制备纯化的干细胞组分的高安全性方法

制备纯化的干细胞组分的高安全性方法
【专利摘要】在此描述了一种用来制备纯化的源于脂质的干细胞组分的高安全性方法，在该方法中使用了特别设计的单一采集装置，从而减少了含有干细胞的材料经过的通道和操作的数量，将污染、材料损失、以及样品无意中互换的风险降到最低，并进一步简化了采集原材料的人员与进行干细胞分离的专业人员之间的接口和协作。
【专利说明】制备纯化的干细胞组分的高安全性方法
[0001]现有技术状况
[0002]干细胞在美容和医疗的实践中获得了越来越多的关注，这与它们生成新生物组织的能力有关，由干细胞生成的新生物组织可以应用于由于各种原因失去了这些生物组织或其再生能力的病人。
[0003]特别地，成人干细胞，例如源于脂质或骨髓的干细胞，吸引了特别的关注，原因是它们具有更加可控的功效，而且可以不受适用于胚胎干细胞的道德限制的约束。
[0004]源于脂质的干细胞的一个典型应用领域是为了美容目的的组织填充:在此，需要接受美容疗法的病人捐献出其自身的一部分脂质组织(脂肪组织提取物(Iipoaspirate));通过以下方式加工处理该脂质组织:实验室回收纯化的细胞组分，后者被注射回病人的需要进行填充的身体区域。获取到的细胞组分被称为血管基质组分(SVF)，代表了从脂质组织中提取到的有核细胞的总数量。典型地，这些细胞中有10至20%是干细胞，也称为间充质干细胞。它们具有多能性，能够修复或再生多种类型的人体组织。使用自体同源的脂质组织避免了免疫反应和组织排斥的风险。此外，这些提取出来的细胞接下来可以被长时间冷冻储存在液氮中，以供干细胞提供者支配，在后续治疗时使用，包括在人体干细胞疗法中使用干细胞。
[0005]制备纯化的源于脂质组织的细胞组分的方法在现有技术中是已知的。 [0006]这些方法的步骤大体包括最初的脂质原材料的获取、干细胞成分的选择性提取、提取后的脂质基质的去除，以及最终的洗涤、纯化、和制备具有方便应用的浓度和体积的干细胞组分。这些方法，由于包括含有干细胞的材料流过若干移液管、导管、贝克离心管(beckers)等等的步骤，涉及到相当大的细菌污染和/或材料损失的风险，因此这些方法需要非常严格的规程，涉及到环境和所用不同材料的无菌性、多次洗涤以回收可能粘附的材料，上述因素均增加了方法的总成本。多次的容器转移还增加了源自不同病人的样品被无意中互换的风险，从而使最终的干细胞接受者遭受到非自体同源的干细胞被植入的风险。
[0007]上述规程还要求采集脂质原材料的操作者与分离干细胞的实验室之间严密合作和相互理解。有时原材料会装在非最优化的容器中被递送(例如太大、封装不适当、包装错误、剂量非最优化等等):在所有这些情况下，实验室就会被迫以次最优化的起始样品进行操作，这可能会影响到最终产品的品质。
[0008]本发明的目的在于提供一种改进的方法，用来制备源于脂质组织的干细胞组分，该方法对病人来说更安全，对操作者来说更迅捷。
[0009]本发明进一步的目的在于，简化/标准化采集脂质原材料的操作者与负责干细胞分离的操作者之间的接口和协作。
[0010]本发明进一步的目的在于，减少生产纯化的细胞组分过程中所包括的步骤和操作的数量。
[0011]本发明进一步的目的在于，使得那些与干细胞使用有关的医疗/美容方法更加迅速和有效。发明概要
[0012]本发明涉及一种获取源于脂质的干细胞组分的方法，基本上基于以下步骤:
[0013](a)采集或接收含有干细胞的脂质组织样品；
[0014](b)使用合适的水性缓冲液洗涤步骤(a)得到的样品；
[0015](C)使用能够从含有干细胞的脂质组织中提取干细胞的酶培养步骤(b)得到的样品;
[0016](d)从步骤(C)得到的产品中回收水相；
[0017](e)对步骤(d)获得的水相进行纯化；
[0018](f)对步骤(e)获得的水相进行滴定，并可选地对水相进行稀释以获取具有所需浓度和体积的干细胞组分最终产品。
[0019]本发明的一个必要特征在于，在贯穿至少上述步骤(a)、(b)、(C)的过程中，含有干细胞的材料在同一个采集装置(在此称为“单一采集装置”或“S⑶”)内进行处理。单一采集装置的使用避免了被处理的材料与外界环境相接触，将与多次容器转移相关的被污染的风险、活性材料的损失降到最低，并且简化了获取纯化的干细胞组分所需的总体操作过程。
[0020]单一采集装置是能够吸取和排出液体的无菌容器；它以注射器为代表，但不限于注射器。单一采集装置可以具有大的灌装容量(例如20至IOOmL),以允许从相应的脂质材料中大规模采集干细胞。单一采集装置优选是透明或半透明的，具有一个用于指示最佳灌装量的标记，和/或用于书写或贴标签的区域，以标示样品来源。
[0021]将会从描述中明显得出，根据所涉及的特定过程步骤，单一采集装置完成了采集器(如同移液管)、相分离器、以及过程反应器的功能；因此，所有这些功能都被更加有利地执行，而不需要将样品从一个容器转移到另一个容器，和/或使得样品与外界环境相接触。
[0022]单一采集装置基本上被用在贯穿步骤(a)、(b)、(C)的过程中；然而，如果需要，单一采集装置也可以继续贯穿在步骤(d)、(e)、(f)中的一个或多个步骤中使用，具有与上面描述的相同的功能和优点。
[0023]基于以上前提，本发明的方法包括以下步骤:
[0024](a)在单一采集装置中，采集或接收含有干细胞的脂质组织样品;
[0025](b)在所述单一采集装置中，使用合适的水性缓冲液洗涤步骤(a)得到的样品；
[0026](C)在所述单一采集装置中，使用能够消化脂质组织并从中提取干细胞的酶培养步骤(b)得到的样品；
[0027](d)从步骤(C)得到的产品中回收水相；
[0028](e)对步骤(d)获得的水相进行纯化；
[0029](f)对步骤(e)获得的水相进行滴定，必要时再对水相进行稀释以获取具有所需浓度和体积的干细胞组分最终产品。
[0030]发明详细说明
[0031]步骤(a)
[0032]在本步骤中，含有干细胞的脂质组织样品被从合适的来源吸取到单一采集装置中。
[0033]脂肪组织提取物是典型的脂质组织样品。所述样品必须是液体或至少是流体，以实现本方法的目的；流动性不够的材料可以通过进一步均化和/或加入液体介质，例如缓冲溶液，来进行补偿。
[0034]在步骤(a)中，将单一采集装置与脂质组织样品相接触，操作它以吸取合适体积的脂质组织；在完全填满所述单一采集装置的可用容量之前，中止吸入操作，从而为洗涤用缓冲液以及下文将描述的其他试剂留出进一步吸入的容量(典型地是单一采集装置容量的
一半)。
[0035]步骤(a)中“采集或接收”的表述解释了以下事实:该步骤可以由与执行步骤(b)-(f)的机构/操作者相同或不同的机构/操作者来执行:在第一种选择中，步骤(a)中的操作者“采集”脂质样品并直接依照步骤(b)-(f)对其进行加工处理；在第二种情况下，操作者“接收”由别人采集到的脂质样品，然后依照步骤(b)-(f)对其进行加工处理；典型地，步骤(a)可以由医院或美容中心执行；步骤(b)-(f)由专业从事干细胞加工处理的实验室执行。
[0036]在上述的第二种选择中，本方法尤其具有以下优势，它消除了现有技术的已知方法中发生污染的主要原因，在这些已知方法中，脂肪组织提取物被收集入第一个容器，被储存、寄送至外部的实验室、然后转移至合适的反应器。所有这些转移/操作都会涉及到样品与外界环境的接触，带来与之相关联的污染的风险，并伴随有不可避免的部分产品损失。这些缺点和风险现在可以通过本方法被最小化。
[0037]使用单一采集装置的进一步的优势在于，为最初的操作者即采集脂质样品的操作者，提供了标准化容器，该标准化容器在灌装容量、空隙容量、气密性、包装材料等等各个方面均适当调整，使其适合于进一步的加工处理。
[0038]以下步骤可以紧接着步骤(a)被执行；或者，部分充满的单一采集装置在可以保持干细胞活性的条件下被储存一段时间，直至依照步骤(b)-(f)对其进行进一步加工处理的时候。
[0039]步骤(b)
[0040]在本步骤中，在步骤(a)中所吸取的脂质样品在所述单一采集装置内部被使用水性缓冲液进行洗涤。
[0041]为了做到这点，从步骤(a)中得到的部分充满的单一采集装置被操作以吸取一定体积的缓冲溶液，该缓冲溶液与所述单一采集装置内存在的脂质组织样品混合；例如可以通过对单一采集装置施加振动/摇动来促进两相之间的均质混合。所用的缓冲溶液是与干细胞具有相容性的溶液，典型地是补充有用作酶营养素的钙盐和/或镁盐的磷酸盐缓冲液(PBS);缓冲溶液和脂质组织的体积比是例如从大约0.5:1.5至大约1.5:0.5，优选为大约1:1。
[0042]在上述混合/均质化之后，所述单一采集装置被静置，直至两相(脂质相与水相)分离。然后所述单一采集装置被操作以排出水相，同时保留脂质相；特别地，当所述单一采集装置为注射器时，这可以通过将其朝下放置(针头向下)来达成:这将导致脂质相移动至注射器的上半部分，在针头远端，同时水相聚集到相反的部分，靠近针头:在这种状态下，施加在注射器柱塞上的压力将使水相从针头排出；适当地保持压力，直至水相/脂质相界面到达针头处:此时水相(将被弃置)基本上已被排出，注射器里仅含有脂质相，接下来的步骤将基于该脂质相来执行。
[0043]上面描述的洗涤步骤可以被重复更多次，例如一或两次，直至达到脂质相所需的洗涤程度。
[0044]步骤(c)
[0045]在本步骤中，从步骤(b)中得到的洗涤后的脂质相在所述单一采集装置内部，用能够从含有干细胞的脂质材料中提取干细胞的酶进行培养。
[0046]为了执行这一步骤，所述单一采集装置被操作以进一步吸取含有所述酶的液体介质的一个等分试样。该酶典型地是释放酶，该液体介质典型地是缓冲液，优选为经过酶活性优化的磷酸盐缓冲液(PBS)，特别是补充有钙盐和/或镁盐；所述液体介质具有已知的酶滴定值，以允许操作者吸入所需的可重复的酶量。
[0047]这样得到的被充满的单一采集装置，可选地被插入到密封的封袋里，随后被放入培养器中，典型地是具有振荡托盘的温度可控的烘箱中。在培养之前，所述单一采集装置优选地被搅动以使内含物质被均化；然后继续在培养器内通过托盘的振荡运动进行混合。
[0048]所述培养器可以在如下条件下进行操作，但不限于如下条件:培养时间为20-80分钟，优选为30-60分钟，最优选为45分钟；温度为30-45°C，优选为37°C ;搅动:l_5rpm(转每分钟)，优选为2或3rpm。
[0049]步骤(d)
[0050]在本步骤中，酶反应被阻止，脂质相被去除，水相(含有被酶解离出来的干细胞)被回收用于进一步依照步骤(e)-(f)处理。
[0051 ] 为了执行这一 步骤，所述单一采集装置被从所述培养器中移出，从封袋(可选地使用)中取出；培养悬浮液被与酶钝化液的一个等分试样相混合，例如，所述酶钝化液可以是合适浓度的缓冲白蛋白溶液，例如重量分数可以是1%。
[0052]两种液体混合的合适模式在于，将钝化液吸入所述单一采集装置内，摇动单一采集装置以获得完全均化，将所述单一采集装置静置，直至脂质相与水相分离，然后回收水相。
[0053]水相的回收可以通过将其从所述单一采集装置中射出(喷射模式)来实现，或者，作为另一种选择，将其保留在所述单一采集装置内(保留模式)来实现。
[0054]“喷射模式”可以通过将注射器朝下放置(针头向下)来实施:这将导致脂质相移动至注射器的上半部分，远离针头，同时水相聚集到相反的部分，靠近针头:在这种状态下，施加在注射器柱塞上的压力将使水相从针头射出；适当地保持压力，直至水相/脂质相界面到达针头处:此时水相(将被收集用于进一步依照步骤(e)-(f)处理)基本上已从注射器中排出；注射器里含有干细胞已被提取出的脂质相，所述脂质相现在可以被另行射出而排出。
[0055]作为所述喷射模式的替代性选择，“保留模式”可以通过将注射器朝上放置(针头向上)来实施:这将使脂质相移动至注射器的靠近针头的部分，同时水相聚集到相反的部分，远离针头:在这种状态下，施加在注射器活塞上的压力将使脂质相从针头射出；可以采取适当措施来避免从朝上的注射器中射出的液体发生飞散:例如，在喷射前，针头可以穿过烧瓶的橡皮塞，然后射出的液体可以被收集到所述烧瓶中。适当地保持压力，直至水相/脂质相界面到达针头处:此时脂质相(将被弃置)基本上已被从注射器中排出，注射器里含有水相，该水相将被用于进一步依照步骤(e)-(f)处理。
[0056]在步骤(d)结束时，从所述单一采集装置中回收水相并另行对其进行处理，除非，所述单一采集装置具备允许对其进行离心分离的形状和坚固度:在这种情况下，随后的过程步骤也可以在单一采集装置内执行，从而为整个方法过程带来进一步的保护/简化。
[0057]如果不适用于离心分离，被倒空的单一采集装置优选地使用合适的溶液(优选使用上面描述的钝化液)洗涤一次或多次，以回收可能粘附在其表面上的干细胞，所有得到的水相被合并，用于进一步依照步骤(e)-(f)处理。
[0058]步骤(e)
[0059]在本步骤中，由步骤(d)得到的(合并的)水相被纯化，以除去来源于原始脂质样品的可能存在的可溶性/不可溶性杂质。一般通过离心分离、去除上清液、沉淀物再悬浮、过滤来实现样品的纯化。离心分离一般可以在如下条件下被执行:离心速度为300-500G，优选为350-450G，更优选为400G ;离心时间为1_10分钟，优选为3_7分钟，更优选为5分钟。
[0060]在去除上清液之后，沉淀物再悬浮可以通过使用合适的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液PBS)或上面描述的钝化液来实现。
[0061]上述的离心分离和再悬浮可以被重复一次或多次，以增加微粒(干细胞)组分与水溶性杂质的分离纯化度。
[0062]经过(最终的)再悬浮的沉淀物随后被过滤一次或多次，以去除相对于干细胞组分来说粒度过大的微粒杂质。为了做到这点，悬浮的沉淀物通过具有合适孔径的薄膜被过滤，该薄膜的孔径例如是80-120 μ m,优选为大约100 μ m,将粒度过大的微粒材料保留下来，而让(较小粒度的)干细胞在过滤过程中通过滤膜进入滤液。所得到的液体可以使用更细的过滤器被再次过滤，该更细的过滤器的孔径可以是60-80 μ m,优选为大约40 μ m,以达成更精细地去除过大微粒的目的 。最后得到的包含纯化的干细胞的滤液用于进一步依照步骤(f)处理。
[0063]步骤(f)
[0064]在本步骤中，从步骤(e)中得到的纯化液体被滴定，然后被稀释以获得具有所需浓度和体积的干细胞组分最终产品。
[0065]滴定可以通过以下步骤进行，通过量取精确体积(例如50μ L)的步骤(e)得到的液体，并通过合适的计数仪器得出其干细胞计数值，该计数仪器典型地是荧光激活细胞分类仪(FACS)，具备得出源于脂肪的间充质干细胞数量的优化的计数途径；或者，也可以通过其他仪器，例如血球计数器，来间接地对干细胞含量进行估值:该血球计数器计数得出有核细胞的总数量，而在本方法的这个阶段，有核细胞的总数中有10-20%被发现是干细胞。优选地，两次或多次读数并计算其平均值，以获得更高的精度。
[0066]根据已知的滴定值，在必要时，从步骤(e)得到的液体可以被稀释至一个合适的浓度。可以通过使用合适的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液PBS)或上面描述的钝化液来实现液体的稀释。最终浓度值根据干细胞组分最终产品所需的功效水平来进行选择；有用的、非限制性的干细胞浓度值可以为(以有核细胞总数来表示)IO8至IO4细胞数/mL，优选为IO7至IO5细胞数/mL，更优选为IO6细胞数/mL。
[0067]干细胞组分最终产品随后可以被包装在合适的容器(例如微型注射器)中，作为具有合适体积的单元，例如ImL的单元；选择最终体积，使其与干细胞组分最终产品的施用场合(例如皱纹填充、组织再生等等)相兼容并操作便利。
[0068]干细胞组分最终产品优选尽快使用，或者，作为另一种选择，它在合适的无菌和温度条件下被储存，直至被使用。[0069]在任何源于脂质的干细胞有作用的应用中均可以使用它。非限制性的例子是在美容或再生治疗的领域中应用，特别是组织填充、创伤修复、组织或器官再生。这样获得的干细胞组分及其医疗用途构成本发明的一部分。
[0070]下面对依照本发明的合适的、非穷举的方法过程进行了描述。
[0071]实施例1
[0072]1.1使用钙/镁磷酸盐缓冲液洗涤
[0073]—个IOOmL的注射器(单一采集装置)，含有50mL脂肪组织提取物原材料，被加入50mL含有钙盐和镁盐的标准杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’ s PBS buffer)。所述注射器(单一采集装置)被翻转颠倒10次以使内含物质均化，然后以竖直姿态(针头向下)静置约5分钟，以使得水相和脂质相分离。挤压注射器柱塞，以射出整个下层相(水相)，将脂质相保留在注射器中。该洗涤过程被重复多次，所述射出的水相被弃置。
[0074]1.2使用释放酶培养
[0075]步骤1.1所得到的注射器(单一采集装置)中含有经过洗涤的脂质相，其被操作以吸取酶试剂，并使酶试剂的浓度达到0.28活力单位/mL (ffunsch Units/ml)。所述酶试剂预先按照以下方法制备，将0.028活力单位/μ L (ffunsch Units/μ L)的释放酶(采用含有钙盐和镁盐的杜氏磷酸盐缓冲液稀释的MNP-S酶)母液用上面描述的钙/镁磷酸盐缓冲液以1:500的体积比进行稀释。
[0076]按此灌装的注射器(单一采集装置)被进一步操作以吸入20mL无菌空气，翻转颠倒10次以使内含物质均化，封装在封袋中并放置于具有振荡托盘的培养器内，预加热至37 0C。培养过程在37°C下进行45分钟，并伴随3rpm的振荡。
[0077]1.3释放酶的钝化失活
[0078]在培养时间期满之后，振荡被中断，所述注射器(单一采集装置)被从培养器中移出，被从封袋中取出，并被加入等体积的白蛋白溶于杜氏磷酸盐缓冲液形成的质量分数为1%的溶液。按此灌装的注射器(单一采集装置)被进一步操作以吸入5mL无菌空气，翻转颠倒10次以使内含物质均化；然后注射器(单一采集装置)被以竖直姿态(针头向下)静置5分钟，以使得水相和脂质相分离。
[0079]1.4水相的回收
[0080]挤压所述注射器(单一采集装置)的柱塞，以射出整个下层相(水相):含有干细胞的水相被回收入离心分离试管(标记为“第一回收物”)。遗留在所述注射器(单一采集装置)中的脂质相被另行射出并弃置；然后依照步骤1.3中所描述的过程，使用1%的白蛋白溶液洗涤空的注射器(单一采集装置)，洗涤液被收集入另一个离心分离试管(标记为“第二回收物，，)。
[0081]1.5第一次离心分离以及沉淀物再悬浮
[0082]步骤1.4所得到的两试管(第一及第二回收物)在20°C下以400G的离心速度被离心分离5分钟。所有上清液被移除；使用20mL的白蛋白溶于磷酸盐缓冲液形成的质量分数为1%的溶液，手动地使第二回收物试管中的沉淀物再悬浮；所得的悬浮液被加入到第一回收物试管中，用于对其中存在的沉淀物进行再悬浮。
[0083]1.6过滤，第二次离心分离以及沉淀物再悬浮
[0084]步骤1.5结束时所得到的悬浮液通过两个随后的步骤被过滤，使用的是孔径分别为100和40 μ m的过滤器。滤渣被弃置。最后得到的含有干细胞的液体在20°C下以400G的离心速度被离心分离5分钟。上清液被去除，使用5mL的白蛋白溶于磷酸盐缓冲液形成的质量分数为1%的溶液对沉淀物进行再悬浮。
[0085]1.7 滴定
[0086]使用ImL的移液管，从步骤1.6所得到的过滤后的悬浮液中采集两份50 μ L的样品(血管基质组分，SVF),并将其嵌入血球计数器以供读数。计算两次读数(表示为总的有核细胞数量，即白细胞计数/mL，WBC/ml)的平均值，以获得溶液的精确滴定值。
[0087]也可以对ImL步骤1.6所得到的溶液的样品进行干细胞的直接计数:样品以1300G的离心速度被离心分离5分钟；去除上清液，使用0.440 μ L的荧光激活细胞分类(FACS)缓冲液(磷酸盐缓冲液+1%的人血清)对沉淀物进行再悬浮；将所得溶液使用合适的抗体培养20分钟，加入Versalyse溶血剂和干细胞计数溶液，然后在Navios细胞荧光仪(sytofluorimeter)上进行读数,估算样品中存在的干细胞的数量,并据此得出相应的干细胞浓度。
[0088]1.8稀释至标准浓度以及包装
[0089]基于步骤1.7测量得到的滴定值，使用白蛋白溶于磷酸盐缓冲液形成的质量分数为5%的溶液对步骤1.6所得到的溶液的剩余部分进行稀释，至其浓度和体积达到便于干细胞疗法实际操作的水平。浓度的有用范围是0.5至3X IO6白细胞计数/mL(WBC/ml)。所得到的溶液被最后分装 到ImL的无菌注射器中，然后被包装并密封，以供远程运输并递送至最终使用者。
【权利要求】
1.一种制备源于脂质组织的干细胞组分的方法，包括以下步骤: (a)采集或接收含有干细胞的脂质组织样品； (b)使用合适的水性缓冲液洗涤步骤(a)得到的样品； (C)使用能够消化脂质组织并从中提取干细胞的酶培养步骤(b)得到的样品； (d)从步骤(C)得到的产品中回收水相； (e)对步骤(d)获得的水相进行纯化； (f)对步骤(e)获得的水相进行滴定，必要时对所述水相进行稀释以获得具有所需浓度和体积的干细胞组分最终产品， 其中，在贯穿至少所述步骤(a)、(b)、(c)的过程中，含有干细胞的材料在单一采集装置(SCD)内进行处理，所述单一采集装置执行采集器、相分离器以及过程反应器的功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单一采集装置具有20ml至IOOmL的灌装容量。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其中，所述单一采集装置是注射器，所述注射器上可选地设有一个或多个用于指示最佳灌装体积的标记，和/或设有用于书写或贴标签的区域。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其中，所述脂质材料是脂肪组织提取物(IipoaspirateX
5.根据权利要求1-4所述的方法，其中，所述步骤(a)与所述步骤(b-d)由两个不同的操作者分别来执行，所述两个不同操作者处于彼此远离的位置。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中，在所述步骤(b)中，所述缓冲液是补充有酶的营养盐的磷酸盐缓冲液(PBS)。
7.根据权利要求1-6所述的方法，使用注射器作为单一采集装置，其中的步骤(b)和/或(C)包括将所述注射器朝下放置(针头向下)或朝上放置(针头向上)，随后将靠近针头的物相注射出去。
8.根据权利要求1-7所述的方法，其中，在所述步骤(c)中，所述酶是释放酶，所述培养在30°C~45°C的温度下进行20分钟~80分钟。
9.根据权利要求1-8所述的方法，其中，在所述步骤(d)中，将培养后的混合物与含有白蛋白的溶液混合，然后弃置脂质相，并回收水相以供后续的方法步骤使用。
10.根据权利要求1-9所述的方法，其中，在所述步骤(d)~(e)中的一个或多个步骤中，所述含有干细胞的材料存在于所述单一采集装置内。
11.根据权利要求1-10所述的方法，其中，所述步骤(e)中的所述纯化通过离心分离和/或过滤来执行。
12.根据权利要求1-11所述的方法，其中，所述干细胞组分最终产品被制成一个或多个l-5mL的单元，所述单元包含的总的有核细胞浓度为IO8至104。
13.由权利要求1-12所述的方法获得的干细胞组分。
14.根据权利要求13所述的干细胞组分，作为一种原料，用于组织填充、创伤修复、组织或器官再生。
【文档编号】C12N5/071GK103842496SQ201280021056
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2012年9月28日
【发明者】詹尼·苏塔迪, 缇绮娅诺·泰隆 申请人:瑞士干细胞基金会