用于等温全基因组扩增的方法和组合物的制作方法

用于等温全基因组扩增的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于遗传物质的扩增，包括单细胞等温WGA的组合物和方法。
【专利说明】用于等温全基因组扩增的方法和组合物
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2 011年5月6日提交的美国临时专利申请系列第61/483，636号的优先权，其在此通过引用而 全部结合至本文。
【技术领域】
[0003]本发明属于用于扩增 的方法和组合物领域，包括用于单细胞等温全基因组扩增的方法和组合物。
【背景技术】
[0004]标准等温WGA方案指导技术人员使用至少IOng (或1，500个细胞等同物)的起始基因组物质进行成功的等温WGA反应。多个研究组已经尝试进行单细胞等温WGA但均失败。例如，用于单细胞基因组物质的等温WGA的标准程序导致不期望的结果，如高的等位基因脱扣(ADO)率和基因座脱扣(LDO)率，一些报道中使用≥IOng起始基因组物质其AD0>30%(Morrison 等人,AmJ Trop Med Hyg.76 (2007) 1132-1137)。标准程序也显示了在阵列比较基因组杂交(阵列CGH)输出中扩增的偏向性和“噪音”。而且，在WGA之前进行的标准细胞裂解条件常常导致遗传物质的损伤(例如，产生切口、断裂和/或碎裂)，这不利于后续方法，如WGA和阵列CGH的进行(Kumar等人，Biotechniques44 (2008) 879-890)。由于存在这些问题，用于来自单细胞的WGA的优选方法为非等温的，或基于PCR的方法。
[0005]此外，从全血中分离基因组DNA需要大量纯化。标准方案，如由GEN0MIPHI?DNA扩增试剂盒(GE Healthcare, Waukesha, WI)提供的方案表明血液成分，如血红素可抑制Phi29DNA聚合酶。在已经使用这些方案的研究表明，Phi29被高浓度的血红素强烈抑制，使得来自血液的样品在WGA后产生阴性结果(Ballantyne等人，Forensic ScienceInternationall66 (2007) 35-41)。因为存在这个问题，标准的WGA方案涉及纯化步骤以除去红细胞，从而防止降低的产量和背景扩增。
[0006]因此，需要用于制备用于等温WGA和阵列CGH的样品的改善的方法和组合物(特别是用于制备低水平基因组物质，如来自单细胞的基因组物质的方法和组合物)、用于产生具有低偏向性的一致的扩增产物的方法和组合物，以及能放大以用于高通量性能和分析的方法和组合物。

【发明内容】

[0007]本发明的实施方案涉及用于从细胞扩增遗传物质的方法和组合物。在优选的实施方案中，进行低水平基因组物质(如单细胞)的全基因组扩增。
[0008]本发明的一个实施方案为从细胞制备用于扩增的DNA的方法，包括:制备下述裂解混合物:包含含有DNA的细胞的样品、寡核苷酸和裂解缓冲溶液；以及将所述混合物孵育高至30分钟，从而裂解所述混合物中的细胞。
[0009]本发明的另一个实施方案为一种从细胞制备用于高通量全基因组扩增的DNA的方法，包括:获得包含含有DNA的细胞的样品；将所述样品等分为至少300份子样品，其中所述子样品各包含平均少于约一个包含DNA的细胞；向各子样品中加入:寡核苷酸和裂解缓冲溶液；将包含寡核苷酸和裂解缓冲溶液的子样品孵育高至30分钟，从而裂解所述细胞；向裂解的子样品中加入中和溶液和足以扩增DNA的量的寡核苷酸引物；将中和的子样品加热小于2分钟从而使中和的子样品中的DNA变性；以及冷却中和的子样品。
[0010]本发明的另一个实施方案为扩增遗传物质的方法，包括:制备包含下述物质的混合物:来自高至100个细胞的遗传物质、寡核苷酸引物、聚合酶、dNTP、盐混合物；以及将所述混合物孵育以进行扩增反应，其中，所述孵育不包括热变性步骤。
[0011]本发明的另一个实施方案为一种进行阵列比较基因组杂交(阵列CGH)的方法，包括:根据本文中描述的方法获得来自单细胞的遗传扩增的产物；并且对所述产物进行阵列CGH。
[0012]本发明的另一个实施方案为鉴定遗传变异的方法，包括:根据本文中描述的方法获得来自单细胞的遗传扩增的产物；对所述产物进行测序反应；并且对测序的产物进行分析以鉴定遗传变异。在一些实施方案中，多于一个细胞用于本发明的方法。
[0013]本发明的另一个实施方案为一种溶液，其包含:含有单个有核细胞的生物溶液、加入的碱和加入的还原剂。
[0014]本发明的另一个实施方案为一种用于等温全基因组扩增的组合物，其包含:碱、还原剂和螯合剂。
[0015]本发明的另一个实施方案为一种用于等温全基因组扩增的组合物，其包含:碱和螯合剂。
[0016]本发明的另一个实施方`案为一种用于等温全基因组扩增的组合物，其包含:包含含有单个有核细胞的生物溶液的溶液、加入的碱和加入的还原剂，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，dNTP,以及包含碱、还原剂以及螯合剂的组合物。
[0017]本发明的另一个实施方案为一种用于等温全基因组扩增的组合物，其包含:包含含有单个有核细胞的生物溶液的溶液、加入的碱和加入的还原剂，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，dNTP,以及包含碱和螯合剂的组合物。
[0018]本发明的另一个实施方案为一种在全基因组扩增中降低模板非依赖性聚合的组合物，其包含:寡核苷酸引物(其中至少一部分寡核苷酸引物包含C3间隔区)、聚合酶、dNTP和盐混合物。
[0019]本发明的一些实施方案包括一种方法，所述方法进一步包括:在孵育后向所述混合物中加入中和溶液；将中和的混合物加热小于2分钟，使中和的混合物中的DNA变性；以及冷却中和的混合物。
[0020]本发明的一些实施方案包括下述内容:一种方法，其中，所述混合物中寡核苷酸的浓度为10 μ M-100 μ M ;—种方法，其中，所述裂解缓冲溶液包含碱和还原剂；一种方法，其中，所述裂解缓冲溶液不包含螯合剂；一种方法，其中，裂解混合物于20°c -35°c孵育；一种方法，其中，裂解混合物的孵育高至3分钟；一种方法，其中，中和溶液包含磷酸盐和螯合剂；一种方法，其中，所述螯合剂为二价离子螯合剂；一种方法，其中，将中和的混合物加热包含将所述混合物于80°C _95°C加热小于2分钟；一种方法，其中，所述中和的混合物的总体积为小于4μ L 种方法，其中，所述中和的混合物的总体积为小于或大约I μ L ;一种方法，其不包括涡旋；一种方法，其中，所述寡核苷酸为寡核苷酸引物；一种方法，其中，所述寡核苷酸引物为随机寡核苷酸引物；一种方法，其进一步包括在孵育所述裂解混合物后将寡核苷酸引物加入到所述混合物中；一种方法，其中，所述寡核苷酸和所述寡核苷酸引物不同；一种方法，其中，所述寡核苷酸和所述寡核苷酸引物相同；一种方法，其中，加入到所述裂解的混合物中的额外的寡核苷酸引物的浓度为100 μ Μ-400 μ M ;一种方法，其中，所述寡核苷酸引物为随机寡核苷酸引物；一种方法，其中，所述寡核苷酸引物的量为至少ΙΟΟμΜ;一种方法，进一步包括对中和的子样品进行全基因组扩增；一种方法，其中，裂解的子样品的反应体积小于进行全基因组扩增的反应体积的30% 种方法，其中，所述遗传物质来自单细胞；一种方法，所述遗传物质为至少每个细胞一条染色体；一种方法，其中，所述遗传物质获得自来自包含细胞母体细胞和胎儿细胞混合物的生物样品的细胞；一种方法，其中，所述聚合酶为热稳定聚合酶；一种方法，其中，所述聚合酶具有链置换活性；一种方法，其中，所述盐混合物包含=Tris-HCl ;NaCl或KCl ;MgCl2或MnCl2 ;和(NH4)2SO4 ;一种方法，其中，所述混合物进一步包含浓度为至少500个细胞/μ I的红细胞；一种方法，其中，所述混合物进一步包括裂解缓冲溶液和中和溶液；一种方法，其中，所述裂解缓冲溶液包含碱和还原剂；一种方法，其中，所述裂解缓冲溶液基本上由碱和还原剂组成；一种方法，其中，所述中和溶液包含磷酸盐和螯合剂；一种方法，其中，所述遗传物质根据本文中描述的方法制备；一种方法，其中，所述寡核苷酸引物为随机寡核苷酸；一种方法，其中，至少一部分寡核苷酸或寡核苷酸引物为SpC3-N9引物，其中N为任意核苷酸，并且其中SpC3为三碳分子；一种方法，其中，至少一部分寡核苷酸或寡核苷酸引物为N-SpC3-N9引物,其中N为任意核苷酸，并且其中SpC3为三碳分子；一种方法，其中，至少一部分寡核苷酸引物包含修饰的碱基配对组合；一种方法，其中，所述修饰的碱基配对组合为2，6-二氨基嘌呤和5- (1-丙炔基)_2’ -脱氧尿苷(DAP/pdU)种方法，其中，所述混合物进一步包括选自BSA、IPP和TIPP中的至少一种；一种方法，其中，所述混合物进一步包含BSA 种方法，其中，所述混合物的总体积为小于4μ L 种方法，其中，所述混合物的总体积为小于I μ L ;一种方法，其中，所述混合物于4°C -50°C孵育；一种方法，其中，所述扩增反应为将所述混合物在等温条件下孵育至少30分钟；一种方法，进一步包括在扩增孵育后将所述混合物加热以灭活聚合酶；一种方法，进一步包括进行基因座脱扣(LDO)率分析；一种方法，进一步包括进行等位基因脱扣(ADO)率分析；一种方法，其中，除了细胞的裂解，对遗传物质不进行DNA提取；一种方法，其中，已经进行了裂解，并且其中遗传扩增在进行裂解的位置进行；一种方法，其中，所述位置为板上的微孔；一种方法，进一步包括将遗传扩增的产物分为至少两份等分试样；一种方法，进一步包括对至少一份等分试样进行测试以鉴定胎儿细胞；一种方法，进一步包括对至少一份等分试样进行测试以鉴定遗传变异；一种方法，进一步包括对至少一份等分试样进行第二轮遗传扩增；一种方法，进一步包括将`第二轮遗传扩增的产物分为至少两份子样品；一种方法，进一步包括对来自所述第二轮遗传扩增的至少一份子样品进行测试以鉴定胎儿细胞；一种方法，进一步包括对来自所述第二轮遗传扩增的至少一份子样品进行测试以鉴定遗传变异；一种方法，进一步包括:将鉴定为包含胎儿等位基因的子样品合并，并且对所述合并的子样品进行测试以鉴定遗传变异；一种方法，进一步包括将来自被鉴定为包含胎儿等位基因的至少两个细胞的剩余等分试样合并，并且对合并的等分试样进行第二轮遗传扩增；一种方法，进一步包括:将遗传扩增的产物或其一部分与另一种遗传扩增的产物或其一部分合并，并且对合并的产物进行第二轮遗传扩增；一种方法，其中，少于50%的来自一种或两种遗传扩增的产物用于进行第二轮遗传扩增；一种方法，其中，来自单细胞的遗传物质获得自在第一轮遗传扩增中产生的样品；一种方法，进一步包括:根据本文中描述的方法获得来自单细胞的遗传扩增的产物，并且对所述产物进行阵列CGH ; —种方法，进一步包括:根据本文描述的方法获得来自单细胞的遗传扩增的产物，并且对所述产物进行测序反应；一种方法，进一步包括在进行阵列CGH前将至少5个单细胞的遗传扩增产物合并；一种方法，其中，进行阵列CGH以鉴定遗传变异；以及一种方法，其中，所述遗传变异为拷贝数变异(CNV)。
[0021]本发明的一些实施方案包括一种方法，其中，所述盐混合物包含:Tris-HCl ；NaCl或 KCl ;MgCl2 或 MnCl2 ;和(NH4)2SO40
[0022]本发明的一些实施方案包括一种方法，其进一步包括:将鉴定为包含胎儿等位基因的子样品合并，并且对所述合并的子样品进行测试以鉴定遗传变异。
[0023]本发明的一些实施方案包括一种方法，其进一步包括:将来自鉴定为包含胎儿等位基因的至少两个细胞的剩余的等分试样合并，并且对所述合并的等分试样进行第二轮遗传扩增。
[0024]本发明的一些实施方案包括一种方法，其进一步包括:将遗传扩增产物或其部分与另一遗传扩增产物或其部分合并，并且对所述合并的产物进行第二轮遗传扩增。
[0025]本发明的一些实施方案包括:一种进一步包含随机寡核苷酸的生物流体。
[0026]本发明的一些实施方案包括一种组合物，其进一步包括:寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP、碱、还原剂和螯合剂。
[0027]本发明的一些实施方案包括一种组合物，其进一步包括:寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP、碱和螯合剂。
[0028]本发明的一些实施方案包括下述内容:一种溶液，其包含不超过一个有核细胞；一种组合物，其包含不超过一个有核细胞；一种溶液，其包含仅一个有核细胞；一种组合物，其包含仅一个有核细胞；一种溶液，其由不超过一个有核细胞组成；一种组合物，其由不超过一个有核细胞组成；一种溶液，其由仅一个有核细胞组成；一种组合物，其由仅一个有核细胞组成；一种组合物，其中至少一部分寡核苷酸引物为SpC3-N9引物，其中N为任意核苷酸，并且其中SpC3为三碳分子；一种组合物，其中至少一部分寡核苷酸引物为N-SpC3-N9引物，其中N为任意核苷酸，并且其中SpC3为三碳分子；一种组合物，其中，至少一部分寡核苷酸引物包含修饰的碱基配对组合；以及一种组合物，其中，所述修饰的碱基配对组合为2，6- 二氨基嘌呤和5- (1-丙炔基)-2’ -脱氧尿苷(DAP/pdU)。
[0029]本发明的一些实施方案包含一种组合物，其中，所述盐混合物包含Tris-HCl ；NaCl 或 KCl ;MgCl2 或 MnCl2 ;和(NH4)2SO40
【专利附图】

【附图说明】
[0030]图1A和IB示出了来自本发明的实施方案的方法和组合物的数据，所述数据显示在全基因组扩增中降低的模板非依赖性聚合。
[0031]图2A和2B示出了来自本发明的实施方案的方法和组合物的数据，所述数据显示通过阵列比较基因组杂交而改善的全基因组扩增的基因组物质。[0032]图3A-3D示出了来自本发明的实施方案的合并的方法的数据，所述数据显示来自全基因组扩增的随机事件的作用归一化。
[0033]图4A和4B示出了来自本发明的实施方案的方法和组合物的数据，所述数据显示降低的基因组损伤和改善的全基因组扩增。
[0034]图5示出了来自本发明的实施方案的方法和组合物的数据，所述数据显示在存在红细胞时，全基因组扩增的来自靶细胞的基因组物质的改善的质量。
[0035]图6出了来自本发明的实施方案的方法和组合物的数据，所述数据显示在存在红细胞时，全基因组扩增的来自靶细胞的基因组物质的改善的质量。
【具体实施方式】
[0036]本发明的实施方案涉及用于全基因组扩增的方法和组合物，包括用于单细胞的等温全基因组扩增的方法和组合物。本文中描述的方法和组合物产生意想不到的高质量的扩增产物，这通过降低的基因座脱扣和等位基因脱扣(LD0和AD0)率、使用扩增产物的改善的测序和阵列CGH数据或扩增产物中靶标识别得到证实。而且，本文中描述的方法和组合物可在短时间内从少至单个靶细胞产生高质量和大量的扩增产物。使用本文描述的方法和组合物产生的产物用于任何基于DNA的诊断应用，包括但不限于PCR基因分型、拷贝数变异(CNV)的阵列CGH分析以及DNA序列分析。通过使用本文描述的方法和组合物，特别是在逐个细胞的基础上，本发明的实施方案克服了现有扩增方案存在的问题，包括WGA存在的问题。
[0037]本文描述的一些方法和组合物可用于改善扩增反应的性能和/或效率。例如，可以对样品进行细胞裂解和扩增而不需要插入DNA提取步骤，可以将寡核苷酸添加到细胞裂解溶液中以防止DNA附着到其物理环境，从而降低DNA的损失，以及WGA反应可包括如牛血清白蛋白(BSA)或无机焦磷酸酶 (IPP)的试剂。而且，所述方法可包括优化的细胞裂解缓冲液、最小化的机械操作、短暂的热变性和高的寡核苷酸引物浓度，从而在扩增反应前或扩增反应期间保持基因组DNA的完整性。
[0038]本文描述的一些方法和组合物可用于产生具有低扩增偏向性的一致性的产物。例如，扩增后，在分析单细胞扩增产物前将样品合并。对于本文描述产生的产物可以例如通过评价WGA、测序或阵列CGH数据而测定产物的一致性和产物的质量。
[0039]本文描述的一些方法和组合物能在低量反应中进行WGA，使WGA特别节省成本和高通量。在一些实施方案中，将相同的寡核苷酸用于细胞裂解和WGA反应。在一些实施方案中，将完全自动化的系统用于实施本文描述的方法。
[0040]在一些实施方案中，本文描述的方法和组合物用于分离、扩增、检测和/或测试来自母体细胞和胎儿细胞混合物的胎儿细胞。富集、检测和测试胎儿等位基因的方法在美国专利申请第12/645，129号中描述，其通过引用全部结合至本文。在一些实施方案中，本文描述的方法和组合物用于扩增、检测和/或测试来自胚胎的胎儿细胞。例如，在一些实施方案中，将本文描述的方法和组合物与植入前基因诊断(PGD)结合使用。
[0041]在具体实施方案中，将母本样品分为子样品使得各子样品包含平均仅一个细胞。在更优选的实施方案中，将母本样品分为子样品使得各子样品包含平均少于一个细胞。所述子样品单独与寡核苷酸和碱性裂解缓冲液组合从而以最小机械操作从细胞中释放基因组。不需要另外的DNA提取步骤，然后将裂解的子样品各自与中和缓冲液和高浓度的修饰的寡核苷酸引物合并，短暂地进行热处理并冷却，与酶溶液合并，然后在等温条件下孵育以产生扩增产物。任选地将扩增的产物分为等分试样，可以筛选至少存在一个非母本等位基因的等分试样。然后将扩增的产物或扩增产物的未筛选的等分试样任选地合并，从而使在单一反应中发生的随机事件所产生的偏向性最小化，并进行阵列比较基因组杂交(阵列CGH)或测序，以检测胎儿遗传变异的存在。任选地，对扩增、阵列CGH和/或测序反应产物进行质量控制以确定使用所述实施方案的方法产生的产物的数量和/或质量。
[0042]在一些实施方案中，扩增后，在进行第二轮扩增前，任选地，将扩增产物或扩增产物的未筛选的等分试样合并。在其它实施方案中，任选地，将来自第二轮扩增的产物进行合并以将在单一反应中发生的随机事件所产生的偏向性最小化，并进行阵列CGH或测序，以检测胎儿遗传变异的存在。任选地，对扩增、阵列CGH产物和/或测序反应进行质量控制以确定使用所述实施方案的方法产生的产物的数量和/或质量。
[0043]在一些实施方案中，本文描述的方法以高通量的方式进行。在具体的实施方案中，进行至少或至少约 96、100、192、200、288、384、400、500、600、700、800、900、1，000,2, 000、3，000,4, 000,5, 000,6, 000,7, 000,8, 000,9, 000 或 10，000 个扩增反应，或者前述任意两个
值限定的范围的扩增反应。在具体实施方案中，进行至少或至少约300个扩增反应。在更具体的实施方案中，进行至少或至少约10，000个扩增反应。在一些实施方案中，用自动系统，如计算机控制的纳升流体分配器进行本文描述的方法。在具体的实施方案中，使用BioDot(Irvine, CA)提供的分配器。
[0044]在具体实施方案中，进行至少或至少约96、100、192、200、288、384、400、500、600、700、800、900、1，000、2，000、3，000、4，000、5，000、6，000、7，000、8，000、9，000 或 10,000 个
测序反应，或者上述任意两个值所限定的范围的测序反应。在具体实施方案中，进行至少或至少约300个测序反应。在更具体的实施方案中，进行至少或至少约10，000个测序反应。
[0045]如本文所使用的，“寡核苷酸”表示核苷酸的聚合物。如本文所使用的，“核苷酸”或“核酸”表示脱氧核糖核酸(例如，DNA、mtDNA、gDNA或cDNA)、核糖核酸(例如，RNA或mRNA)，或者本领域中已知的核酸任意其它变体，包括，例如，核酸类似物，如肽核酸(PM)、锁核酸(LNA)、甘醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。在一些实施方案中，本文描述的寡核苷酸为单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)或微小RNA (HiiRNA)0
[0046]如本文所使用的，“遗传扩增”指的是增加遗传物质的量。如本文所使用的，“全基因组扩增”指的是一个细胞的基本上全部基因组的遗传扩增。应该理解这些术语包含在扩增前其自然状态被修饰的遗传物质或基因组的扩增。如本文中所使用的，所指的全基因组扩增混合物、缓冲液或其它溶液应当被理解为也适用于用于遗传扩增的混合物、缓冲液或溶液，反之亦然。
[0047]如本文所使用的，“遗传变异”表示核酸序列中的任何变异。遗传变异可从单碱基对变异至染色体变异，或者本领域已知的任何其它变异。遗传变异可以为简单序列重复、短串联重复、单核苷酸多态性、易位、倒位、缺失、重复或任何其它的拷贝数变异。在一些实施方案中，染色体变异为染色体异常。例如，所述染色体变异可以为非整倍体、倒位、易位、缺失或重复。遗传变异也可以是嵌合的。例如，遗传变异可以与遗传病症或遗传病症的危险因子相关(如囊性纤维化、戴萨克斯症、亨廷顿病、阿尔茨海默病和多种癌症)。遗传变异也可以包括任何突变、染色体异常或本领域技术人员已知的其它变异(例如，非整倍体、微缺失或微重复)。遗传变异可以对表型具有正面、负面或中性影响。例如，染色体变异可以包括有利的、有害的或中性变异。在一些实施方案中，遗传变异是疾病或紊乱的危险因子。然而，在一些实施方式中，遗传变异编码期望的表型性状。
[0048]在一些实施方案中，遗传变异是用于检测遗传性失调的组成的一部分。例如，在一些实施方案中，遗传变异是植入前遗传诊断过程中使用的组成的部分。在一些实施方案中，在测试后代样品前，测试母本和/或亲本样品的遗传变异。例如，在一些实施方案中，在测试胚胎前，确定一个或两个亲本的紊乱的携带状态。在一些实施方案中，在测试来自包含母体细胞和胎儿细胞的混合物的生物样品的胎儿细胞前，确定一个或两个亲本的紊乱的携带状态。在一些实施方案中，在测试后代样品的相同时间，测试母本和/或亲本样品的遗传变
巳
[0049]在一些实施方案中，所述遗传变异对于单基因失调可提供信息。在一些实施方案中，所述遗传变异对于复杂的遗传性失调可提供信息。在一些实施方案中，所述遗传变异是美国妇产科医师学会(ACOG)推荐的失调的标记物。在一些实施方案中，所述遗传变异是美国医学遗传学学院(ACMG)推荐的失调的标记物。在一些实施方案中，所述遗传变异是已知的变异。在一些实施方案中，所述遗传变异是新的变异。
[0050]用于等温全基因组扩增的样品制备
[0051]细朐裂解
[0052]在一些实施方案中，在细胞裂解前将生物样品稀释以达到所需要的细胞浓度。在一些实施方案中，细胞浓度为约10个细胞每反应体积。在具体的实施方案中，细胞浓度为约I个细胞每反应体积。例如，细胞浓度可以为约I个细胞每反应体积，其中所述反应体积为I微升。在一些实施方案中，生物样品含有靶细胞和非靶细胞。在一些实施方案中，所述细胞是有核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人类细胞。例如，在一些实施方案中，生物样品是包含母体细胞和胎儿细胞的母体样品。在一些实施方案中，在稀释物中的单细胞是胎儿细胞。
[0053]在细胞裂解前，可以将寡核苷酸添加到的反应混合物中。在一些实施方案中，寡核苷酸降低靶DNA的损失。例如，寡核苷酸可以以有效地降低DNA从细胞脱离后与其周围环境(如孔的壁或玻片的表面)附着的量存在。在一些实施方案中，寡核苷酸用于保护从细胞脱离后的靶基因组DNA。例如，寡核苷酸可以以有效地保护DNA免于被内源性核酸酶降解的量存在。此外，寡核苷酸可以以有效地使DNA在随后的反应，如扩增反应中更易于接近引物的量存在。在一些实施方案中，细胞裂解溶液中的寡核苷酸也作为用于扩增反应的引物。例如，在一些实施方案中，仅在细胞裂解反应前将寡核苷酸加入。在其它实施方案中，在细胞裂解反应和扩增反应两者之前将寡核苷酸加入。在这些实施方案中的一些中，用于细胞裂解的寡核苷酸和用于扩增反应的引物是相同的寡核苷酸。在其它实施方案中，用于细胞裂解的寡核苷酸和用于扩增反应的引物是不同的寡核苷酸。在一些实施方案中，仅在扩增反应前加入寡核苷酸。在一些实施方案中，在本发明的实施方案的方法和组合物中使用的寡核苷酸是随机寡核苷酸。
[0054]在一些实施方案中，将寡核苷酸加入到细胞稀释溶液或细胞裂解缓冲溶液中。在一些实施方案中，在细胞裂解期间，存在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或 200 μ M 的寡核苷
酸，或任意两个上述值所限定的范围的寡核苷酸。在具体实施方案中，在细胞裂解期间，存在约5μΜ至约100 μ M的加入的寡核苷酸。在更具体的实施方案中，在细胞裂解期间，存在约10 μ M至约50 μ M的随机寡核苷酸。在具体实施方案中，在细胞裂解期间，存在约12 μ M的随机寡核苷酸。
[0055]在一些实施方案中，所述寡核苷酸的长度为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基，或者为上述任意两个值所限定的范围。在具体实施方案中，所述寡核苷酸的长度为约4个碱基至约30个碱基。在更具体的实施方案中，所述寡核苷酸的长度为约7个碱基至约20个碱基。在具体的实施方案中，所述寡核苷酸的长度为约9个碱基。
[0056]在一些实施方案中，使用可商购的细胞裂解缓冲液，如设计用于RT-PCR的ABI裂解缓冲液(ABI DNA提取所有试剂裂解缓冲溶液，产品型号4405921)。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液为碱性裂解缓冲液。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液为基于磷酸盐的缓冲液，如基于磷酸钠或基于磷酸钾的缓冲液。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液包含碱和还原剂的组合。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液包含碱、还原剂和螯合剂的组合。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液不包含螯合剂。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液中的碱浓度为或者大约为100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 1000mM,或者为上述任意两个值所限定的范围。在一些实施方案中，所述碱是氢氧化钾(KOH)或氢氧化钠(NaOH)。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液中还原剂的浓度为或大约为5、10、15、20、25、26、27、28、29、30、31、
32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145 或 150mM，或者为上述任意两个值所限定的范围。在一些实施方案中，所述还原剂选自由二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇和(三(2-羧乙基)膦))(TCEP)组成的组。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液中的螯合剂的浓度为或大约为 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19或20mM，或者为上述任意两个值所限定的范围。在一些实施方案中，所述螯合剂为二价离子螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液包含氢氧化钾(Κ0Η)、二硫苏糖醇(DTT)和EDTA的组合。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液包含KOH和DTT的组合。例如，在一些实施方案中，使用的细胞裂解缓冲液包含600mM K0H、25mM DTT和2.5mM EDTA ；600mMK0H、50mM DTT 和 IOmM EDTA ；200mM K0H、50mM DTT 和 2.5mM EDTA ；200mM K0H、63mMDTT 和 2.5mM EDTA ；400mM KOHUOOmM DTT 和 IOmM EDTA ；600mM K0H、50mM DTT 和 2.5mMEDTA ；540mM K0H、50mMDTT和 2.5mM EDTA ；600mM KOHUOOmM DTT和 2.5mM EDTA ;600mMK0H、25mM DTT 和 IOmM EDTA ；200mM KOH 和 75mM DTT ;或 200mMK0H 和 83mM DTT。在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液不包含EDTA或EGTA。在具体实施方案中，所述细胞裂解缓冲液不包含EDTA。如本文所讨论的，在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液包含寡核苷酸。另外，在一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液还包含任何合适的蛋白酶，例如，蛋白酶K。
[0057]在一些实施方案中，细胞裂解进行约2、3、4、5、10、15、20、25或30分钟，或者上述任意两个值定义的范围。在具体实施方案中，细胞裂解进行约5至约10分钟。在一些实施方案中，细胞裂解于约 4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、4(rC、45°C、50°C、55°C、60°C或65°C下进行，或者于上述任意两个值定义的范围内进行。在具体实施方案中，细胞裂解于室温进行。
[0058]中和和样品的制各
[0059]裂解后，加入溶液以中和裂解缓冲液的pH。在一些实施方案中，使用可商购的中和缓冲液，如设计用于RT-PCR的ABI缓冲液(ABI DNA提取所有试剂，稳定溶液，产品型号4405928)。在一些实施方案中，所述中和缓冲液包含磷酸盐和螯合剂。在一些实施方案中，所述中和缓冲液包含磷酸盐、螯合剂和Tris。在一些实施方案中，磷酸盐的浓度为或者大约为 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 IOOmM,或者上述任意两个值定义的范围。在具体实施方案中，磷酸盐的浓度为或者为大约25mM至大约75mM。在更具体的实施方案中，所述磷酸盐的浓度为或者为大约40mM至大约60mM。在具体实施方案中，所述磷酸盐的浓度为或者为大约50mM。在一些实施方案中，所述磷酸盐选自由磷酸钠(NaPO4)、磷酸镁(MgPO4)和磷酸钾(KPO4)组成的组。在一些实施方案中，所述螯合剂的浓度为或者大约为 0.1,0.2,0.25,0.3,0.4,0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9 或10mM，或者上述任意两个值定义的范围。在具体实施方案中,所述螯合剂的浓度为或者为大约0.25mM至大约5mM。在更具体的实施方案中，所述螯合剂的浓度为或者为大约0.5mM至大约1.5mM。在具体实施方案中，所述螯合剂的浓度为大约ImM。在一些实施方案中，所述螯合剂为二价离子螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂为EDTA或EGTA。在一些实施方案中，所述中和缓冲液中Tris的浓度为或者大约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、
70、75、80、85、90、95或IOOmM,或者上述任意两个值定义的范围。在具体实施方案中，Tris的浓度为大约25mM至大约75mM。在更具体的实施方案中，Tris的浓度为大约40mM至大约60mM。在具体实施方案中，Tris的浓度为大约50mM。在一些实施方案中，所述中和缓冲液包含寡核苷酸。在一些实施方案中`，所述寡核苷酸的浓度为或者大约为25、50、75、100、125、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000 μ Μ，或者上述任意两个值定义的范围。在具体实施方案中，所述寡核苷酸的浓度为大约100 μ M至大约500 μ Μ。在更具体的实施方案中，所述寡核苷酸的浓度为大约150 μ M至大约300 μ M0在具体实施方案中，所述寡核苷酸的浓度为大约100 μ M至大约300 μ Μ。例如，在一些实施方案中，使用的中和缓冲液包含NaP04、HCl和寡核苷酸引物；50mM Tris和200 μ M寡核苷酸；或50mM KPO4UmM EDTA和200 μ M寡核苷酸。也可使用本领域技术人员可获得的其它中和缓冲液。在一些实施方案中，所述中和缓冲液的PH值为或者大约为7.4,7.5,7.6,7.7,7.8、7.9或8.0,或者上述任意两个值定义的范围。在具体实施方案中，所述中和缓冲液的PH值为大约7.5至大约7.9。
[0060]在扩增反应前，可将中和的混合物短暂加热变性以进一步增强DNA从裂解的细胞的释放(例如，通过帮助大的、复杂的基因组DNA分子从裂解的细胞释放)和/或增强引物-靶DNA相互作用并同时保持高质量的扩增产物。在一些实施方案中，将中和的混合物热处理小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟，或者上述任意两个值定义的范围。在具体实施方案中，将中和的混合物热处理小于约2分钟。在一些实施方案中，将中和的混合物于约 80°C、8rC、82°C、83°C、84°C、85°C、86°C、87°C、88°C、89°C、90°C、9rC、92°C、93°C、94°C、95°C、96°C、97°C、98或99°C时进行热处理，或者在上述任意两个值定义的范围进行热处理。在具体实施方案中，将中和的混合物于约90°C至约99°C进行热处理。在更具体的实施方案中，将中和的混合物于约95°C热处理约I分钟。在一些实施方案中，将经热处理的溶液迅速冷却，具体地在冰上冷却，以增强引物-靶基因组DNA的相互作用。如实施例4所示，短的热变性时间意想不到地使遗传物质的损伤最小化(例如，与在标准方案中使用的热变性时间相比)，同时增强了 DNA从裂解细胞的释放并且增强了引物-靶基因组DNA相互作用。
[0061]在一些实施方案中，进行细胞裂解和扩增不需要介入DNA提取步骤。在一些实施方案中，在相同的样品混合物中进行细胞裂解和扩增。在具体实施方案中，在相同的位置进行细胞裂解和扩增。例如，在一些实施方案中，在相同的孔中或者相同的玻片上进行细胞裂解和扩增。在一些实施方案中，所述孔为微孔。在一些实施方案中，在相同的乳化溶液中进行细胞裂解和扩增。
[0062]在一些实施方案中，将样品的机械操作最小化。例如，在一些实施方案中，通过降低或消除细胞和/或提取的基因组物质的涡旋使样品的机械操作最小化。例如，在制备用于细胞裂解或扩增的样品期间使涡旋最小化。在具体实施方案中，在制备用于反应的样品中不使用涡旋。例如，可以使用振动器、旋转器或手工翻转样品。在一些实施方案中，试剂或遗传材料不进行混合。另外，在一些实施方案中，使用短暂的热变性步骤以降低由在标准方案中使用的热变性步骤所引起的对遗传物质的损伤。在具体实施方案中，将中和的混合物于大约95°C热处理约I分钟。在一些实施方案中，将热处理的溶液在冰上迅速冷却以增强引物-靶基因组DNA的相互作用。
[0063]如上所讨论的，以前认为使用标准方案从全血中分离基因组DNA需要大量纯化。然而，如实施例5所示，在本文提供的扩增方法中RBC的存在意想不到地对Phi29DNA聚合酶没有抑制作用。实际上，实施例5中WGA中较高的RBC浓度降低了基因座脱扣(LDO)率和等位基因脱扣(ADO)率。在一些实施方案中，进行本文描述的扩增反应而不需要之前的步骤以从样品中除去红细胞(RBC)。在一些实施方案中，每微升总扩增反应体积存在高至约5、
50、500、1000、2500、5000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、75000或100000个RBC，或上述任意两个值定义的范围的RBC。在一些实施方案中，每微升总扩增反应体积中存在约500至约50000个RBC。在具体实施方案中，每微升总扩增反应体积中存在约2500至约10000个RBC。在具体实施方案中，每微升总扩增反应体积中存在至少约3500个RBC。在某些实施方案中，扩增反应为全基因组扩增反应。
[0064]遗传材料的完整性的维持
[0065]如上所讨论的，以前的样品制备方法、细胞裂解和扩增条件引起不利于WGA实行的遗传物质的损伤。通过组合一些或所有本文中描述的制备样品的方法，可以制备WGA反应中使用的高质量和高数量的遗传物质。例如，通过使用优化的细胞裂解缓冲液，在裂解溶液中使用寡核苷酸，使机械操作最小化或不使用机械操作，以及使用短暂热变性处理，可以保持遗传材料的完整性。
[0066]扩增
[0067]在一些实施方案中，用于扩增的起始基因组物质为来自约1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、750、1000、1200 和 1500 个细胞或上述任意两个值定义的范围的细胞的基因组物质。在一些实施方案中，用于扩增的起始基因组物质为来自约I个至约500个细胞的基因组物质。在具体的实施方案中，用于扩增的起始基因组物质为来自约I个至约100个细胞的基因组物质。在具体的实施方案中，用于扩增的起始基因组物质来自不超过I个有核细胞。在具体实施方案中，用于扩增的起始基因组物质为来自约I个细胞的基因组物质。
[0068]在一些实施方案中，进行单扩增反应。在一些实施方案中，进行大于一轮扩增反应以增加扩增产物的量和/或降低假阳性结果。在一些实施方案中，加入新鲜试剂，并继续进行扩增反应。在一些实施方案中，进行第二轮扩增以增加测序或CGH分析所需要的基因组物质的量(例如，来自第一轮扩增产生的物质不足以进行CGH的情况)。例如，在一些实施方案中，来自第一轮扩增的扩增物质的一部分用作用于第二轮反应的起始物质。在一些实施方案中，来自第一轮扩增的至少或者至少约1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或 100% 的扩增产物，或者上述任意两个值定义的范围的扩增产物用作第二轮扩增反应的起始物质。在具体实施方案中，来自第一轮扩增的约5%至约75%的扩增产物用作第二轮扩增反应的起始物质。在更优选的实施方案中，来自第一轮扩增的约25%至约50%的扩增产物用作第二轮扩增反应的起始物质。在具体实施方案中，来自第一轮扩增的约25%的扩增产物用作第二轮扩增反应的起始物质。另外，如果期望或更多或更少的扩增产物，可以使用额外轮的扩增、分开/亚轮方法或连续/同时/联合的应用方法。在具体实施方案中，将第一轮扩增反应中的聚合酶进行热灭活，并将1μ I的反应体积稀释至20μ I总体积。在具体实施方案中，在第二轮扩增中使用25%的反应体积。
[0069]在本文描述的WGA混合物中，可以使用基于Tris的缓冲液、MOPS或HEPES，或本领域技术人员已知的任何其它合适的缓冲液。另外，可以使用任何具有链置换活性的聚合酶。在一些实施方案中，所述聚合酶为等温或热稳定聚合酶。在一些实施方案中，所述聚合酶为Phi29DNA聚合酶或Bst聚合酶。在具体实施方案中，所述聚合酶为Phi29DNA聚合酶。在一些实施方案中，WGA混合物包含盐混合物。在一些实施方案中，NaCl的浓度为约I至约lOOmM。在一些实施方案中，MgCl2的浓度为约I至约lOOmM。在一些实施方案中，(NH4)2SO4的浓度为约I至约lOOmM。在一些实施方案中，Phi29DNA聚合酶的浓度为约I至约100单位。在一些实施方案中，dNTP的浓`度为约0.1至约5mM。在一些实施方案中，寡核苷酸的浓度为约50至约200mM。在一些实施方案中，所述盐混合物包含Tris-HCl ;NaCl或KCl ；MgCl2或MnCl2JP (NH4)2S04。例如，在具体实施方案中，使用包含50mM Tris-HClUOmMNaClUOmMMgCl2和IOmM (NH4) 2S04的盐混合物。在具体实施方案中，所述WGA混合物包含盐混合物、聚合酶、dNTP和寡核苷酸引物。在一些实施方案中，所述WGA混合物还包含DTT和BSA中的至少一种。在具体实施方案中，每微升WGA混合物中包含盐混合物、5mM DTT、0.38mM dNTP、
0.012mM寡核苷酸引物、Ing/yL BSA和0.05 μ L Phi29DNA聚合酶。在具体实施方案中，WGA 混合物包含 Tris-HCl (加入至裂解物前 pH 值为 7.5)、NaCl、MgCl、(NH4) 2S04、Phi29DNA聚合酶、dNTP和寡核苷酸引物。
[0070]可以对在本文描述的反应中使用的寡核苷酸引物进行修饰，以防止引物-引物双链体的聚合，同时还允许模板导向的聚合。虽然修饰的寡核苷酸引物在本领域已经被描述，但是它们还没有被用在低水平DNA扩增或单细胞WGA反应中。本文描述的实施例证明修饰的寡核苷酸引物意想不到地降低了低水平DNA扩增(包括单细胞反应)中模板非依赖性非特异性产物的形成，从而改善了 WGA产物质量。在一些实施方案中，所述引物为九聚体或9个碱基的随机序列寡核苷酸引物(N9)。在一些实施方案中，所述引物包含间隔臂(例如，C6、C12或C18)、脱碱基位点或反向极性核苷酸。在一些实施方案中，所述引物在5’末端包含C3间隔区。在具体实施方案中，所述引物为在5’末端具有C3间隔区的随机九聚体(即，C3-N9)。在具体实施方案中，所述引物还包括连接到5’末端C3间隔区的额外单核苷酸(SP，N-C3-N9)。然而，本领域技术人员将认识到本文描述的引物可包含在5’端产生聚合嵌段的其它修饰。
[0071]也可利用减少修饰碱基或修饰碱基互补杂交的修饰的碱基，以减少本文描述的方法中的模板非依赖性扩增事件。修饰的碱基也可稳定双连体形成，并且因此可用于平衡AT和GC熔融温度，从而增强较少依赖于引物GC含量的短引物与DNA模板的退火，从而使扩增偏向性最小化。在一些实施方案中，所述修饰的碱基为2-氨基-dA或嘧啶类似物。在具体的实施方案中，修饰的碱基配对组合是2，6-二氨基嘌呤和5- (1-丙炔基)_2’ -脱氧尿苷(DAP/pdU)。然而，可以使用本领域技术人员已知的任何适当修饰的碱基配对组合(Y.Lebedev 等人，Genetic Analysis-Biomolecular Engineering, 1996，13，15-21 ;L.E.Xodo 等人，Nucleic Acids Res.，1991，19，5625-5631; B.C.Froehler 等人，Tetrahedron Lett., 1992, 33, 5307-5310 ;Ι.V.Kutyavin等人，Biochemistry, 1996, 35, 11170-11176 ;和 Η.K.Nguyen 等人，Nucleic Acids Res.，1997，25，3059-65)。
[0072]另外，可降低在本文描述的扩增方法中使用的修饰的引物的简并性。例如，可将引物简并性降低至消除引物反向互补物(为随机合成产物所固有)的产生，或者平衡GC/AT探针含量以使扩增偏向性最小化。用于降低引物简并性的技术是本领域技术人员公知的。
[0073]在扩增反应 期间由dNTP产生的无机磷酸盐(PPi)对聚合酶有抑制作用并且降低扩增的效率。因此，在一些实施方案中，向扩增反应中加入酵母无机焦磷酸酶(IPP)(New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)或热稳定无机焦憐酸酶(TIPP) (New EnglandBiolabs, Inc., Ipswich, MA)以改善性能和/或效率。在具体实施方案中，将无机焦磷酸酶加入至低体积(例如，纳升规模)扩增反应中。另外，在一些实施方案中，将牛血清白蛋白(BSA)用作聚合酶稳定剂以增加扩增反应的效率。
[0074]在一些实施方案中，在低反应体积中进行扩增反应。在一些实施方案中，在纳升规模上进行扩增反应。在一些实施方案中，在微升规模上进行扩增反应。在一些实施方案中，在大约 10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200 或 1250nL,或者上述任意两个值定义的范围的总反应体积中进行扩增反应。在一些实施方案中，在大约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5,5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10 μ L，或者上述任意两个值定义的范围的总反应体积中进行扩增反应。在具体实施方案中，在大约200nL至大约5μ L的总反应体积中进行扩增反应。在更具体的实施方案中，在大约500nL至大约2.5μ L的总反应体积中进行扩增反应。在具体实施方案中，在大约1000nL的总反应体积中进行扩增反应。在一些实施方案中，使用H2O将遗传物质、裂解缓冲液、中和缓冲液和WGA混合物的体积放大至总反应体积。在具体实施方案中，在用于WGA反应的最终组合物中，组分比例为遗传物质:裂解缓冲液:中和缓冲液:H2O: WGA混合物为1: 1: 1: 1:7。[0075]在一些实施方案中，用于扩增的最终组合物于大约4°C、5 °C、6 °C、7 °C、8 °C、9 °C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C或50°C，或者上述任意两个值定义的范围内孵育。在具体实施方案中，用于扩增的最终组合物在大约25°C至40°C孵育。在具体实施方案中，用于扩增的最终组合物于在大约30°C孵育。在一些实施方案中，所述扩增包括孵育至少，或者至少大约1、5、10、15、30、45或60分钟，或者上述任意两个值定义的范围。在一些实施方案中，所述扩增包括孵育至少，或者至少大约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 小时，或者上述任意两个值限定的范围。在具体实施方案中，将混合物孵育大约30分钟至大约4小时。在更具体的实施方案中，将混合物孵育至少大约3小时。
[0076]合并
[0077]在WGA反应中，不会均等地发生如基因组模板损伤、随机引物偏向和等位基因脱扣和基因座脱扣的随机事件。因此在一些实施方案中，将WGA产物合并以使随机事件的作用归一化。在一些实施方案中，将相同来源的多个反应(如临床样品、细胞群或细胞类型)合并。在一些实施方案中，将不同来源的反应合并。在一些实施方案中，将等量的扩增产物合并以使得即使单一反应的产量非常低或非常高，将单一反应对合并物的影响或偏向性最小化。在一些实施方案中，将大约2、3、4、5、10、15、20、25、50或100个反应，或者上述任意两个值定义的范围的反应合并。在具体实施方案中，将大约2个至大约50个反应合并。在更具体的实施方案中，将大约2个至大约20个反应合并。在具体实施方案中，将大约5个反应合并。
[0078]可在第一轮和/或第二轮WGA反应后使用样品合并策略。在一些实施方案中，在进行第二轮WGA前将来自多个第一轮WGA反应的产物合并。在一些实施方案中，在进行分析前将来自多个第二轮WGA反应的产物合并。在一些实施方案中，在进行第二轮WGA前将来自多个第一轮WGA反应的产物合并，并且在进行分析前将来自多个第二轮WGA反应的产物合并。在一些实施方案中，在进行分析前将来自第一轮和第二轮WGA反应的产物合并。
[0079] 可以与合并策略一起，将来自WGA反应的产物分为等分试样。例如，可以将来自第一轮WGA反应的产物分为多个部分，各部分进行第二轮WGA反应，然后在分析前将来自第二轮WGA反应的产物合并。在一些实施方案中，将来自多个第一轮WGA反应的产物的等分试样合并，并且对合并的产物进行第二轮WGA反应。备选地，可以将来自多个第一轮WGA反应的产物或其等分试样合并，然后在第二轮WGA反应前，再分为多个反应。在一些实施方案中，在第二轮WGA反应后和分析之前将样品合并。
[0080]也可以使用靶向合并策略。在一些实施方案中，将鉴定为包含胎儿细胞的样品合并。例如，可以将来自WGA反应的样品分为等分试样，其中对来自每份样品的至少一份等分试样进行胎儿等位基因的存在的测试，并且将来自鉴定为包含胎儿细胞的每份样品的至少一份剩余的等分试样合并。在一些实施方案中，对合并的样品进行遗传变异的测试。在一些实施方案中，对所述合并的样品进行额外的WGA反应。在一些实施方案中，将证明特定质量水平的样品合并。例如，可以将来自WGA反应的样品分为等分试样，其中对来自每份样品的至少一份等分试样进行ADO或LDO测试，并且将来自被鉴定为产生的ADO或LDO率低于特定值的每份样品的至少一份剩余的等分试样合并。本领域技术人员也将认识到:所述合并策略的其它变化形式可以与本文描述的方法组合实施。[0081]阵列比较基因组杂交
[0082]在一些实施方案中，阵列CGH用于在WGA后鉴定样品中遗传变异的存在。例如，在一些实施方案中，阵列CGH用于分析拷贝数变异(CNV)从而检测非整倍体。在优选的实施方案中，阵列CGH用于鉴定与遗传病症或遗传病症的危险因子相关的遗传变异。
[0083]另外，在一些实施方案中，使用如本文所述的阵列CGH评价WGA产物的质量和/或数量。如在本文中所讨论的，用于单细胞基因组物质的等温WGA的标准方案已经导致阵列CGH的不可接受水平的“噪音”，例如，在对数比率图上数据点分散增加。如实施例2所示，用来自单细胞的WGA产物，本文描述的方法和组合物意想不到地产生低水平的阵列CGH噪
音?
[0084]测序
[0085]在一些实施方案中，在WGA后，使用测序鉴定样品中靶细胞和/或遗传变异的存在。例如，在一些实施方案中，测序用于鉴定与遗传病症或遗传病症的危险因子相关的遗传变异。
[0086]在一些实施方案中，所述测序方法是新一代测序方法。例如，在一些实施方案中，使用平台如Illumina基因组分析仪、Roche454测序仪、AppliedBioSystems SOLiD 仪器、1n-Torrent 个人基因组机器、Heliscope 仪器(Helicos Biosciences Corporation, Cambridge, MA)> 单分子实时(SMRT)DNA 测序技术(Pacific Biosciences, Menlo Park, CA)或 Nanostring 技术(NanostringTechnologies, Seattle, WA)进行测序。然而，可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术或平台进行测序。
[0087]质量控制
[0088]可以对本文描述的任何产物(包括来自单细胞反应的产物、来自单细胞反应的合并的产物、来自使用多细胞进行的反应的产物或者来自使用多细胞进行的反应的合并的产物)的质量进行评价。
[0089]在一些实施方案中，通过使用标准方法(如SNP基因分型或测序分析)鉴定靶基因座的能力对WGA产物的质量进行测定。使用本文描述的方法，也可将SNP基因分型或测序用于测定基因组的覆盖水平。
[0090]在一些实施方案中，使用等位基因脱扣(ADO)率或基因座脱扣(LDO)率测定WGA产物的质量。例如，可以通过将WGA反应的产物基因分型成已知杂合SNP以及确定产生纯合(即，AD0)或不可检测的卿，LD0)结果的这些杂合基因座的分数来测定质量。在一些实施方案中，基于PCR、基于SNP阵列、基于阵列CGH或基于测序的方法用于量化与使用标准方法产生的ADO率或LDO率相比，ADO率或LDO率的减少。例如，在一些实施方案中，通过使用WGA产物产生的阵列CGH数据的质量测定WGA产物的质量。例如，在一些实施方案中，可以通过鉴定阵列CGH中“噪音”的降低(例如，在对数比率图上数据点分散减少)来确定高质量的WGA产物。而且，也可通过本领域技术人员已知的任何合适的技术测定改善的质量。
[0091]另外，本文中描述的方法的改进的性能可以被测定为特异性目的基因组物质的扩增的增加、模板非依赖性聚合的扩增的降低(或消除)、目的基因组物质的扩增的偏向性较低，或者本领域技术人员已知的任何其它合适的方法。在一些实施方案中，偏向性的降低被测定为，与标准 WGA (例如 Morrison 等人，Am J Trop Med Hyg.76(2007) 1132-1137 中公开的WGA、基因组方案或者现代分子生物学方案)相比，标记物的ADO率降低至少，或者至少大约 1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，或者上述任意两个值定义的范围。在一些实施方案中，偏向性的降低被测定为标记物的ADO率降低至少，或者至少大约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 99%，或者上述任意两个值定义的范围。实施例8示出了 ADO率降低80%。在一些实施方案中，ADO率小于扩增反应的大约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、50%。
[0092]本领域技术人员应该理解可以进行许多和多种修饰而不背离本发明的实质。本领域技术人员已知的试剂和方案可以，例如在基因组分子生物学方法和现代分子生物学方法(Genomic Protocols and Current Protocols in MolecularBiology) (GenomicProtocols, 439 卷，Starkey 和 Elaswarapu 编著，Totowa, NJ:Humana Press Inc.; CurrentProtocols in Molecular Biology ? 2008: John ffiley&Sons, Inc.)中找到。本文引用的所有参考文献在此全部通过引用结合用于讨论的主题。下述实施例仅用于说明的目的，并不意于限制本发明的范围。
[0093]实施例1:全基因组扩增中降低的模板非依赖性聚合
[0094]如下对修饰的引物对WGA中模板非依赖性聚合的作用进行检查。将大约0.2ng雌性基因组DNA (224.9ng/yL) (Promega;Madison, WI)与标准随机九聚体引物或修饰的随机九聚体引物在Tris (pH7.5)和KCl缓冲液中组合，最终体积为10 μ L或25 μ L。通过将混合物于95°C加热3分钟，然后立刻在冰上冷却5分钟来进行引物退火反应。冷却后，将10μ L 或 25 μ LffGA 混合物(由 phi29、2X 提供的 phi29 反应缓冲液、dNTP (New EnglandBiolabs, Ipswich, MA)、BSA (Promega, Madison, WI)和酵母无机焦憐酸酶(New EnglandBiolabs1MA)组成)加入至所述DNA/引物混合物中，于30°C孵育4小时，然后于65°C进行热灭活步骤10分钟。
[0095]热灭活后，将10 μ L` 各 WGA 反应物在 I X TBE 缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)中的0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳。然后将凝胶用溴化乙锭染色并在UV灯箱中成像。
[0096]如在图1A和IB中所看到的，与使用对照引物观察到的模板非依赖性聚合产物的量相比，在WGA中使用修饰的引物导致模板非依赖性聚合产物的产生减少。另外，在低反应体积的WGA中使用修饰的引物导致改善的扩增(参见图1B)。
[0097]这些结果示出本发明的实施方案中的方法和组合物有利于减少全基因组扩增中模板非依赖性聚合。这些结果表明本发明的实施方案中的方法和组合物有利于全基因组扩
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[0098]实施例2:通过阵列比较基因组杂交改善的全基因组扩增的基因组物质
[0099]阵列比较基因组杂交(aCGH)是允许在整个基因组中检测DNA序列拷贝数异常的技术(例如,染色体不平衡、非整倍体)。aCGH也可用于评价WGA方法的效力。因此，如下将使用aCGH分析评价与标准WGA方法相比，本发明的实施方案中WGA方法的效力。
[0100]作为参考，对根据标准WGA技术产生的DNA进行aCGH分析。简言之，将来自两个细胞系 AG09802 和 GM10175 (Coriell Institute for Medical Research; Camden, NJ)的10个细胞独立地分配到384孔板的不同的孔中，并用标准裂解缓冲液(裂解溶液；Applied Biosciences, Foster City, CA)于室温下孵育3分钟。裂解后，向各孔中加入标准中和缓冲液(稳定溶液，Applied Biosciences, Foster City, CA) 3分钟。然后，使用phi29聚合酶(Enzymatics, Beverly, MA)、标准随机九聚体引物(IntegratedDNA Technologies, Inc.，Coralville, IA)和酵母无机焦憐酸酶(New EnglandBiolabs, Ipswich, MA)在I μ L的终体积反应中于30°C进行第一轮等温WGA4小时,接着于65°C进行热灭活10分钟。然后通过加入4μ L随机九聚体引物/退火Tris缓冲液混合物，使用phi29聚合酶对I μ L WGA样品进行第二轮等温WGA。于95°C加热3分钟后，将5 μ L反应体积在冰上冷却5分钟，然后加入5 μ L WGA混合物(由phi29、2X提供的phi29反应缓冲液、dNTP (New England Biolabs, Ipswich, MA)>BSA (Promega, Madison, WI)和酵母无机焦磷酸酶(New England Biolabs, MA)组成)。然后于30°C进行第二轮等温WGA4小时,接着于65°C进行热灭活10分钟。
[0101]然后，将来自第二轮WGA的10 μ L样品进行限制酶消化、标记、DTR-柱纯化(EdgeBioSystems, Gaithersburg, MD)、配对，并根据制造商的方案在 Agilent8X60k CGH 阵列上杂交。在根据制造商的方案将aCGH玻片洗涤和扫描后，使用来自BioDiscovery (ElSegundo, CA)的Nexus5.0软件对数据进行分析。
[0102]在另一组实验中，对通过本发明的实施方案的方法和组合物产生的DNA进行aCGH分析。简言之，将来自两个细胞系AG09802和GM10175 (Coriell Institute forMedical Research; Camden, NJ)的10个细胞独立地分配到384孔板的不同的孔中，并用标准裂解缓冲液(裂解溶液；Applied Biosciences, Foster City, CA)于室温下孵育3分钟。细胞裂解后，向各孔中加入本发明实施方案中的基于磷酸盐的中和缓冲液3分钟。然后，使用phi29聚合酶(Enzymatics, Beverly, MA)、修饰的随机九聚体引物(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA)和酵母无机焦憐酸酶(New EnglandBiolabs, Ipswich, MA)在I μ L的终体积反应中于30°C进行第一轮等温WGA4小时,接着于65°C进行热灭活10分钟。在第一轮等温WGA后，向I μ L的WGA样品中加入19 μ L无核酸酶的水。然后，使用phi29聚合酶通过加入2.5 μ L修饰的随机九聚体引物/退火缓冲液混合物对10 μ L稀释的WGA样品进行第二轮等温WGA。于95°C加热3分钟后，将12.5 μ L反应体积在冰上冷却5分钟，然后加入7.5 μ L `WGA混合物(由phi29、2.67 X提供的phi29反应缓冲液、dNTP (New England Biolabs, Ipswich, MA)>BSA (Promega, Madison, WI)和酵母无机焦磷酸酶(New England Biolabs, MA)组成)。然后于30°C进行第二轮等温WGA4小时，接着于65°C进行热灭活10分钟。
[0103]然后，将来自第二轮WGA的20 μ L样品进行限制酶消化、标记、DTR-柱纯化(EdgeBioSystems, Gaithersburg, MD)、配对，并根据制造商的方案在 Agilent8X60k CGH 阵列上杂交。在根据制造商的方案将aCGH玻片洗涤和扫描后，使用来自BioDiscovery (ElSegundo, CA)的Nexus5.0软件对数据进行分析。
[0104]图2中示出了通过标准WGA产生的基因组物质的aCGH分析结果。如图2A所示，标准WGA技术在扩增低水平的基因组物质(例如，10个细胞基因组)时是无效的。在通过标准WGA方法产生的基因组物质中观察到大量的“噪音”(例如在对数比率图上数据点分散)，这妨碍了样品中遗传变异的检测。图2B示出了通过本发明的实施方案中的WGA方法产生的基因组物质的aCGH分析。如图2B所示，与标准WGA方法相比，使用本发明的实施方案中的方法和组合物的WGA在扩增低水平基因组物质(例如，10个细胞基因组)中有效。“噪音”的大量减少使得可以检测样品中的遗传变异。图2B中的箭头表示在样品基因组中存在染色体不平衡。
[0105]这些结果表明本发明的实施方案中的方法和组合物有利于进行全基因组扩增。更具体而言，这些结果表明本发明的实施方案中的方法和组合物有利于进行低水平基因组物质(例如，单细胞)的全基因组扩增。这些结果还显示本发明的实施方案中的方法和组合物有利于进行阵列比较基因组杂交和用于鉴定或检测细胞中的遗传变异。
[0106]实施例3:合并的WGA产物对随机事件的作用归一化
[0107]随机事件，如基因组模板损伤、随机引物偏向性和等位基因脱扣和基因座脱扣，在WGA反应中不是均等地发生的。因此，如下对合并的通过本发明的实施方案的方法和组合物产生的WGA产物的作用进行检查。
[0108]将来自两个细胞系GM10239 和 GM11962 (Coriell Institute for MedicalResearch;Camden, NJ)的每种的10个细胞或一个细胞独立地分配到384孔板的不同的孔中，并用裂解缓冲液(裂解溶液;Applied Biosciences, Foster City, CA)于室温下孵育3分钟。细胞裂解后，向各孔中加入本发明实施方案中的基于磷酸盐的中和缓冲液3分钟。于95°C进行变性步骤I分钟后，使用phi29聚合酶(Enzymatics, Beverly, MA)和修饰的随机九聚体引物(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA)在 1μ L 的终体积中于30°C进行第一轮等温WGA2小时，接着于65°C进行热灭活10分钟。在第一轮等温WGA后，向I μ L的WGA样品中加入19 μ L无核酸酶的水。然后，使用phi29聚合酶通过加入2.5 μ L修饰的随机九聚体引物/退火缓冲液混合物对10 μ L稀释的WGA样品进行第二轮等温WGA。于95°C加热3分钟后，将12.5 μ L反应体积在冰上冷却5分钟，然后加入7.5 μ L WGA混合物(由 phi29、2.67X 提供的 phi29 反应缓冲液、dNTP(New England Biolabs, Ipswich, MA)、BSA (Promega, Madison, WI)和酵母无机焦憐酸酶(New England Biolabs, MA)组成)。然后于30°C进行第二轮WGA4小时，接着于65°C进行热灭活10分钟。
[0109]然后，使用每种 5单位的RsaI和AluI (Promega, Madison, WI)以及制造商提供的缓冲液在26 μ L的终体积中于37°C对20 μ L来自第二轮WGA的样品进行限制酶消化2小时，接着于65°C进行热灭活步骤20分钟，然后在冰上冷却至4°C，随后根据制造商的方案进行DTR-柱(Edge BioSystems, Gaithersburg, MD)纯化。DTR纯化后，根据制造商的说明，使用 NanoDroplOOO 分光光度计(Thermo Scientific, Wilmington, DE)对 DNA 产量进行定量。随后，通过合并每种合适的单独DTR纯化后的WGA反应物各5 μ L得到合适的“库”，并且将这些合并的样品使用NanoDroplOOO分光光度计进行再定量。
[0110]然后，根据Agilent微阵列标记方案，使用合适的染料(cy3或cy5)将I μ g每种合适的样品(未合并的和合并的)进行标记，按照制造商的说明进行DTR-柱纯化(EdgeBioSystems, Gaithersburg, MD),进行杂交的合适的配对，然后根据制造商的说明在Agilent8X60k CGH阵列上杂交。在根据制造商的方案将aCGH玻片洗涤和扫描后，使用来自 BioDiscovery (El Segundo, CA)的 Nexus5.0 软件对数据进行分析。
[0111]图3A-3D示出了通过本发明实施方案中的WGA方法产生的合并的和未合并的基因组物质的aCGH分析结果。如图3A所示，通过本发明实施方案中的WGA方法产生的未合并的单细胞基因组物质允许全染色体不平衡检测。图3B中来自三个不同的单细胞WGA反应的合并的基因组物质显示了清楚的亚染色体不平衡检测(即，非整倍体)。与未合并的单细胞基因组物质相比，来自5个单细胞WGA反应的合并的基因组物质显示“噪音”明显降低(将图3A与图3B和3C相比)。特别地，用5个单细胞合并的WGA样品的亚染色体不平衡检测与用10个细胞未合并的WGA样品的亚染色体不平衡检测相当(参见图3C和3D)。
[0112]这些结果显示合并WGA基因组物质降低了噪音，并将未合并的WGA基因组物质的随机事件的作用归一化。另外，这些结果显示本发明实施方案中方法和组合物有利于进行全基因组扩增。更具体地，这些结果显示本发明实施方案中的方法和组合物有利于进行阵列比较基因组杂交和用于鉴定或检测细胞中的遗传变异。
[0113]实施例4:降低的基因组损伤改善了全基因组扩增
[0114]在制备用于全基因组扩增的DNA时可能发生基因组损伤(例如，碎裂、产生切口等)。因此采用热诱导的DNA损伤的模型检查基因组损伤对WGA效力的作用。
[0115]将50μ L无核酸酶水中的大约500ng的雌性或雄性基因组DNA(Promega, Madison, WI)进行加热(热处理)或不进行加热(对照处理)，然后在无核酸酶水中进一步稀释至Ing/ μ L DNA。将热处理的样品于99°C进行热处理4分钟，或95°C进行热处理12.5分钟，然后在冰上冷却5分钟，随后稀释至最终DNA浓度为Ing/ μ L。处理后，使用phi29酶和Ing输入DNA对样品进行等温扩增
[0116]在10 μ L反应体积中，在IOmM Tris (ρΗ7.5)和20mM KCl中，将修饰的随机九聚体引物制剂与DNA样品进行退火。通过将反应混合物于95°C加热3分钟、然后在冰上冷却5分钟进行引物退火反应。接着，向DNA/引物混合物中加入IOyL WGA混合物(由phi29 (Enzymatics, Beverly, MA)>2 X 提供的 phi29 反应缓冲液、dNTP (New EnglandBiolabs, Ipswich, MA)、BSA (Promega, Madison, WI)和酵母无机焦憐酸酶(New EnglandBiolabs, MA)组成)，然后于30°C孵育4小时，随后于65°C进行热灭活步骤10分钟。
[0117]WGA 后，将每种反应`物 3μ? 在 IXTBE 缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)中的0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，使用I μ g的Ikb分子量大小标记物(Invitrogen, Carlsbad, CA)，在图4A和4B中表示为“M”。然后将凝胶用溴化乙锭染色并在UV灯箱中成像。
[0118]这些结果表明本发明实施方案中的方法和组合物降低了基因组损伤并改善了全基因组扩增。在例如，应用机械操作(例如，涡旋)或增加基因组物质的温度(例如，加热)时可能发生基因组损伤(例如，碎裂、产生切口等)，因此，这些结果表明将基因组物质于95°C加热小于12.5分钟有利于制备用于全基因组扩增的DNA。
[0119]实施例5:红细胞改善了全基因组扩增的DNA的质量
[0120]如下检查红细胞(RBC)对phi29的活性和全基因组扩增的DNA的质量(如，产量、覆盖度)的作用。
[0121]使用Pall过滤器(Covina，CA)自成年雌性外周血中分离RBC，用PBS缓冲液洗涤，并以多种比率与靶细胞(细胞系12891，雄性)混合。随后，将IOOnL的这些细胞溶液(包含平均含有或不含有500至50，000个RBC的I个12891细胞(参见图5))分配到384PCR板的各孔中。接着，根据上述实施例2中用于第一轮等温WGA描述的方法对各样品进行等温WGA。WGA后，向各样品中加入19 μ L无核酸酶的水，并将大约0.5 μ L稀释的WGA产物进行PCR，从而对在反应中有和没有RBC的靶细胞(12891) WGA的扩增产量和保真度进行比较。
[0122]图5显示来自二重PCR的PCR数据，检测到2个基因座，一个来自X染色体(Χ2)，一个来自Y染色体(SRY2)。向WGA反应中引入RBC不影响SRY2或X2的Ct.值(即，扩增产量不降低)，并且不降低阳性WGA反应的数量或阳性WGA反应的百分数(或WGA中的单靶细胞12891的泊松分布)。这些结果显示RBC，在IyL WGA反应中高至50，000个RBC对来自单细胞的靶基因组DNA的全基因组扩增没有抑制作用。而且，WGA中的RBC改善了 WGA的保真度，这通过用SRY2和X2检测的WGA数目的增加得到证实(表明没有等位基因或基因座脱扣)。相反，具有等位基因和基因座脱扣的WGA反应(没有检测和单SRY2或X2检测的那些反应)的数目随WGA反应中RBC的增加而降低)(参见图5)。对上述WGA样品进行另一系列的实验:对靶细胞(12891)进行18个杂合SNP PCR0杂合基因型的结果表明两个等位基因均成功扩增，而纯合基因型表明无等位基因检测的(ND)的等位基因脱扣(ADO)和基因座脱扣(LD0)。18个杂合SNP PCR的结果，包括各测试组的ADO和LDO的百分数在图6中显示。这些数据证明WGA中存在或加入RBC增加了杂合计数(表明WGA产物改善的质量)，但是降低了纯合计数(表明降低的AD0)和ND (表明降低的LD0)率。
[0123]这些结果显示WGA反应中存在RBC不抑制靶基因组扩增，并且实际上改善了靶基因组WGA的覆盖度。这些结果进一步显示本发明实施方案中的方法和组合物有利于进行全基因组扩增。
[0124]实施例6:改善的全基因组扩增的DNA的覆盖度和保真度
[0125]细胞裂解后，在WGA前通常使用基于Tris的缓冲液中和全细胞裂解物。基于Tris的缓冲液可损伤DNA导致全基因组扩增的DNA的覆盖度和保真度降低。因此，如下对修饰的中和缓冲液对WGA的性能的作用进行检查。将来自两个细胞系AG09802和GM10175(Coriell Institute for Medical Research;Camden, NJ)的单细胞独立地分配到 384孔板上的不同的孔中，并与标准裂解缓冲液(裂解溶液;Applied Biosciences, FosterCity, CA)于室温下孵育3分钟。裂解后，将一半样品(96孔)用Tris缓冲液中和，另一半样品(96孔)用本发明实施方案中的基于磷酸盐的缓冲液中和3分钟。然后，使用phi29聚合酶(Enzymatics, Beverly, MA)、随机九聚体引物(Integrated DNATechnologies, Inc., Coralville, IA)和酵母无机焦憐酸酶`(New England Biolabs, Ipswich, MA)在 I μ L 的终体积中于30°C进行第一轮等温WGA4小时，接着于65°C进行热灭活步骤10分钟。
[0126]通过二重实时PCR对来自所有反应的WGA产物进行分析，从而检测扩增自Y染色体(‘DDY2’)和GAPDH基因(甘油醛_3_磷酸脱氢酶，看家基因)的特异性产物。各“阳性"WGA反应中单细胞的存在对于确定WGA中等位基因脱扣(ADO)率和基因座脱扣(LDO)率是必要的。因此，适当的泊松分布用于将一个细胞或不将细胞递送到各孔中。通过检测DDY2和/或GAPDH基因产物确定各WGA反应中单细胞的存在。仅检测到GAPDH产物的WGA反应表明在来自WGA反应中的细胞的Y染色体上DDY2的AD0。另一方面，仅检测到DDY2产物的孔表明WGA中GAPDH基因的LD0。通过用DO数目除以具有细胞的WGA孔的总数目计算DO的百分率。
[0127]下表1概述了对于测试的两种中和缓冲液的ADO率和LDO率。如表1所示，各缓冲液组中相似数目的孔包含单细胞(Tris缓冲液71个孔，而基于磷酸盐的缓冲液73个孔)。来自用基于Tris缓冲液中和的细胞裂解物的WGA产物显示等位基因脱扣率为20%。相反，来自用基于磷酸盐的缓冲液中和的细胞裂解物的WGA产物的等位基因脱扣率降低至4%(参见表1)。[0128]表1
[0129]
【权利要求】
1.一种从细胞制备用于扩增的DNA的方法，包括: 制备裂解混合物，所述裂解混合物包含:包含含有DNA的细胞的样品、寡核苷酸和裂解缓冲溶液；以及 将所述混合物孵育高至30分钟，从而裂解所述混合物中的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括: 在鮮育后向所述混合物中加入中和溶液； 将中和的混合物加热小于2分钟，使中和的混合物中的DNA变性；以及 冷却所述中和的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述混合物中所述寡核苷酸的浓度为10 μ M-100 μ Mo
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述裂解缓冲溶液包含碱和还原剂。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述裂解缓冲溶液不包含螯合剂。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，将所述裂解混合物于20°C-35°C孵育。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，将所述裂解混合物孵育高至3分`钟。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中，所述中和溶液包含磷酸盐和螯合剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述螯合剂为二价离子螯合剂。
10.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中，将所述中和的混合物加热包括将所述混合物于80°C _95°C加热小于2分钟。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，所述中和的混合物的总体积为小于 4 μ L0
12.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，所述中和的混合物的总体积为小于或大约I μ L0
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括涡旋。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸为寡核苷酸引物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物为随机寡核苷酸引物。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，进一步包括在孵育所述裂解混合物后将寡核苷酸引物加入到所述混合物中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述寡核苷酸和所述寡核苷酸引物不同。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述寡核苷酸和所述寡核苷酸引物相同。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中，加入到裂解的混合物中的额外的寡核苷酸引物的浓度为100 μ Μ-400 μ Μ。
20.一种从细胞制备用于高通量全基因组扩增的DNA的方法，包括: 获得包含含有DNA的细胞的样品； 将所述样品等分为至少300份子样品，其中所述子样品各包含平均少于约一个含有DNA的细胞；向各子样品中加入:寡核苷酸和裂解缓冲溶液； 将含有所述寡核苷酸和裂解缓冲溶液的子样品孵育高至30分钟，从而裂解所述细胞； 向所述裂解的子样品中加入中和溶液和足以扩增DNA的量的寡核苷酸引物； 将中和的子样品加热小于2分钟从而使中和的子样品中的DNA变性；以及 冷却所述中和的子样品。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物为随机寡核苷酸引物。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物的量为至少ΙΟΟμΜ。
23.根据权利要求20所述的方法，进一步包括对中和的子样品进行全基因组扩增。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述裂解的子样品的反应体积小于进行全基因组扩增的反应体积的30%。
25.—种扩增遗传物质的方法，包括: 制备混合物，所述混合物包含:来自高至100个细胞的遗传物质、寡核苷酸引物、聚合酶、dNTP、盐混合物；以及 将所述混合物孵育使得进行扩增反应，其中，所述孵育不包括热变性步骤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述遗传物质来自单细胞。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中，所述遗传物质为至少每个细胞一条染色体。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中，所述遗传物质获得自来自包含母体细胞和胎儿细胞的混合物的生物样品的细胞。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中，所述聚合酶为热稳定聚合酶。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中，所述聚合酶具有链置换活性。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中，所述盐混合物包含=Tris-HCl；NaCl 或 KCl ;MgCl2 或 MnCl2 ;和(NH4)2SO40
32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中，所述混合物进一步包含浓度为至少500个细胞/ μ I的红细胞。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的方法，其中，所述混合物进一步包含裂解缓冲溶液和中和溶液。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述裂解缓冲溶液包含碱和还原剂。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述裂解缓冲溶液基本上由碱和还原剂组成。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中，所述中和溶液包含磷酸盐和螯合剂。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其中，所述遗传物质根据权利要求1至24中任一项所述的方法制备。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物为随机寡核苷酸。
39.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中，至少一部分寡核苷酸或寡核苷酸引物为SpC3-N9引物，其中N为任意核苷酸，并且其中SpC3为三碳分子。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中，至少一部分寡核苷酸或寡核苷酸引物为N-SpC3-N9引物，其中N为任意核苷酸，并且其中SpC3为三碳分子。
41.根据权利要求16至19或25至40中任一项所述的方法，其中，至少一部分寡核苷酸引物包含修饰的碱基配对组合。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述修饰的碱基配对组合为2，6-二氨基嘌呤和5- (1-丙炔基)_2’-脱氧尿苷(DAP/pdU)。
43.根据权利要求25至42中任一项所述的方法，其中，所述混合物进一步包含BSA、IPP和TIPP中的至少一种。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述混合物进一步包含BSA。
45.根据权利要求25至44中任一项所述的方法，其中，所述混合物的总体积为小于4 μ L0
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述混合物的总体积为小于Iμ L0
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中，将所述混合物于4°C_50°C孵育。
48.根据权利要求24至47中任一项所述的方法，其中，所述扩增反应为将所述混合物在等温条件下孵育至少30分钟。
49.根据权利要求25至48中任一项所述的方法，进一步包括在扩增孵育后将所述混合物加热以灭活所述聚合酶。
50.根据权利要求2 5至49中任一项所述的方法，进一步包括进行基因座脱扣(LDO)率分析。
51.根据权利要求25至50中任一项所述的方法，进一步包括进行等位基因脱扣(ADO)率分析。
52.根据权利要求25至51中任一项所述的方法，其中，除了细胞的裂解外，对遗传物质不进彳了 DNA提取。
53.根据权利要求25至52中任一项所述的方法，其中，已经进行了裂解，并且其中所述遗传扩增在进行裂解的位置进行。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述位置为板上的微孔。
55.根据权利要求25至54中任一项所述的方法，进一步包括将遗传扩增的产物分为至少两份等分试样。
56.根据权利要求55所述的方法，进一步包括对至少一份所述等分试样进行测试以鉴定胎儿细胞。
57.根据权利要求55或56所述的方法，进一步包括对至少一份所述等分试样进行测试以鉴定遗传变异。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，进一步包括对至少一份所述等分试样进行第二轮遗传扩增。
59.根据权利要求58所述的方法，进一步包括将所述第二轮遗传扩增的产物分为至少两份子样品。
60.根据权利要求59所述的方法，进一步包括对来自所述第二轮遗传扩增的至少一份子样品进行测试以鉴定胎儿细胞。
61.根据权利要求59或60所述的方法，进一步包括对来自所述第二轮遗传扩增的至少一份子样品进行测试以鉴定遗传变异。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的方法，进一步包括: 将被鉴定为包含胎儿等位基因的子样品合并；以及对所述合并的子样品进行测试以鉴定遗传变异。
63.根据权利要求56所述的方法，进一步包括: 将来自被鉴定为包含胎儿等位基因的至少两个细胞的剩余等分试样合并；以及 对合并的等分试样进行第二轮遗传扩增。
64.根据权利要求25所述的方法，进一步包括: 将所述遗传扩增的产物或其一部分与另一种遗传扩增的产物或其一部分合并；并且 对所述合并的产物进行第二轮遗传扩增。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，少于50%的来自一种或两种遗传扩增的产物用于进行第二轮遗传扩增。
66.根据权利要求25至65中任一项所述的方法，其中，来自单细胞的遗传物质获得自第一轮遗传扩增产生的样品。
67.一种进行阵列比较基因组杂交(阵列CGH)的方法，包括: 根据权利要求25至66中任一项所述的方法获得来自单细胞遗传扩增的产物；并且 对所述产物进行阵列CGH。
68.根据权利要求67所述的方法，进一步包括在进行阵列CGH之前，将至少5个单细胞遗传扩增的产物合并。
69.根据权利要求67或68所述的方法，其中，进行所述阵列CGH以鉴定遗传变异。
70.根据权利要求69所述的方法，其中，所述遗传变异为拷贝数变异(CNV)。
71.—种鉴定遗传变异的方`法,包括: 根据权利要求25至66中任一项所述的方法获得来自单细胞遗传扩增的产物； 对所述产物进行测序反应；以及 对测序的产物进行分析以鉴定遗传变异。
72.根据权利要求71所述的方法，进一步包括在进行测序反应前将至少5个单细胞遗传扩增的产物合并。
73.一种溶液，包含:含有单个有核细胞的生物溶液、加入的碱和加入的还原剂。
74.根据权利要求73所述的溶液，进一步包含随机寡核苷酸。
75.一种用于等温全基因组扩增的组合物，其包含:碱、还原剂和螯合剂。
76.一种用于等温全基因组扩增的组合物，基本上由碱和螯合剂组成。
77.一种用于等温全基因组扩增的组合物，其包含:根据权利要求73所述的溶液、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP和根据权利要求75或76所述的组合物。
78.一种用于在全基因组扩增中降低模板非依赖性聚合的组合物，其包含: 寡核苷酸引物，其中至少一部分所述寡核苷酸引物包含C3间隔区； 聚合酶；
dNTP ;和
盐混合物。
79.根据权利要求78所述的组合物，其中，至少一部分寡核苷酸引物为SpC3-N9引物，其中N为任意核苷酸，并且其中SpC3为三碳分子。
80.根据权利要求78所述的组合物，其中，至少一部分寡核苷酸引物为N-SpC3-N9引物，其中N为任意核苷酸，并且其中SpC3为三碳分子。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的组合物，其中，至少一部分寡核苷酸引物包含修饰的碱基配对组合。
82.根据权利要求81所述的组合物，其中，所述修饰的碱基配对组合为2，6-二氨基嘌呤和5- (1-丙炔基)_2’-脱氧尿苷(DAP/pdU)。
83.根据权利要求78至82中任一项所述的组合物，其中，所述盐混合物包含:Tris-HCl ；NaC l 或 KCl ；MgCl2 或 MnCl2 ;和(NH4) 2S04。
【文档编号】C12Q1/68GK103687961SQ201280027423
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年5月4日 优先权日:2011年5月6日
【发明者】张海川, 姚祖旭, K·冈宁 申请人:赛卢拉有限公司