从植物汁制备异麦芽酮糖的方法
【专利摘要】本发明的主题是制备异麦芽酮糖的方法，所述方法包括下述方法步骤：A)使固定化的酶复合物与含有蔗糖的溶液接触，所述酶复合物能够催化蔗糖生成异麦芽酮糖的转化；B)将至少部分蔗糖异构化为异麦芽酮糖；C)分离出所述酶复合物，和任选地D)进一步纯化所述异麦芽酮糖，其特征在于，作为含有蔗糖的溶液使用选自浓汁或稀汁的至少一种，优选浓汁。
【专利说明】从植物汁制备异麦芽酮糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及使含有蔗糖的植物汁异构化生成异麦芽酮糖的方法。
【背景技术】
[0002]借助于异麦芽酮糖合酶(鹿糖葡萄糖基变位酶(Succharose Glucosylmutasen),EC 5.4.99.11)将水溶液中的蔗糖酶促异构化生成异麦芽酮糖是一种已知的方法。
[0003]例如，DE1049800描述了一种借助于细菌菌株红色精蛋白杆菌
由含有蔗糖的植物汁发酵制备异麦芽酮糖的方法。可替换地，酶促转化也可以用死生物体进行。在反应结束时，通过离心逐批分离出细胞群，并进一步后处理产物。该方法参见文献 H.Schiweck, alimenta 19, 5-16, 1980。
[0004]EP0001099描述了一种用尤其是浓汁或稀汁作为底物连续发酵细菌菌株红色精蛋白杆菌(CBS574.77)和普城沙雷菌plymuthica ) (ATCC 15928)同时将蔗糖异构化为异麦芽酮糖的方法，其中所述底物溶液本身是细胞生长的营养培养基。在反应以后，借助于离心从产物溶液分离出细胞。在与底物培养基不同的培养基中与实际异构化分离培养生物催化上有效的生物体已经被明确证实是不利的。
[0005]DE3241788描述了一种用细菌菌株的游离细胞由蔗糖水溶液制备l_0_a -D-吡喃型葡萄糖苷-D-果糖(1-0-a -D-Glucopyranosido-D-Fructose)的方法,所述细菌菌株选自红色精蛋白杆菌(CBD574.77)、普城沙雷菌(ATCC 15928)、粘质沙雷氏菌iSerratiamarescens) (NCIB 8285)、肠膜明串珠菌(Zewcofliosioc(NRRL-B-512 F)和大黄欧文氏菌(NCPPB 1578)。在所述的方法中，可以使用浓汁，并且所述浓汁同样充当细胞的生长过程的碳源。在固定化的细胞的情况中，则使用纯的蔗糖溶液。
[0006]在前述2篇说明书中公开的发酵制备异麦芽酮糖的情况中，存在在无菌条件下使用经济上和能源上有利的浓汁的可能性。但是，这里必须指出的缺点是，部分蔗糖被用于形成细胞群，并且需要昂贵的无菌硬件以及复杂的细胞混悬液与产物流的分离。
[0007]EP0983374描述了一种用固定化的细菌菌株同时制备异麦芽酮糖和甜菜碱的方法，所述细菌菌株选自红色精蛋白杆菌(CBD574.77)、普城沙雷菌(ATCC 15928)和大黄欧文氏菌(NCPPB 1578)。该制备方法始于糖蜜，即在制糖制工艺结束时生成的组合物。在该方法中，不能使用浓汁作为底物，并且需要通过例如结晶明确地贫化蔗糖。
[0008]W097/44478描述了一种用活的、固定化的细菌菌株制备异麦芽酮糖的方法，所述细菌菌株选自红色精蛋白杆菌(CBD574.77)、普城沙雷菌(ATCC 15928)和大黄欧文氏菌(ATCC 29284)。该制备方法始于糖蜜或纯蔗糖溶液。
[0009]EP0028900描述了一种用细菌菌株大黄欧文氏菌(NCPPB 1578)的固定化细胞制备异麦芽酮糖的方法。该生产方法始于纯的蔗糖溶液与最多15% v/v糖蜜的掺混物。
[0010]DE2217628、EP49472、EP3038219和EP91063描述了用固定化的细菌细胞将纯蔗糖酶促转化为异麦芽酮糖的方法。为此，EP0625578使用选自红色精蛋白杆菌(CBS574.77)、普城沙雷菌(ATCC 15928)、粘质沙雷菌(5ferraiia(NCIB 8285)、肠
膜明串珠菌(NRRL-B 512 F (ATCC 1083 a))和大黄欧文氏菌(NCPPB 1578)的细菌菌株。EP0392556 和 EP1257638 描述了选自土生结克雷伯菌(Z/e/wieWa terrigena ) JCM 1687、克雷伯菌属OWdWh sp.) N0.88 (FERM BP-2838)和新加坡克雷伯菌OVdWhsingaporensis ) LX3和LX21的细菌菌株的用途。
[0011]使用固定化的细胞的异构化方法描述于DE3133123和EP0915986中，并在固定化方法的范围中用作藻酸钙酶催化剂或离子交换剂。
[0012]所有已知的用固定化的细胞将蔗糖异构化为异麦芽酮糖的方法的一个共同点是，仅使用制糖工艺的最终产物，即纯的蔗糖或糖蜜。
[0013]因此，本发明的目的是，提供能够由容易获得的蔗糖来源制备异麦芽酮糖的方法。
【发明内容】
[0014]令人惊奇地，现在已经发现，在使用固定化的酶复合物的条件下使用含有蔗糖的植物汁来制备异麦芽酮糖，能够实现该目的。
[0015]因此，本发明提供了制备异麦芽酮糖的方法，所述方法包括下述方法步骤:
A)使固定化的酶复合物与含有蔗糖的溶液接触，所述酶复合物能够催化蔗糖生成异麦芽酮糖的转化；
B)将至少部分蔗糖异构化为异麦芽酮糖；
C)分离出所述酶复合物，和任选地
D)进一步纯化所述异麦芽酮糖，
其特征在于，作为含有蔗糖的溶液使用选自浓汁或稀汁的至少一种，优选浓汁。
[0016]在这方面，本发明有利地提供了含有蔗糖的植物汁作为异构化的底物的用途。
[0017]令人惊讶地，尽管事实上所使用的含有蔗糖的溶液是未纯化的并因而是非常复杂的底物混合物，但是通过本发明却实现了与用高纯度蔗糖相同的异构化中的收率和甚至更高的选择性。
[0018]本发明的一个优点是，通过增加固定化的细胞的停留时间以及使用粗制的植物汁作为底物，实现了显著更高的资源效率，因为节省了得到高纯度蔗糖的纯化步骤。
[0019]本发明的另一个优点是，通过直接使用浓汁，能够节省能量和生产装置(Betriebsmittel)ο
[0020]本发明的另一个优点是，通过使用浓汁，不需要用于稳定酶活性的任何种类的缓冲溶液或另外的添加剂，而是进行所使用的酶的天然稳定化。
[0021]本发明的另一个优点是，与使用纯的蔗糖水溶液相反，使用含有蔗糖的植物汁会防止床的渗漏。
[0022]本发明的另一个优点是，通过在异构化过程中使用浓汁，与使用经纯化的蔗糖溶液相比，可以降低生龋的单糖类果糖和葡萄糖的含量。
[0023]术语“异麦芽酮糖”应当理解为是指6-0- a -D-吡喃型葡萄糖苷_D_果糖。
[0024]术语“酶复合物”应当理解为是指，具有至少一种活性酶的组合物或混合物组合物，其也可以是复合物性质的，例如，活细胞。酶复合物的另外的例子是融合蛋白，其中至少一种活性酶与至少一种另外的多肽连接，但是纯化的酶本身也可以是本发明意义上的酶复合物。
[0025]在本发明的上下文中，术语“固定化的酶复合物”应当理解为是指这样的酶复合物:其结合在基质上，或者被基质包封，使得所述酶复合物在水溶液中其自由扩散或其自由运动受到限制，例如减慢。
[0026]在本发明的上下文中，术语“稀汁”应当理解为是指，在由糖用甜菜或甘蔗制糖的过程中，在汁纯化以后存在的产物。基于整个汁计，稀汁通常包含10-20重量％的蔗糖。
[0027]在本发明的上下文中，术语“浓汁”应当理解为是指经浓缩的“稀汁”，基于整个汁计，其包含超过20重量％的鹿糖。
[0028]除非另外说明，所有给出的百分比(%)是质量百分比。
[0029]在根据本发明的方法中，作为含有蔗糖的溶液有利地使用浓汁；如果需要的话，可以用水将其稀释至最多1:5的体积比，基于浓汁:水，从而得到更好的可控的异构化。
[0030]具体地，用水稀释浓汁如此来选择，使得在方法步骤A)开始时，基于整个汁计，在浓汁中存在20-80重量％、尤其是30-50重量％的蔗糖浓度。
[0031]具体地，可有利地使用糖用甜菜的稀汁或浓汁，其中糖用甜菜的浓汁是特别优选的。
[0032]含于固定化的酶复合物中的酶优选地是酶类别EC 5.4.99.11中的至少一种蔗糖葡萄糖基变位酶。在根据本发明的方法中，特别优选使用这样的蔗糖葡萄糖基变位酶，其得自:红色精蛋白杆菌、尤其是菌株红色精蛋白杆菌CBS 574.77和具有Seq ID Nr.5和6的那些；红色精朊杆菌ruber) Z12 ;普城沙雷菌、尤其是菌株普城沙雷菌ATCC 15928 ;气味沙雷氏菌oi/ori/era)、尤其是菌株气味沙雷氏菌4Rxl3(Seq ID Nr.7);粘质沙雷菌、尤其是菌株粘质沙雷菌NCIB 8285 ;肠膜明串珠菌、尤其是菌株肠膜明串珠菌ATCC 1083 a;大黄欧文氏菌、尤其是菌株大黄欧文氏菌ATCC29283 (SeqID Nr.1)、NCPPB 1578、DSM 4484 (Seq ID Nr.8)、NX-5 (Seq ID Nr.9)和 WAC2928(Seq ID Nr.10);欧文氏菌属sp.)、尤其是菌株欧文氏菌属D12 ;放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter )、尤其是菌株放射形土壤杆菌MX-232 ; 土生结克雷伯菌、尤其是菌株土生结克雷伯菌JCM 1687 ;克雷伯菌属、尤其是菌株克雷伯菌属FERMBP_2838、LX3 (Seq ID Nr.ll^PNK33_98_8(Seq ID Nr.12);肺炎克雷伯菌(Z/e/wieBa
尤其是菌株肺炎克雷伯菌342 (Seq ID Nr.4);新加坡克雷伯菌、尤其是菌株新加坡克雷伯菌LX21 ;嗜中酸假单胞菌尤其是菌株嗜中酸假单胞菌MX-45 (Seq ID Nr.2);分散泛菌尤其是菌株分散泛菌UQ68J (Seq ID Nr.3);植物生克雷伯菌(Z/e/wieBa尤其是菌株植物生
克雷伯菌 CCRC 19112、MXlO 和 UQ14S (Seq ID Nr.13);肠杆菌属(Afltero如ciersp.)、尤其是菌株肠杆菌属 FMB-1 (Seq ID Nr.16)、SZ62 和 Ejp617 (Seq ID Nr.14);维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)DJ (Seq ID Nr.15),其中红色精蛋白杆菌 CBS 574.77和红色精朊杆菌Z12是特别优选的。
[0033]所述酶可以以经纯化形式作为多肽来使用。为了易于纯化，这些可以作为融合蛋白存在，其中，例如，使能够易于纯化的标签与所述酶融合，所述标签例如His-标签、Strep-标签、GST-标签或MBP-标签。
[0034]在根据本发明的方法中，优选的是，所述酶复合物是整个细胞，所述细胞优选地选自:红色精蛋白杆菌、尤其是菌株红色精蛋白杆菌CBS 574.77 ;红色精朊杆菌Z12 ;普城沙雷菌、尤其是菌株普城沙雷菌ATCC 15928 ;气味沙雷氏菌、尤其是菌株气味沙雷氏菌4Rxl3 ;粘质沙雷菌、尤其是菌株粘质沙雷菌NCIB 8285 ;肠膜明串珠菌、尤其是菌株肠膜明串珠菌ATCC 1083 a ;大黄欧文氏菌、尤其是菌株大黄欧文氏菌ATCC29283、NCPPB 1578、DSM 4484、NX-5和WAC2928 ;欧文氏菌属、尤其是菌株欧文氏菌属D12 ;放射形土壤杆菌、尤其是菌株放射形土壤杆菌MX-232 ;土生结克雷伯菌、尤其是菌株土生结克雷伯菌JCM1687 ;克雷伯菌属、尤其是菌株克雷伯菌属FERM BP-2838、LX3和NK33-98-8 ;肺炎克雷伯菌、尤其是菌株肺炎克雷伯菌342 ;新加坡克雷伯菌、尤其是菌株新加坡克雷伯菌LX21 ;嗜中酸假单胞菌、尤其是菌株嗜中酸假单胞菌MX-45 ;分散泛菌、尤其是菌株分散泛菌UQ68J ；植物生克雷伯菌、尤其是菌株植物生克雷伯菌CCRC 19112、MXlO和UQ14S ;肠杆菌属、尤其是菌株肠杆菌属FMB-1、SZ62和Ejp617 ;维涅兰德固氮菌办，其中红色精蛋白杆菌CBS574.77和红色精朊杆菌Z12是特别优选的。
[0035]酶复合物的固定化例如可以以CLEAs {insoluble crosslinked enzymeaggregates (不可溶交联酶聚集体))的形式进行(Cao, L.等人，2000，Cross-linkedenzyme aggregates: a simple and effective method for the immobilization ofpenicillin acylase, Org.Lett., 2: 1361-1264),或者在天然或合成起源的固体载体材料上进行。天然材料例如是多糖诸如藻酸盐、琼脂糖(Agarose)、琼脂糖凝胶(Sepharose)、纤维素及其衍生物(例如DEAE-或CM-纤维素)。也可以使用改性的琼脂糖凝胶，例如被环氧基-活化的、溴氰根-活化的、NHS-活化的、硫醇-活化的琼脂糖凝胶。这些琼脂糖例如是在公司 GE Healthcare、BioRacU Sigma 和 Pierce 商购可得的。
[0036]作为合成有机聚合物可以使用聚苯乙烯-衍生物、聚丙烯酸酯、尤其是环氧化物活化的丙烯酸树脂珠(Eupergit)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、乙烯基-和烯丙基聚合物、聚酯或聚酰胺。
[0037]作为无机载体可以是基于硅氧化物或铝氧化物或其混合物的材料。
[0038]酶复合物的固定化还可以通过包封在聚合的多孔凝胶中进行，例如RSi(OCH3)3或者RSi (OCH3) 3与Si (OCH3) 4的混合物的疏水性溶胶-凝胶材料(Reetz，Μ.Τ.; Zonta,A.; Simpelkampj J.; Rufinskaj A.; Teschej B.J.Sol-Gel Sc1.Technol.1996，7，第 35-43 页)或多孔的聚合娃胶-凝胶(Elgren，Τ.Μ.; Zadvornyj 0.Α.; Brecht, Ε.;Douglas, Τ.; Zorin, N.A.; Maroneyj M.J.& Peters, J.1)。
[0039]此外，除了固定化以外，在酶膜反应器中的酶的多次使用是可能的。
[0040]在根据本发明的方法中使用的酶复合物，尤其是细胞，优选地被固定在多糖诸如藻酸盐、果胶、角叉菜胶、壳聚糖或聚乙烯醇例如Lentikats或其混合物中，尤其是藻酸盐中；在这点上，参见例如 Shimizu，H.，攀yl〈1997) Screening of novel microbialenzymes for the production of biologically and chemically useful compounds,见:Advances in biochemical engineering bio technology,第 58 卷:New Enzymes forOrganic Synthesis (Scheper，T.,编)第 45-88 页，Springer, New York。
[0041]一种对于在根据本发明的方法中使用的酶复合物的任意形式而言特别优选的固定化是，在EP2011865中描述的方法，其中给固定在惰性载体上的酶复合物提供通过氢化硅烷化得到的有机硅涂层。[0042]根据本发明优选的是，在方法步骤B)中，具有4-9.5的pH-值。该pH-值有利地借助于酸、尤其是无机酸来调节，所述酸优选选自硫酸、盐酸或乙酸。
[0043]此外，根据本发明优选的是，在方法步骤B)中，具有20_40°C、优选25_35°C的温度，该温度在含有蔗糖的溶液中测得。
[0044]在方法步骤C)中，将酶复合物与异麦芽酮糖分离；这例如通过过滤、沉降或离心来进行。因为酶复合物的被固定物特性，该分离相对于未固定的酶变得容易。
[0045]由于工艺经济的原因，根据本发明，如果以固体床的形式使用经固定化的酶复合物，是优选的，含有鹿糖的溶液从所述固体床中流过(H.Schiweck, Zuckerind.(1990)，115 (7)，555-565)。相应的以固体床的方法描述于A.Liese,等人.Processes在A.Liese, K.Seelbach, C.Wandrey (编)，Industrial Biotransformations第2版(2006), ffiley-VCH, Weinheim中。在这样的方法中，方法步骤A)至C)连续进行，并且从而彼此逐渐变成直至同时进行。
[0046]可以在任选的方法步骤D)中进一步纯化异麦芽酮糖。这尤其可通过结晶或色谱法进行。相应的方法描述于DE3241788和EP0983374中。
[0047]下面列出的实施例示例性描述了本发明，而非意在将其范围由整个说明书和权利要求书给出的本发明限制在实施例中所提及的实施方案中。
[0048]实施例: 实施例1:生物催化剂的制备
用1-5 ml无菌营养培养基将细胞从菌株红色精蛋白杆菌(CBS574.77)的传代培养物上洗下，所述营养培养基由50 g/kg的鹿糖、15 g/kg的玉米泡胀水、7 g/kg的硫酸铵、0.5g/kg的酵母浸出物、I g/kg的硫酸二氢钾、0.41 g/kg的氯化镁七水合物、0.004 g/kg的氯化锰四水合物、0.047 g/kg的柠檬酸铁一水合物和926 g/kg的水组成，需要时将其调节至pH 7.2。该混悬液充当预培养物的接种物，在I I摇瓶中所述预培养物包含200 ml上述营养物溶液。
[0049]在30°C培养20小时以后，以使初始光密度(OD6J为I的方式，用所述预培养物给2- L发酵罐接种，所述发酵罐装有I升无菌生产培养基，所述生产培养基由50 g/kg的蔗糖、15 g/kg的玉米泡胀水、3 g/kg的硫酸铵、4 g/kg的磷酸氢铵、0.5 g/kg的酵母浸出物、I g/kg的硫酸二氢钾、0.41 g/kg的氯化镁七水合物、0.004 g/kg的氯化猛四水合物、0.047g/kg的柠檬酸铁一水合物和926 g/kg的水组成,其被调节至pH 7.2。
[0050]在30°C、pH 7 (经调节)和30%的p02 (级联搅拌器，Airflow)下进行发酵。在发酵过程中，补料蔗糖。15-20 h以后，发酵过程结束，可以收获生物质用于固定化。
[0051]为此，将得到的混悬液与水和4%浓度的藻酸盐溶液以体积比1:1进行混合。然后将该混悬液通过滴入到2%浓度的CaCl2-溶液中来固定化。用聚乙烯亚胺和戊二醛后固化所得到的珠子。得到的生物催化剂可以在4-10°C保存数周。
[0052]实施例2:通过使纯蔗糖溶液异构化来制备异麦芽酮糖(非根据本发明的)
如(65--/-1n UlIman，s Encyclopedia of Industrial Chemisty (2007)hK
得自糖用甜菜的浓汁制备纯蔗糖；蔗糖收率为88.3%。
[0053]将在实施例1中得到的经固定化的细胞填充到可加热的柱反应器中，并将温度调节至20-35°C。由所述纯蔗糖和自来水制备具有35-45%的干物质(TS)-含量的蔗糖溶液。使该溶液连续通流穿过所述柱反应器。
[0054]流出柱反应器的异麦芽酮糖溶液的HPLC-分析表明了在该方法步骤中的收率、选择性和转化率的平均值:
收率:85%
选择性:91%
转化率:94%
基于使用的蔗糖计，该方法的收率为孤
[0055]实施例3:通过使浓汁异构化来制备异麦芽酮糖(根据本发明的)
将在实施例1中得到的经固定化的细胞填充到可加热的柱反应器中，并将温度调节至20-35°C，并使上述经稀释的得自糖用甜菜的具有35-45%的干物质(TS)-含量的浓汁连续通流穿过。
[0056]流出柱反应器的异麦芽酮糖溶液的HPLC-分析表明了收率、选择性和转化率的平均值:
收率:82%
选择性:91%
转化率:90%
基于使用的蔗糖计，该方法的收率为_，因而比根据现有技术的方法的收率高了 7%。
[0057]实施例4:浓汁的异构化与经纯化的蔗糖溶液的异构化的选择性对比 在调温至30°C的柱反应器中装入根据实施例1得到的固定化的细胞。
[0058]使经纯化的蔗糖溶液连续通流穿过柱反应器1，所述经纯化的蔗糖溶液的浓度用自来水调节至40%干物质-含量，并用浓硫酸调节至pH-值为6。
[0059]使得自糖用甜菜的浓汁连续通流穿过柱反应器2，所述浓汁被稀释至40%的蔗糖干物质-含量，并用浓硫酸调节至PH-值为6。
[0060]为了能够更好地测定选择性，通过调节体积流，将2个柱反应器中的异麦芽酮糖收率调节为79%的相同值，基于各自的蔗糖干物质-含量计。通过得到的异麦芽酮糖溶液的HPLC-分析，进行分析确定。
[0061]实现的选择性如下:
选择性(浓汁):85%
选择性(蔗糖溶液):83%
另外，与使用经纯化的蔗糖溶液相比，通过使用浓汁使终产物中不希望的，致龋的单糖类果糖和葡萄糖的形成减少了大约10% (基于干物质计)。
【权利要求】
1.制备异麦芽酮糖的方法，所述方法包括下述方法步骤: A)使固定化的酶复合物与含有蔗糖的溶液接触，所述酶复合物能够催化蔗糖转化成异麦芽酮糖； B)将至少部分蔗糖异构化为异麦芽酮糖； C)分离出所述酶复合物，和任选地 D)进一步纯化所述异麦芽酮糖， 其特征在于， 作为含有蔗糖的溶液使用选自浓汁或稀汁的至少一种，优选浓汁。
2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 作为含有蔗糖的溶液使用用水稀释过的浓汁，基于整个汁计，其具有20-80重量％、尤其是30-50重量％的蔗糖浓度。
3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 含于固定化的酶复合物中的酶是酶类别EC 5.4.99.11中的至少一种蔗糖葡萄糖基变位酶，特别得自下述菌的一种:红色精蛋白杆菌、尤其是菌株红色精蛋白杆菌CBS 574.77和具有Seq ID Nr.5和6的那些；红色精朊杆菌Z12 ;普城沙雷菌、尤其是菌株普城沙雷菌ATCC 15928 ;气味沙雷氏菌、尤其是菌株气味沙雷氏菌4Rxl3(Seq ID Nr.7);粘质沙雷菌、尤其是菌株粘质沙雷菌NCIB 8285 ;肠膜明串珠菌、尤其是菌株肠膜明串珠菌ATCC 1083a ;大黄欧文氏菌、尤其是菌株大黄欧文氏菌ATCC29283 (Seq ID Nr.1), NCPPB 1578、DSM4484 (Seq ID Nr.8)、NX_5 (Seq ID Nr.9)和 WAC2928 (Seq ID Nr.10);欧文氏菌属、尤其是菌株欧文氏菌属D12 ;放射形土壤杆菌、尤其是菌株放射形土壤杆菌MX-232 ;土生结克雷伯菌、尤其是菌株土生结克雷伯菌JCM 1687 ;克雷伯菌属、尤其是菌株克雷伯菌属FERM BP-2838、LX3 (Seq ID Nr.11)和 NK33-98-8 (Seq ID Nr.12);肺炎克雷伯菌、尤其是菌株肺炎克雷伯菌342 (Seq ID Nr.4);新加坡克雷伯菌、尤其是菌株新加坡克雷伯菌LX21 ;嗜中酸假单胞菌、尤其是菌株嗜中酸假单胞菌MX-45 (Seq ID Nr.2);分散泛菌、尤其是菌株分散泛菌UQ68J (Seq ID Nr.3);植物生克雷伯菌、尤其是菌株植物生克雷伯菌CCRC 19112、MX10和UQ14S (Seq ID Nr.13);肠杆菌属、尤其是菌株肠杆菌属FMB-1 (SeqID Nr.16)、SZ62 和 Ejp617 (Seq ID Nr.14);维涅兰德固氮菌 DJ (Seq ID Nr.15)。
4.根据前述权利要求中的至少一项所述的方法， 其特征在于， 所述酶复合物是细胞，尤其是选自得自下述菌的细胞:红色精蛋白杆菌、尤其是菌株红色精蛋白杆菌CBS 574.77 ;红色精朊杆菌Z12 ;普城沙雷菌、尤其是菌株普城沙雷菌ATCC15928 ;气味沙雷氏菌、尤其是菌株气味沙雷氏菌4Rxl3 ;粘质沙雷菌、尤其是菌株粘质沙雷菌NCIB 8285 ;肠膜明串珠菌、尤其是菌株肠膜明串珠菌ATCC 1083 a ;大黄欧文氏菌、尤其是菌株大黄欧文氏菌ATCC29283、NCPPB 1578、DSM 4484、NX-5和WAC2928 ;欧文氏菌属、尤其是菌株欧文氏菌属D12 ;放射形土壤杆菌、尤其是菌株放射形土壤杆菌MX-232 ;土生结克雷伯菌、尤其是菌株土生结克雷伯菌JCM 1687 ;克雷伯菌属、尤其是菌株克雷伯菌属FERM BP-2838、LX3和NK33-98-8 ;肺炎克雷伯菌、尤其是菌株肺炎克雷伯菌342 ;新加坡克雷伯菌、尤其是菌株新加坡克雷伯菌LX21 ;嗜中酸假单胞菌、尤其是菌株嗜中酸假单胞菌MX-45 ;分散泛菌、尤其是菌株分散泛菌UQ68J ;植物生克雷伯菌、尤其是菌株植物生克雷伯菌CCRC 19112、MXlO和UQ14S ;肠杆菌属FMB-1、SZ62和Ejp617 ;维涅兰德固氮菌O/。
5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述细胞被固定在多糖诸如藻酸盐、果胶、角叉菜胶、壳聚糖或聚乙烯醇，例如Lentikats,或它们的混合物中，尤其是藻酸盐中。
6.根据前述权利要求中的至少一项所述的方法， 其特征在于， 在方法步骤B)中，存在4-9.5的pH-值。
7.根据前述权利要求中的至少一项所述的方法， 其特征在于， 在方法步骤B)中，存在20-40°C的温度。
8.根据前述权利要求中的至少一项所述的方法， 其特征在于， 以固体床的形式使用经固 定化的酶复合物，所述含有蔗糖的溶液通过所述固体床流过。
【文档编号】A23L1/236GK103501636SQ201280021859
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年2月8日 优先权日:2011年5月5日
【发明者】J.哈伯兰, O.泽纳克, K.格拉曼, M.霍尔特坎普, J.沃尔特, T.希勒, A.莫尔, G.格林贝格, T.哈斯 申请人:赢创德固赛有限公司