胞也保持存活（图17D)。
[0255]重要地，在与生长在肠细胞单层顶端表面上的活微生物进行的这些共培养条件 下，所述肠细胞单层不仅能够维持正常的屏障功能，由对TEER定量而测量的屏障完整性实 际上也随时间改善（图17C)。这一结果与如下发现是一致的：已报道细菌的益生菌菌株(包 括LGG)在体外增加肠上皮完整性50并增强人的肠屏障功能51。与此相反，在静态Transwell 系统中进行的共培养，TEER在第一天内消散，并且由于上皮单层的死亡和完全脱离，在48 小时后根本无法测量到TEER (图17C)。
[0256]人类微生物组在肠健康和疾病中起到重要作用18’52_53，因此，开发研究宿主_微生 物相互影响的体外平台应引起细胞生物学家和生理学家以及药物科学家的广泛兴趣54_55。 过去的研究已进行了肠上皮细胞与活细菌的短期共培养，来对微生物粘附56、侵入57、移位58 和生物膜形成59进行研究。但是，由于微生物过度生长和上皮存活率的丧失，微生物和宿主 细胞的长期共培养仍然不可能。这可能是由于如下方面的困难：使宿主细胞和微生物间的 生长条件相匹配 '在无抗生素培养条件下控制微生物群体密度6°或限制微生物细胞代谢 产物(例如有机酸）的生产61_62。在本文所述的实验中，LGG细胞无约束地在Transwell系 统不流动的顶端腔室中生长，这引起培养基pH的大幅下降（pH2. 5-3.0)，该条件并不符合 肠上皮细胞的存活(未示出）。然而，重要的是，芯片肠的微流控性质作为连续的生物反应器 有效地发挥作用，因此为克服这一挑战提供了方法。具体而言，芯片肠中培养基的稀释速率 (?8. Oh^1)比培养基中LGG的特定生长速率（?0. 21T1)高得多，这允许清除有机酸和未结合的LGG细胞。紧密贴附于Caco-2单层表面的LGG细胞保留于芯片肠装置中，而所有未贴附的LGG细胞均被冲走，这防止了培养物不受限制的过度生长。考虑到LGG共培养的存在使肠上皮完整性显著增加，微生物的存在显然提供了增强上皮细胞功能(例如粘蛋白分泌)的正常微环境范例(cues),这对于维持这一动态界面是必需的,这与人临床研究相一致51。
[0257]在这一实施例中所述的人芯片肠微装置的实施方式提供了可控的微平台，以对在存在相关生理学范例(relevant physiological cues)的情况下的关键肠功能进行研究和扰动，所述相关生理学范例包括周期性机械应变、流体流动以及微生物群落的共存。这一装置的特征表明，重现活肠中所经历的低水平的流体流动和剪切应力足以促进加快的肠上皮细胞分化、3D绒毛样结构的形成、以及肠屏障功能的增加；并且表明模仿正常蠕动运动的周期性机械应变的加入进一步增强了这些响应。此外，一旦在芯片肠装置中分化，所述肠上皮能够支持人肠内正常生活的微生物菌群的生长。因此，人蠕动型芯片肠可促进对肠功能的机械调控的研究，以及对宿主-微生物共生和演化的研究。考虑到其有效地重现了正常人肠的多种复杂功能，所述装置也可成为药物筛选和毒理检测的重要平台。实施例2和【背景技术】部分的参考文献[0258]1.J.C.DaVila, R.J.Rodriguez, R.B.Melchert and D.Acosta，Jr.，Annu ReVPharmacol Toxicol，1998，38，63-96.[0259]2.J.A.Kramer, J.E.Sagartz and D.L Morris，Nature Reviews Drug Discovery,2007，6.636-649.[0260]3.H.0lson, G.Betton，D.Robinson，K.Thomas，A.Monro, Gj.Kolaja，P.Lilly,J.Sanders.G.Sipes, W.Bracken，M.Dorato, K.Van Deun，P.Smith，B.Bergerand A.Heller，Regulatory Toxicology and Pharmacology，2000，32，56—67.[0261]4.K.M.Giacomini , S.M.Huang, D.J.Tweedie，L.Z.Benet, K.L.R.Brouwer,X.Y.Chu, A.Dahlin，R.EVers，V.Fischer，Κ.M.Hillgren，K.A.Hoffmaster, T.1shikawa，D.Keppler, R.B.Kim, C.A.Lee, M.Niemi, J.W.polli，Y.Sugiyama，P.W.Swaan, J.A.Ware,S.H.Wright, S.W.Yee，M.J.Zamek-Gliszczynski, L Zhang and T.1nternational，NatureReviews Drug Discovery，2010，9，215-236.[0262]5.J.Hodgson，Nal Biotechnol.2001，10，722-726.[0263]6.E.Le Ferrec, C.Chesne，P.Artusson, D.Brayden, G.Fabre, P.Gires,F.Guillou, M.Rousset, W.Rubas and M.L.Scarino, Atla-Alternatives to LaboratoryAnimals，2001，29，649-668.[0264]7.1.D.Angelis and L Turco， Current protocols in toxicology / editorialboard, Mahin D.Maincs (editor-1n-chief)…[et al.]，2011，Chapter20.[0265]8.K.-J.Kim, inCell Culture Models of Biological Barriers, ed.C.-M.Lehr,Taylor&Francis.New York，Isl edn.，2002，ch.3，pp.41-51.[0266]9.1.J.Hidalgo，T.J.Rauh and R.T.Borchardt, Gastroenterology, 1989，96，736-749.[0267]10.G.J.Mahler, Μ.B.Esch，R.P.Glahn and M.L.Shuler, Biolechnology andBioengineering,2009，104，193-205.[0268]11.J.H.Sung，J.J.Yu, D.Luo, M.L Shuler and J.C.March, Lab on aChip，2011，
【权利要求】
1.一种细胞培养系统，所述系统包含: 流控装置，所述流控装置具有连接至流体源的流体通道，所述流体源供应流体至所述流体通道； 膜，所述膜设置于所述通道内、膜支持元件之间，所述膜的至少一部分是柔性的； 膜应变机制，所述膜应变机制连结至所述膜支持元件，所述膜应变机制能够移动所述膜支持元件并引起所述膜沿所述膜的至少一个维度拉伸；以及 至少一层肠上皮细胞，所述肠上皮细胞贴附至所述膜的至少一个表面， 其中，流经所述流体通道的流体上的剪切应力小于1.0dyne/cm2。
2.如权利要求1所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力为0.008dyne/cm2 至 0.08dyne/cm2。
3.如权利要求1-2中任一项所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力约为0.01Sdyne/cm2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力可以随时间变化。
5.如权利要求4所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力可随时间从 Odyne/cm2 变化至 1000dyne/cm2。
6.如权利要求4-5中任一项所述的系统，其中，流经所述流体通道的流体上的所述剪切应力可随时间从0.008dyne/cm2变化至0.08dyne/cm2。
7.如权利要求1-6中任一项所述的系统，其中，使所述膜拉伸0%-50%。
8.如权利要求1-6中任一项所述的系统，其中，使所述膜拉伸5%-15%。
9.如权利要求1-8中任一项所述的系统，其中，使所述膜拉伸约10%。
10.如权利要求1-9中任一项所述的系统，其中，使所述膜拉伸大于15%，以产生所述肠上皮细胞的异常状况/状态。
11.如权利要求1-10中任一项所述的系统，其中，使所述膜以频率为0.01HZ-2HZ的周期性方式拉伸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的系统，其中，使所述膜以频率为0.05Hz-0.25Hz的周期性方式拉伸。
13.如权利要求1-12中任一项所述的系统，其中，使所述膜以频率为0.15Hz的周期性方式拉伸。
14.如权利要求1-12中任一项所述的系统，其中，使所述膜以频率大于0.2Hz的周期性方式拉伸，以产生所述肠上皮细胞的异常状况/状态。
15.如权利要求1-14中任一项所述的系统，其中，使所述膜以无规律的方式或间歇性的方式拉伸。
16.如权利要求1-15中任一项所述的系统，其中，所述流体以小于500μ L/hr的流速流经所述流体通道。
17.如权利要求1-16中任一项所述的系统，其中，所述流体以小于100μ L/hr的流速流经所述流体通道。
18.如权利要求1-17中任一项所述的系统，其中，所述流体以Oμ L/hr-50 μ L/hr的流速流经所述流体通道。
19.如权利要求1-18中任一项所述的系统，其中，所述流体以约30μL/hr的流速流经所述流体通道。
20.如权利要求1-19中任一项所述的系统，所述系统进一步包含至少一种贴附分子，所述贴附分子支持多个活细胞附着，所述贴附分子涂覆在所述膜的至少一面。
21.如权利要求20所述的系统，其中，所述至少一种贴附分子选自于由下列物质所组成的组: 胶原蛋白、I型胶原蛋白、MATRIGEL?、细胞外基质、层粘连蛋白、蛋白聚糖、玻连蛋白、纤连蛋白、聚D-赖氨酸、多肽、寡核苷酸、DNA和多糖。
22.如权利要求1-21中任一项所述的系统，其中，所述肠上皮细胞是哺乳动物细胞或人细胞。
23.如权利要求1-22中任一项所述的系统，其中，所述肠上皮细胞选自于由下列细胞所组成的组: Caco-2细胞、HT-29细胞、原代小肠上皮细胞、原代大肠上皮细胞、iPS细胞、ESC细胞、干细胞、潘氏细胞、隐窝细胞以及粘液分泌细胞。
24.如权利要求1-23中任一项所述的系统，其中，所述系统的所述肠上皮细胞进一步含有绒毛结构。
25.如权利要求1-24中任一项所述的系统，其中，所述系统进一步包含在所述膜的至少第二表面上的至少一层内皮细胞。
26.如权利要求1-25中任一 项所述的系统，其中，所述膜以如下方式进行设置:所述膜将所述流体通道分成第一细胞培养通道和第二细胞培养通道。
27.如权利要求26所述的系统，其中，所述第一细胞培养通道含有肠上皮细胞。
28.如权利要求26-27中任一项所述的系统，其中，所述第二细胞培养通道含有选自于由下列细胞所组成的组中的细胞: 内皮细胞、免疫细胞和结缔组织细胞。
29.如权利要求1-27中任一项所述的系统，其中，所述系统进一步含有微生物细胞或病原体。
30.如权利要求29所述的系统，其中，所述微生物细胞在所述系统中维持至少I天。
31.如权利要求29-30中任一项所述的系统,其中,所述微生物细胞选自于下列微生物所组成的组: 乳杆菌属、拟杆菌属、瘤胃球菌属、消化球菌属、消化链球菌属、双歧杆菌属、埃希氏菌属、无色杆菌属、发酵氨基酸球菌、醋酸钙不动杆菌、气单胞菌属、粪产碱菌、芽孢杆菌属、溶纤维丁酸弧菌、弯曲杆菌属、大肠弯曲杆菌、艰难梭状芽胞杆菌、索氏梭状芽胞杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、黄杆菌属、分枝杆菌属、支原体属、类志贺邻单胞菌、痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、布氏瘤胃球菌、八叠球菌属、金黄色葡萄球菌、咽峡炎链球菌、韦荣球菌属、弧菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG、短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
32.如权利要求29-30中任一项所述的系统，其中，所述微生物细胞是病原性的。
33.如权利要求29或32中任一项所述的系统,其中，所述病原体选自于由下列病原体所组成的组: 肠毒性大肠杆菌、沃氏嗜胆菌、志贺氏杆菌属、耶尔森氏菌属、邻单胞菌属、弧菌属、气单胞菌属、弯曲杆菌属、隐孢菌属、球虫、沙门氏菌属、幽门螺杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、凯道古沙门氏菌、拟杆菌属、梭状芽孢杆菌属、厚壁菌门、痢疾志贺氏菌、肠道沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、李斯特菌属、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、变形杆菌属、霍乱弧菌、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌以及空肠弯曲杆菌；轮状病毒、诺瓦克样病毒、腺病毒、星状病毒、札幌样病毒、隆病毒、冠状病毒、小核糖核酸病毒、疱疫病毒、诺如病毒；念珠菌属、曲霉属、白色念珠菌；单细胞寄生虫、多细胞寄生虫、阿米巴、蠕虫、绦虫、原虫、吸虫、蛔虫、蛲虫、钩虫、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫和溶组织内阿米巴。
34.如权利要求29-33中任一项所述的系统，其中，所述微生物细胞是好氧的。
35.如权利要求29-33中任一项所述的系统，其中，所述微生物细胞是厌氧的。
36.如权利要求29-35中任一项所述的系统，其中，所述系统既含有好氧微生物细胞、又含有厌氧微生物细胞。
37.如权利要求29-36中任一项所述的系统，其中，所述微生物细胞存在于所述第一细胞培养通道中。`
38.如权利要求29-37中任一项所述的系统，其中，所述系统进一步包含厌氧气体腔室，所述厌氧气体腔室与所述第一细胞培养通道的至少一部分接触。
39.如权利要求38所述的系统，其中，在流经所述第一细胞培养通道的流体中建立氧气梯度。
40.如权利要求1-39中任一项所述的系统，其中，所述膜是至少部分多孔的。
41.如权利要求40所述的系统，其中，所述膜中的至少一个孔径沿宽度维度为0.5 μ m-10 μ m。
42.如权利要求1-41中任一项所述的系统，其中，所述膜包含PDMS。
43.如权利要求1-42中任一项所述的系统，其中，由真空压力引起所述膜拉伸。
44.如权利要求43所述的系统，其中，所述系统进一步包含: 所述装置的第一腔室壁，所述第一腔室壁设置为与至少一个流体通道邻接，其中，所述膜安装至所述第一腔室壁； 第一操作通道，所述第一操作通道与所述第一腔室壁另一侧的至少一个流体通道邻接，其中，在所述第一操作通道和所述至少一个流体通道之间施加的压力差引起所述第一腔室壁朝第一所需方向弯曲，从而沿由所述膜确定的平面扩张或收缩；以及 真空系统，所述真空系统在所述至少一个流体通道和至少一个操作通道之间提供压力差，其中，所述膜响应所述压力差而沿所述平面拉伸。
45.如权利要求44所述的系统，所述系统进一步包含: 所述装置的第二腔室壁，所述第二腔室壁设置为与至少一个流体通道邻接，其中，所述膜的另一端安装至所述第二腔室壁；以及 第二操作通道，所述第二操作通道设置为与所述第二腔室壁另一侧的至少一个流体通道邻接，其中，所述第二操作通道和所述至少一个流体通道之间的压力差引起所述第二腔室壁朝第二所需方向弯曲，从而沿由所述膜确定的平面扩张或收缩。
46.如权利要求1-45中任一项所述的系统，其中，所述流控装置包括微流控芯片。
47.如权利要求1-46中任一项所述的系统，其中，所述系统连接至或连结至第二细胞培养系统，所述第二细胞培养系统含有非肠来源的细胞或组织。
48.如权利要求47所述的系统，其中，所述第二细胞培养系统含有肝细胞或组织。
49.一种肠类器官的制造方法，所述方法包括: 向权利要求1-48中任一项所述的细胞培养系统提供适于对肠上皮细胞进行维持的流体，以使得所述流体与所述肠上皮细胞接触；以及对所述肠上皮细胞进行体外培养。
50.如权利要求49所述的方法，所述方法进一步包括将所述细胞至少培养至绒毛结构明显。
51.一种用于对肠效应剂进行评价的系统，所述系统包含权利要求1-48中任一项所述的细胞培养系统。
52.一种对肠治疗进行评价的方法，所述方法包括: 将权利要求1-48中任一项所述的系统中的细胞与至少一种候选肠治疗效应剂接触；以及 对所述系统中所述细胞 的响应进行测量，以确定所述至少一种候选肠效应剂的效果。
【文档编号】C12N5/071GK103502426SQ201280020763
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年2月28日 优先权日:2011年2月28日
【发明者】唐纳德·E·英格贝尔, 金贤政 申请人:哈佛大学校长及研究员协会