成纤维细胞生长因子的热稳定变体的制作方法

成纤维细胞生长因子的热稳定变体的制作方法
【专利摘要】本技术涉及经改造的人成纤维细胞生长因子-2（FGF2）蛋白质及其使用方法。特别地，该方法和组合物涉及与野生型蛋白质相比较具有增加的热稳定性的FGF2突变体，和在胚胎干细胞的培养中使用该蛋白质的方法。
【专利说明】成纤维细胞生长因子的热稳定变体
[0001]相关申请
本申请要求于2011年3月I日提交的美国临时申请61/448，107的利益，所述美国临时申请的完整内容通过引用并入本文。
发明领域
[0002]本申请的技术涉及具有增加的热稳定性的经改造的成纤维细胞生长因子-2(FGF2 )，及其用于培养胚胎干细胞的用途。
[0003]发明背景
人胚胎干细胞一般在含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白质的培养基中培养。生长因子通常以成纤维细胞饲养层的形式或通过使用成纤维细胞条件培养基供应。用重组生长因子和细胞因子补充此类培养基帮助加强胚胎的和诱导的多能干细胞二者的自我更新和分化。
[0004]在这点上，成纤维细胞生长因子-2 (FGF2)是人胚胎干细胞培养基的重要组分，因为它帮助维持细胞处于未分化状态。因此，FGF2的一个功能是延长细胞的多能性时期并且因此延长其分化成多种不同细胞类型的能力。参见Xu C等人(2005)泣6?(6^7^23:315-323。足够高浓度的FGF2允许在不含成纤维细胞的成纤维细胞非条件培养基中培养人胚胎干细胞。参见Levenstein ME等人(2006)汾e? &77.524:568-574。
[0005]然而，当与胚胎干细胞在37°C温育延长的时期时，FGF2在成纤维细胞非条件培养基中比在成纤维细胞条件培养基中更快速降解。参见Levenstein ME等人(2006) 5?6?Cfe77524:568-574ο因此，通常需要每天用新鲜FGF2补充非条件培养基，以便维持培养物中的有效浓度。从成本角度来看，FGF2在培养物中的短半衰期在工业中尤其是在采用大规模细胞培养以产生基于干细胞的治疗学的制造方案的背景中构成关注。
`[0006]发明概述
一般而言，本公开内容提供用于培养胚胎干(“ES”)细胞的组合物和方法。具体地，公开内容提供与野生型FGF2相比较，具有增加的热稳定性的FGF2变体。
[0007]在一些实施方案中，组合物包含编码选自下述的多肽的分离多核苷酸:(i)SEQ IDNO: 2的变体或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换；和(ii)与SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自 Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S 和 C96T 的至少一个氨基酸置换。
[0008]在一些实施方案中，编码的多肽包含氨基酸置换Q651、NlllG和C96S。在一些实施方案中，权利要求1的分离多核苷酸，其中编码的多肽包含SEQ ID N0:8。
[0009]在另一个方面，公开内容提供包含编码选自下述的多肽的分离多核苷酸的表达载体:(i)SEQ ID NO: 2 的变体或其片段，其包含选自 Q65L、Q651、Q65V、NI 11A、NI 11G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换；和(ii)与SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、NI 11A、NI 11G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换。在一些实施方案中，编码的多肽包含氨基酸置换Q651、NlllG和C96S。在一些实施方案中，表达载体包含编码SEQ ID N0:8的多肽的多核苷酸。[0010]在另一个方面，公开内容提供选自下述的分离多肽:(i) SEQ ID NO:2的变体或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换；和
(11)与SEQID NO:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换。在一些实施方案中，多肽包含氨基酸置换Q651、N111G和C96S。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID N0:8。
[0011]在另一个方面，本公开内容提供用于培养胚胎干细胞的方法，其包括在包含有效量的权利要求6的多肽的不依赖于饲养细胞的培养基中培养胚胎干细胞，其中所述有效量包含使细胞维持具有未分化形态至少5传代所需的量。在一些实施方案中，不依赖于饲养细胞的培养基是hESF9、mTeSRl或STEMPR0?。在一些实施方案中，有效量的多肽是约1.0ng/μ 1-约100 ng/μ I培养基。在一些实施方案中，胚胎干细胞是人ES细胞、小鼠ES细胞、牛ES细胞或猫ES细胞。
[0012]在另一个方面，本公开内容提供用于维持人胚胎干细胞处于未分化状态的方法，其包括使人胚胎干细胞与有效量的包含SEQ ID Ν0:8的多肽或SEQ ID NO:4的变体接触，所述多肽或变体包含氨基酸置换Q561、N92G和C87S。在一些实施方案中，有效量的多肽是约 1.0 ng/ μ 1-约 100 ng/ μ I 培养基。
[0013]附图简述
图1:人FGF2 (FGF-碱性)。N末端前肽是有下划线的，随后为146个氨基酸成熟分泌肽。四个半胱氨酸以粗体下划线显示。
[0014]图2:在人细胞中表达的野生型FGF2的SDS-PAGE考马斯染色和蛋白质印迹。
[0015]图3:具有共同结构的人FGFl (3FJF ;左)和FGF2 (1EV2 ;右)的X射线晶体结构。
[0016]图4:人FGFl和FGF2的配对序列比对。四个改造的靶残基是加黑框的。
[0017]图5 (a)- (e): (a)与其受体结合的人FGF2的X射线晶体结构。所有四个半胱氨酸都突变为丝氨酸以改善可溶性。改造的靶残基的定位是(b) Q65、(c) Nlll、(d) C78和(e) C96。
[0018]图6:来自人细胞的三个经改造的FGF2的表达分析。
[0019]图7:经由SDS-PAGE考马斯染色显现的QNCm FGF2培养物上清液(左图)和纯化蛋白质(右图)。纯化蛋白质的抗FGF2蛋白质印迹(中图)。
[0020]图8:FGF2 QNCm在基于细胞增殖的测定中，显示与野生型FGF2相比较增加的热稳定性。
[0021]图9:FGF2 QNCm (由?表示)在基于细胞增殖的测定中，显示与商购可得的野生型FGF2 (由 表示)相比较增加的活性。
[0022]图10 (a)- (d): (a)良好外观的人ES细胞集落；(b)Nanog启动子(多能性相关基因，即干细胞基因)的mCherry报道基因。在分化细胞中发现Nanog的丧失或下调；(c)分化干细胞集落显示“环形” ；(d) C的mCerry染色。
[0023]发明详述
总则-应当理解本发明的特定方面、方式、实施方案、变化和特点在下文以不同详细水平描述，以便提供本发明的基本理解。
[0024]本公开内容涉及与野生型蛋白质相比较具有增加的热稳定性的经改造的FGF2分子。经改造的分子在人细胞培养物中具有比野生型蛋白质更长的半衰期，并且更有利于重组蛋白质在人细胞中的大規模生产。
[0025]本发明的一个或多个实施方案的细节在下文伴随说明书中阐述。尽管目前描述了合适方法和材料，但与本文描述那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。本发明的其他特点、目的和优点从说明书和权利要求书来看将是显而易见的。一般地，酶促反应和纯化步骤根据制造商的说明书执行。
[0026]本文描述的技术和程序一般根据本领域的常规方法和本文件自始至终提供的多个一般參考文献执行。一般分别參见，Protocols in Molecular第 1-1II卷，Ausubel,编辑(1997) ;Sambrook 等人，#Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) -,DNACloning:A Practical Approach,第 I 和 II 卷，Glover,编辑(1985) 'OligonucleotideSynthesis, Gait,编车茸(1984) -,Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins,编车茸(1985) ；Transcription and Translation, Hames & Higgins,(1984) -Animal CellCulture, Freshney, (1986) -,Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)；Perbal^ A Practical Guide to Molecular Cloning；Meth.Enzymol., (AcademicPress, Inc., 1984) 'Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，Miller & Calos,编辑(Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987);和#<9认 Enzymol.,第 154 和 155 卷，Wu& Grossman和Wu，编辑。一般地，在本文中使用的命名法和在下文描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学与杂交中的实验室程序是本领域众所周知和通常采用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。标准技术或其修改用于化学合成和化学分析。本文引用的所有參考文献整体和为了所有目的通过引用并入本文，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请特别且个别为了所有目的整体通过引用并入本文相同。
[0027]定义
如本说明书中使用的特定术语的定义在下文提供。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
[0028]如本说明书和附上的权利要求书中使用的，単数形式“ー个/ ー种”和“所述/该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。例如，提及“细胞”包括两种或多种细胞的组合
坐寸o
[0029]如本文使用的，“约”将是本领域普通技术人员理解的，并且将取决于它在其中使用的上下文而有一定程度改变。如果存在对于本领域普通技术人员并不明确的术语使用，考虑到它在其中使用的上下文，则“约”将意指具体术语最高加上或减去10%。
[0030]如本文使用的，“ FGF2”指人成纤维细胞生长因子-2。人FGF2是具有146个氨基酸长度的16 kDa蛋白质。參见图1与SEQ ID NO I和2。尽管生长因子含有在不同物种中高度保守的4个半胱氨酸残基，但残基不形成提供蛋白质结构稳定性的分子内二硫键。FGF2在生长因子中是不寻常的，因为该蛋白质不是糖基化的，并且它不经由常规ER/高尔基途径分泌。參见例如，Engling A等人(2002)ゾSci 115:3619-3631。
[0031]如本文使用的，“表达载体”指能够在可操作的启动子指导下指导多核苷酸表达的质粒或环形DNA。可以最佳化载体以在多种细胞系统，包括但不限于细菌细胞、哺乳动物细胞、人细胞、昆虫细胞或植物细胞中表达。同样地，可以使用本领域已知的方法最佳化载体以用于多核苷酸的无细胞表达。载体可以包含与使用的具体细胞系统相容的任何可操作的启动子、增强子、内含子或其他与重组蛋白质生产有关的序列。在一些实施方案中，载体包含人CMV立即早期增强子。在一些实施方案中，载体包含人(6-肌动蛋白启动子。在ー些实施方案中，载体包含人(6-珠蛋白内含子。在一些实施方案中，载体包含抗生素抗性标记基因。
[0032]如本文使用的，FGF2或经改造的FGF2蛋白质的“片段”指专利氨基酸序列的部分，其中所述部分包含邻接氨基酸且具有至少部分FGF2活性。与野生型FGF2蛋白质的相应片段相比较，本文描述的经改造的FGF2变体的“片段”还展示増加的热稳定性。在一些实施方案中，该片段包含至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约105、至少约110、至少约115、至少约120、至少约125、至少约130、至少约135、至少约140、至少约145个邻接氨基酸。在一些实施方案中，本公开内容提供编码SEQ ID NO:2的变体片段的分离多核苷酸，所述变体片段包含选自965し0651、0657、附1认、附116、0965和096!'的至少ー个氨基酸置换。在ー些实施方案中，本公开内容提供编码与SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段包含选自Q65L、Q651、Q65V、N111A、NI 11G、C96S和C96T的至少ー个氨基酸置換。在一些实施方案中，本公开内容提供包含SEQ ID N0:2的变体的分离多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、NI 11A、NI 11G、C96S和C96T的至少ー个氨基酸置換。在一些实施方案中，本公开内容提供与SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性的分离多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置換。如本文使用的，术语“变体”与“突变体”同义，并且指与野生型序列相比较，具有差异的核酸或氨基酸序列的多核苷酸或多肽序列。示例性差异可以包括但不限于置換、缺失、插入和倒置。核苷酸或氨基酸数目可以改变；例如，在一些实施方案中，多肽变体包括ー个、两个、三个、四个或更多个氨基酸置換。在一些实施方案中，SEQ ID N0:2的变体或SEQ ID NO:2的片段包括下述氨基酸置换中的ー个或多个:Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T。在一些实施方案中，SEQ ID N0:2的变体或SEQ ID N0:2的片段包括下述氨基酸置換:Q651、N111G和C96S。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 4的变体包括下述氨基酸置换:Q561、N92G和C87S。
`[0033]如本文使用的，“胚胎干(ES)细胞”指衍生自胚泡(早期胚胎)的内细胞群的多能干细胞。通过定义，ES细胞具有分化成三个主要胚层:外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生物的能力。在一些实施方案中，ES细胞是人ES细胞。在一些实施方案中，ES细胞是牛ES细胞。在一些实施方案中，ES细胞是小鼠ES细胞。在一些实施方案中，ES细胞是猫ES细胞。如本文使用的，“干细胞” 一般指任何自我更新的细胞类型，包括天然多能或多潜能细胞，和诱导的多能或多潜能细胞。顺应本方法的干细胞的例子包括但不限于胚胎干细胞、成体干细胞和组织特异性干细胞。相应地，本方法可以使用任何干细胞进行实践，所述干细胞需要或可以利用在培养物中的FGF2补充用于生长或改善的生长。在一些实施方案中，干细胞是胚胎干细胞。在一些实施方案中，干细胞是成体干细胞。在一些实施方案中，干细胞是组织特异性干细胞。在一些实施方案中，干细胞是天然多能或多潜能的。在一些实施方案中，细胞的多能性或多潜能性是诱导的。
[0034]如本文使用的，“有效量”指实现所需效应所需的量。例如，所需效应可以是维持ES细胞处于未分化状态。本领域技术人员应当理解构成有效量的量将随着使用的具体条件和期望的结果而改变。在一些实施方案中，有效量是约0.20 ng/μ 1-约500 ng/μ I的FGF2或FGF2变体。在一些实施方案中，有效量是0.25 ng/μ I的FGF2或FGF2变体。在一些实施方案中，有效量是1.0。在一些实施方案中，100 ng/μ I的FGF2或FGF2变体。
[0035]如本文使用的，维持干细胞处于“未分化形态”或“未分化状态”指维持细胞处于多能或多潜能状态。细胞的多能性或多潜能性可以使用本领域已知的方法进行评估，包括但不限于多能性标记例如mCherry Nanog报道基因。另外或可替代地，可以根据本领域对于使用的具体细胞类型所知，通过细胞的一般形态评估多能性。
[0036]组合物
本公开内容涉及与野生型蛋白质相比较具有增加的热稳定性的经改造的FGF2分子。公开内容提供经改造的分子的表征，经改造的突变对蛋白质热稳定性的作用的证实，和在胚胎干(ES)细胞的培养中使用该蛋白质的方法。
[0037]因为FGF2天然地以极低水平表达，所以非常难以从动物组织中分离显著数量。因此，大多数商购可得的FGF2是在大肠杆菌(疋coin中表达的重组蛋白质，其一般从每升大肠杆菌细胞培养物获得约1-10 mg的FGF2。然而，在大肠杆菌和其他细菌系统中表达的FGF2定位至内含体，需要在纯化后使该蛋白质复性。参见Gasparian ME等人(2009)Biochemistry (Mxscoff) 74:221-225。然而,大肠杆菌表达的FGF2的可溶性和活性通过用丝氨酸残基置换在位置78和96处的半胱氨酸残基得到改善，这不妥协该蛋白质的结构稳定性。参见Wang 1等人(2006)/沿0仏4/?07121:442-447。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，重组表达的FGF2作为可溶蛋白质分泌，并且处于允许它易位至细胞膜的合适构象。
[0038]本公开内容描述与野生型蛋白质相比较具有增加的热稳定性的突变型FGF2蛋白质，和在胚胎干(ES)细胞的培养中使用它的方法。描述用于重组生产真正的人蛋白质的系统的相关申请PCT/US2009/036975通过引用并入本文。
[0039]在本文描述的实验过程期间发现用于生产重组人FGF2的现有人细胞表达系统产生相当于每升细胞培养物为数mg的产率。该不良产率似乎是FGF2在无血清培养基中培养人细胞的最佳温度(37°C )呈热不稳定性的结果。本技术包含FGF2的新型热稳定突变体，其在此类温度保持生物活性，当在人细胞中表达时允许高产率和与野生型蛋白质相比较在人细胞的培养物中延长的半衰期。
[0040]人FGF2与其他哺乳动物FGF2蛋白质共享超过90%氨基酸序列同一性。为了鉴定用于改善其热稳定性的靶残基，使用Clustral算法研究人成纤维细胞生长因子成员的多重序列比对。该分析鉴定在成纤维细胞生长因子氨基酸序列中的多个保守区，其是用于定向诱变的潜在靶。
[0041]根据蛋白质序列中的相似性和同一性，FGF2与FGFl、FGF4、FGF5和FGF6形成亚组。如本文公开的，由于序列和蛋白质的亚细胞运输中的相似性，执行FGF2和人酸性成纤维细胞生长因子-1 (FGFl)的已知X射线晶体结构的比较。FGFl和FGF2 二者都具有N末端前肽，并且通过非常规途径分泌。此外，如图2中所示，两种蛋白质具有相似的晶体结构。相比之下，FGF4、FGF5和FGF6具有信号肽并且是常规地分泌的。
[0042]Z akrzewska等人报导稳定FGFl突变体的重组表达,所述FGFl突变体显示增加的半衰期、对蛋白酶解的强抗性和增强的促有丝分裂活性。Zakrzewska M等人(2005)/ Mol^iW352:860-875o 一种此类FGFl突变体Q55P/S62I/H108G是热稳定的，并且与野生型蛋白质相比对蛋白酶降解更不敏感。
[0043]为了鉴定对应于FGFl Q55、S62和H108的FGF2氨基酸，使用Clustral W执行两种蛋白质之间的氨基酸序列比对。经鉴定，FGF2中的相应残基为:脯氨酸58、谷氨酰胺65和天冬酰胺111。在FGF2蛋白质序列中，位置58天然地是脯氨酸，使得不需要在这个位点处改造突变。
[0044]本公开内容涉及在下述位置处具有氨基酸置换的经改造的FGF2:Q65、NllU C78和C96。根据FGF2晶体结构(1EV2)，这些残基位于蛋白质的表面上。生成三个经改造形式的FGF2并且测试与野生型蛋白质相比较下增加的热稳定性:1) Q65 (极性)与脂肪族疏水残基(L、1、V)和Nlll与小尺寸残基(A、G)的组合；2)组合(I)加上C96与更极性的残基(S、T)，因为对于FGF2中的半胱氨酸，FGFl具有苏氨酸；和3)组合(I)加上C78和C96与更极性的残基(S、T)。
[0045]设计和产生多核苷酸在遗传学家的范围内，所述多核苷酸编码点突变或导致表达与未经改造的蛋白质不同的氨基酸的突变。在这点上，经典或“标准”氨基酸指由六十四个三联密码子编码的二十种天然存在的氨基酸。这些密码子中除了三个外全部编码“有义”氨基酸，而三个“无义”密码子表示停止或終止信号。这20种氨基酸可以分成具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸:。
[0046]“中性”氨基酸在下文连同其各自的三字母和单字母编码、极性和三联体编码DNA密码子一起显示:
丙氨酸:(Ala，A)非极性，中性(GCT、GCC、GCA、GCG)；
天冬酰胺:(Asn，N)极性，中性(AAT、AAC)；
半胱氨酸:(Cys, C)非极性，中性`(TGT、TGC)；
谷氨酰胺:(Gln，Q)极性，中性(CAA、CAG)；
甘氨酸:(617，6)非极性，中性(661\66(:、66六、666);
异亮氨酸:(He, I)非极性，中性(ATT、ATC、ATA)；
亮氨酸:(1^11，し)非极性，中性(11^、11^、(:1'1\(:1'(:、0^、(^6)；
甲硫氨酸:(Met, M)非极性，中性(ATG)；
苯丙氨酸:(Phe，F)非极性，中性(TTT、TTC)；
脯氨酸:(Pro, P)非极性，中性(CCT、CCC、CCA、CCG)；
丝氨酸:(361'，5)极性，中性(1'(:1\丁0:、11^、1^6、六61\八60 ；
苏氨酸:(Thr，T)极性，中性(ACT、ACC、ACA、ACG)；
色氨酸:(Trp，W)非极性，中性(TGG)；
酪氨酸:(Tyr, Y)极性，中性(TAT、TAC)；
缬氨酸:(￥&1，￥)非极性，中性(611'、61'(:、6了六、6了6);和 组氨酸:(His，H)极性，正(10%)中性(90%) (CAT^CAC)0
[0047]带“正”电荷的氨基酸是:
精氨酸:(Arg，R);和 赖氨酸:(Lys，KMMi，E(AAA、AAG)。
帯“负”电荷的氨基酸是:天冬氨酸:(Asp, D)极性，负(GAT、GAC);和 谷氨酸:(Glu，EMM§，々(GAA、GAG)。
[0048]相应地，编码这些中性、带正和负电荷的氨基酸的三联体可以改造成如本文公开的FGF2编码多核苷酸，以产生新型热稳定的FGF2突变体。
[0049]因此，在上文公开的三个举例说明突变组，即(1)Q65I + N111G、(2)Q65I + NlllG+ C96S和(3)Q65I + NlllG + C78S + C96S的背景下，可以在更大的编码多核苷酸中产生合适三联体密码子，其实现所选氨基酸的所需置换。例如，在位置65处，本领域技术人员可以通过在编码序列中作出合适的核苷酸变化，容易地将谷氨酰胺(Q)密码子(CAA或CAG)改变为异亮氨酸(I)密码子(ATT、ATC或ΑΤΑ)。因此，本领域技术人员可以容易地作出上述突变和氨基酸置换。然而，本技术并不仅限于FGF2氨基酸置换的这些具体组合。可以在FGF2编码序列中实现任何其他点突变，以产生其他氨基酸置换以产生其他FGF2突变体。
[0050]在这点上，含有突变的FGF2多核苷酸编码序列的经改造的质粒可以容易地转染到人细胞内并且在细胞中表达，所述细胞适合或不适合在无血清悬浮培养物中生长。参见例如，通过引用并入本文的PCT/US2009/036975中描述的方法和材料。在一个实施方案中，表达FGF2的人细胞可以在收获用于纯化前在无血清培养基中培养7天。用于从细胞培养物中纯化蛋白质的方法是众所周知的，例如通过使用在其上装载培养物的多个级分的适当平衡的DEAE柱且随后洗脱。重组FGF2突变型蛋白质的表达水平可以例如通过SDS-PAGE考马斯染色和蛋白质印迹容易地分析。如下文实施例中详细描述的，与野生型蛋白质和其他经改造的蛋白质相比较，Q65I + NlllG + C96S (QNCm)突变的组合出乎意料地增加蛋白质的表达水平。这个结果是出乎意料的，因为通过在模拟FGFl改造中引入Q65I + NlllG(QNm)加上现有Ρ58，或通过如大肠杆菌表达的蛋白质般用丝氨酸置换两个半胱氨酸Q65I +NlllG + C78S + C96S (QNCCm)，来自人细胞表达的真正FGF2的稳定性未得到改善。
[0051]为了测试重组表达的FGF2突变体的热稳定性，一种方法可能需要将大肠杆菌表达的野生型FGF2和人细胞表达的F GF2突变体在无血清培养基中贮存于_80°C、37°C和37°C多个时间段。然后，FGF2蛋白质可以通过监察其刺激3T3细胞增殖的能力就其稳定性进行测定。关于执行3T3细胞增殖稳定性测定的示例性方法与材料参见下文实施例。
[0052]测定结果揭示Q65I + NlllG + C96S FGF2突变体保留相同生物活性，不论它贮存的温度和时间段。相比之下，当贮存于37°C 2小时时，野生型FGF2丧失其一半活性，并且在37°C 24小时后，丧失其90%的活性。Q65I + NlllG + C96S FGF2突变体在重复的基于细胞的测定中具有热稳定性中的10倍改善。
[0053]在一些实施方案中，本组合物包含具有氨基酸置换的全长FGF2，与野生型蛋白质相比较，所述氨基酸置换使得其热稳定性增加。氨基酸置换可以通过本领域已知的分子生物学技术例如通过PCR介导的诱变引入蛋白质内。重组蛋白质可以在多种细胞系统包括但不限于细菌和哺乳动物系统中表达，使用对于细胞类型适当的表达载体和培养条件。在这些细胞中表达的重组蛋白质可以根据本领域已知的方法进行纯化和表征。
[0054]在一些实施方案中，本组合物包含具有至少一个氨基酸置换的全长FGF2。在一些实施方案中，置换选自 Q65L、Q651、Q65V、NI 11A、NI 11G、C96S 和 C96T。
[0055]在一些实施方案中，组合物包含编码SEQ ID NO:2的变体的多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或片段包含选自0651^、0651、065￥、附1认、附116、0965和C96T的至少一个氨基酸置換。在一些实施方案中，组合物包含编码与SEQ ID NO: 2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或片段包含选自Q65L、Q651、Q65V、NI 11A、NI 11G、C96S和C96T的至少ー个氨基酸置換。在一些实施方案中，编码的多肽包含氨基酸置換Q651、NlllG和C96S。在一些实施方案中，编码的多肽包含SEQ ID N0:8。
[0056]在一些实施方案中，本组合物包含表达载体，其包含编码经改造的FGF2蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO: 2的多肽变体或其片段的多核苷酸，所述多肽变体或片段包含选自Q65L、Q651、Q65V、NI 11A、NI 11G、C96S和C96T的至少ー个氨基酸置換。在一些实施方案中，该载体包含编码与SEQ ID NO: 2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或片段包含选自Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少ー个氨基酸置換。在一些实施方案中，由该载体表达的多肽包含氨基酸置换Q651、N111G和C96S。在一些实施方案中，编码的多肽包含SEQ ID N0:8。
[0057]在一些实施方案中，该组合物包含SEQ ID NO: 2的多肽变体或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少ー个氨基酸置換。在一些实施方案中，该组合物包含与SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少ー个氨基酸置換。在一些实施方案中，该多肽包含氨基酸置换Q651、N111G和C96S。在一些实施方案中，该多肽包含SEQ ID N0:8。
[0058]方法
本公开内容提供在ES细胞的培养中使用经改造的FGF2蛋白质的方法，所述经改造的FGF2蛋白质与野生 型蛋白质相比较具有増加的热稳定性。Q65I + NlllG + C96S FGF2突变体的优良的热稳定性和生物活性意味着与暴露于野生型FGF2的ES细胞相比较延长了处于未分化状态的人胚胎干 细胞的多能性时期。
[0059]本文公开的结果显示，与补充有651 + NlllG + C96S置换的FGF2的不依赖于饲养细胞的培养物相比较，补充有野生型FGF2的培养物显示显著更多的分化。因此，具有Q65I+ NlllG + C96S FGF2的干细胞培养物需要比补充有野生型蛋白质的培养物更少的FGF2补充，其提供成本节省。此外，置換的FGF2的使用通过减少培养物的人为处理和操作的需要从而减少细胞培养物的非故意污染的潜力。就在培养过程期间需要更少的FGF2蛋白质与更少处理和人为干预(其意味着劳力、成本和时间中的減少)而言，举例说明性Q65I + NlllG+ C96S FGF2突变体的商业价值是显而易见的。
[0060]相应地，本发明技术包括在细胞培养中使用热稳定的FGF2突变体例如Q65I +NlllG + C96S FGF2的方法，和用于维持人胚胎干细胞处于非分化状态的方法。在一些实施方案中，该方法包括在包含有效量的权利要求6的多肽的不依赖于饲养细胞的培养基中培养胚胎干细胞，其中所述有效量包含維持该细胞具有未分化形态至少5传代所需的量。在一些实施方案中，不依赖于饲养细胞的培养基是hESF9、mTeSRl或STEMPR0?。在一些实施方案中，有效量多肽是约1.0 ng/ul -约100 ng/iU培养基。在一些实施方案中，胚胎干细胞是人ES细胞、小鼠ES细胞、牛ES细胞或猫ES细胞。
[0061]本公开内容还提供用于维持人胚胎干细胞处于未分化状态的方法，其包括使人胚胎干细胞与有效量的包含SEQ ID N0:8或SEQ ID NO:4的多肽接触，所述多肽包含氨基酸置换Q561、N92G和C87S。在一些实施方案中，有效量多肽是约1.0 ng/U 1-约100 ng/U I培养基。实施例
[0062]提供下述实施例以便更全面地举例说明本技术的实施方案。这些实施例决不应解释为限制如由附上的权利要求书限定的本发明的范围。
[0063]实施例1:人细朐表汰
生成三种经改造的人FGF2基因并且克隆到HumanZyme pHZhag载体内，所述HumanZymepHZhag载体包含人CMV立即早期增强子、人β-肌动蛋白启动子和人β-珠蛋白内含子。三个经改造的序列如下，其中氨基酸置换以粗体下划线显示:
【权利要求】
1.ー种编码选自下述的多肽的分离的多核苷酸: (i ) SEQ ID N0:2 的变体或其片段，其包含选自 Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少ー个氨基酸置换； (ii)与SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、NI 11A、NI 11G、C96S 和 C96T 的至少ー个氨基酸置换。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中该编码的多肽包含氨基酸置換Q651、NlllG和C96S。
3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中该编码的多肽包含SEQID N0:8。
4.ー种表达载体,其包含权利要求1的多核苷酸。
5.—种表达载体,其包含权利要求2的多核苷酸。
6.一种选自下述的分离的多肽: (i ) SEQ ID N0:2 的变体或其片段，其包含选自 Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少ー个氨基酸置换； (ii)与SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q651、Q65V、N111A、N111G、C96S 和 C96T 的至少ー个氨基酸置換。
7.权利要求6的分离的多肽，其中该多肽包含氨基酸置換Q651、NlllG和C96S。
8.权利要求6的分离的多肽，其中该多肽包含SEQID N0:8。
9.ー种用于培养胚胎干细胞的方法，其包括在包含有效量的权利要求6的多肽的不依赖于饲养细胞的培养基中培养该胚胎干细胞，其中该有效量包含使该细胞维持具有未分化形态至少5传代所需的量。
10.权利要求9的方法，其中该不依赖于饲养细胞的培养基是hESF9、mTeSRl或STEMPRO?。
11.权利要求9的方法，其中该有效量的多肽是约1.0 ng/u 1-约100 ng/u I培养基。
12.权利要求9的方法，其中该胚胎干细胞是人ES细胞、小鼠ES细胞、牛ES细胞或猫ES细胞。
13.一种用于維持人胚胎干细胞处于未分化状态的方法，其包括使人胚胎干细胞与有效量的包含SEQ ID NO:8的多肽或SEQ ID NO:4的变体接触，该多肽或变体包含氨基酸置换 Q561、N92G 和 C87S。
14.权利要求13的方法，其中该有效量的多肽是约1.0 ng/yl -约100 ng/u I培养基。
【文档编号】C12N5/02GK103597076SQ201280021174
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年3月1日 优先权日:2011年3月1日
【发明者】S.S.雍 申请人:人体酶公司