骨和软骨的自体人成熟多能性极小胚胎样(hvsel)干细胞的细胞再生的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于修复或再生骨软骨组织的方法和组合物。所述方法和组合物提供有效量的足以再生或修复骨软骨组织的分离的可分化的人极小胚胎样干细胞(hVSELs)。所述组合物可直接用于组织给药或全身给药。
【专利说明】骨和软骨的自体人成熟多能性极小胚胎样(HVSEL)干细胞的细胞再生
[0001]政府资金声明
本发明在政府支持下，由国家健康中心(National Institutes of Health)给予的拨款号AR056893和DK082481项下的资助完成。政府在本发明中具有某些权利。
[0002]相关申请的交叉参考
本申请要求2011年4月8日提交的美国申请号61/473，420的优先权，该申请通过引用全文结合到本发明中。
发明领域
[0003]本发明涉及包含极小胚胎样(VSEL)干细胞的组合物以及所述组合物在人体中治疗骨和软骨疾病的用途。
[0004]发明背景
成熟人VSELs是骨髓中常驻的小的多能干细胞群，其与组织的正常更新和再生相关。hVSELs 代表性地是 SSEA-4+/0ct-4 +/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45_，其表达多能标记物(Oct-4和Nanog),并能在体内分化为所有三种胚系(germ lineages)的细胞,包括成骨细胞样细胞。
[0005]已表明在心肌梗塞的动物模型以及人心肌梗塞和中风患者中，在对损伤和压力的响应下其循环水平大大增加。VSELs也显示出在体内修复心脏组织中的有效性。另外，发现VSELs能拯救辐射照射后的免疫系统。这表明压力促进VSELs从BM中释放，使得这些细胞运行到损伤部位，在那里它们通过再生被损伤的组织而促进损伤组织的恢复。
[0006]不同于其它成熟干细胞(MSCs，iPSCs)，人VSELs (hVSELs)可由于其多能的特性而用于广泛的治疗应用中。
[0007]骨骼是一种硬的结缔组织，其由嵌入矿化的基底物质的基质中的细胞和胶原纤维组成。将所述纤维用一种类似于羟磷灰石的磷酸钙形式以及与大量的碳酸盐、枸橼酸钠和镁盐浸溃；以重量计，其由75%无机物和25%有机物组成。骨修复和再生过程中的缺陷与数种人的疾病和病症的发展有关联，例如骨质疏松症和成骨不全症。骨修复机制的失败也与临床整形外科手术中的明显并发症相关，例如，骨折后纤维骨不连合、移植界面失败和大型同种异体移植失败。骨再建技术，例如用于重建因外伤、癌症手术或发育差错而出现的缺陷，也将通过促进骨修复的新方法得以改善。目前所用的重建方法，如采用自体骨移植或者附有软组织和血管的骨移植，都与成本高和难度大的显著弊端相关。例如，收集有用量的自体骨质并不容易实现，并且甚至自体移植经常也会被感染或受到再吸收问题。
[0008]甲状旁腺激素(PTH)通过增加可得到的供生长板扩张和骨折愈伤组织形成的间充质干细胞(MSC)的蓄积,刺激正常骨中和骨创伤和骨折的部位处的新的成骨细胞。重要的是，PTH可刺激老化过程中成骨细胞的祖细胞以维持骨密度，而动物研究表明年长动物成骨细胞形成中诱发的增加比年幼动物更多。已表明PTH 1-84和PTH 1-34两者在各种动物模型和人体中，都比其它已确立的疗法对骨质具有更有效的合成代谢作用。PTH的功效起因于增加骨中MSC蓄积以刺激新的成骨细胞形成而增加骨密度的能力，因此干细胞疗法在短期内刺激新骨形成方面可比PTH更有效，同时没有高血钙症的产生。
[0009]极小胚胎样(“VSEL”)干细胞分化为成骨细胞并修复骨损伤的潜能具有重大意义。已进行了研究来检测hVSELs促进重症结合性免疫缺陷(SCID)小鼠中颅面骨缺陷内骨质形成的能力。这些研究表明人VSELs ( “hVSELs”)能够在体内分化为成骨细胞并再生骨组织。检测自体VSELs促进人颅面骨骼中骨重建的能力的研究已有描述，该研究检测hVSELs在人体内的功效和安全性，并为进一步开发这些多能干细胞以治疗骨缺陷和骨损失提供基础。
[0010]发明概述 根据一方面，本发明提供一种处理骨软骨组织的损害或损伤的方法，其包括给予该组织有效量的包含自体极小胚胎样干细胞(VSELs)的组合物,其中所述VSELs分化以修复或再生所述骨软骨组织。
[0011]根据本发明，使VSELs与人体组织接触以修复或再生骨软骨组织，特别是骨和软骨。已描述了动员、收集和纯化VSELs的方法。在某些实施方案中，将如此得到的VSELs直接给予待治疗的骨软骨组织。在其它实施方案中，将VSELs掺入可具有生物可降解的基质或支架中。在某些实施方案中，选择基质以诱发VSELs对所要求的组织类型的分化。在某些实施方案中，将VSELs与促进向所要求组织的类型分化的药物或生长因子一起给药。在某些实施方案中，生长因子是一种骨形态形成蛋白质(BMP)。
[0012]在某些实施方案中，所述方法涉及在组合物中提供VSELs，所述组合物用于填充或覆盖骨软骨组织中的缺陷。组合物中所用的VSELs数目可能与缺陷的体积或表面积有关。在本发明的实施方案中，所述组合物每mm3包含约20-约500，000 VSELs。在另一实施方案中，所述组合物每mm3包含约40-约4，000 VSELs。在本发明的一实施方案中,所述组合物每mm2包含约10-约100，000 VSELs。在另一实施方案中，所述组合物每mm2包含约25-约
500VSELs。
[0013]在某些实施方案中，VSELs在一种包含其它有核细胞的组合物中提供。在某些这样的实施方案中，所述组合物的细胞为至少约50% VSELs。在其它实施方案中，组合物的至少约70%的细胞是VSELs。在另外的实施方案中，组合物的至少约90%或至少约95%的细胞是 VSELs。
[0014]VSELs可以是自体的、异体的或设计的。在本发明的一实施方案中，使用该方法治疗或修复物理损伤，包括但不限于修补骨折、修复泪软骨(cartilage tears)等。在其它实施方案中，本发明用于再生组织或生成新的组织。非限定性实例包括关节炎或一般磨损损害的软骨恢复的修复，和在原位产生新骨，例如修复脊柱或头盖缺陷。在某些实施方案中，使用该方法促进人工关节与骨骼骨的粘附。所述方法可用于治疗骨关节炎、骨质疏松症或成骨不全症。
[0015]本发明还提供一种组合物，其包含有效量的足以再生或修复骨软骨组织的VSELs。在某些实施方案中，所述干细胞组合物包含每mm3约20-约500，000的VSELs，或者每mm3约40-约4，000的VSELs。在某些实施方案中，所述干细胞组合物包含每mm2约10-约100，000的VSELs，或者每mm2约15-约500的VSELs。所述干细胞组合物可包含其它有核细胞。在某些实施方案中，为VSELs的细胞的比例为至少约50%，或至少约70%，或至少约90%或者至少约95%。
[0016]根据本发明，包含VSELs的组合物可进一步含有可生物降解性的基质或支架。在某些实施方案中，选择基质以促进VSELs的分化。在某些实施方案中，所述组合物包含一或多种促进分化的药物或生长因子，包括但不限于骨形态形成蛋白质(BMPs)。
[0017]在一实施方案中，组合物的VSELs可分化为骨细胞。在另一实施方案中，组合物的VSELs可分化为软骨细胞。
[0018]附图简述
图1显示由人VSEL细胞移植进入关键尺度缺陷所引起的μ CT和骨体积分数。组织的μ CT分析通过SCID小鼠中的人VSELs产生。(A).移植明胶基Gelfoam海绵或人VSELs之后μ CT骨质形成的代表性图像(箭头)。(B)从三名捐赠者之一的η=10的移植物中得到的定量的骨体积分数。观察到与对照细胞(人外周血CD34+单核细胞(捐赠者3))的对照组(仅含载体-阴性对照)相比，骨形成增加。对照组的显著性差异(*) Ρ〈0.01。
[0019]图2显示人VSEL细胞在颅盖缺陷中形成骨质能力的组织学考察。将小鼠颅盖缺陷用含有载体(Α，Ε)、人CD34+细胞(B，F)或人VSEL细胞(C，G -捐赠者I或D -捐赠者2)的明胶海绵(Gelfoam)载体填充。在3个月时，收集颅盖缺陷、脱钙，然后进行苏木精和曙红染色。数据表明人VSEL细胞在人源的颅盖缺陷内能生成骨组织(参见图4)。条=100微米。
[0020]图3显示Masson’ s三色染色呈现的hVSELs诱发颅盖缺陷的矿化作用。对来自VSELs处理的小鼠的颅盖缺陷的分析表明得到的骨组织的矿化作用。骨胶原染为蓝色，骨中未矿化或“骨样接缝”的有机基质成分染为红色。
[0021]图4显示局部移植人VSEL细胞后SCID小鼠中形成的骨质内的人HLA的免疫组织化学。与泛人HLA抗体(D，E，F)或同种型相配的对照物(A，B，C)培养以及用DAPI复染确定核后，对骨/骨髓界面成像。进行骨/骨髓界面(A，D)的鉴别干涉对比(DIC)成像、检测人HLA (B, E)的免疫荧光(IF)以及DIC和免疫组织化学叠加成像。白箭头表明成骨细胞。条=5微米。
[0022]图5显示VSEL产生的骨组织中的上皮细胞具有人源特性。内皮特异性标记物⑶31的人特异性抗体，其与人特异性HLA标记物共定位，证实人VSEL细胞产生的内皮细胞进入hVSEL移植物(D，E，F)中的管状结构中，但在阴性对照组(A，B，C)中未出现。进行骨(A，D)的鉴别干涉对比(DIC)成像、检测人⑶31 (B, E)的免疫荧光(IF)以及DIC和免疫组织化学叠加成像。白箭头表明成骨细胞。条=5微米。
[0023]图6显示免疫缺乏性小鼠中hVSEL细胞产生的矿物质含量。(A)将hVSEL细胞以2，000-500, 000细胞/缺陷的剂量范围移植入颅骨缺陷中。在3个月时，对各动物组各缺陷内组织矿物质含量值进行平均。阳性对照包括表达BMP2的小鼠骨髓基质细胞，而阴性对照只由胶原载体组成。(B)为捐献者植入2，000 hVSEL颅盖缺陷内形成的组织矿物质含量的均值。*P〈0.05。
[0024]图7显示对颅骨缺陷内hVSEL细胞生成的组织的组织学评估。将代表性各显微镜玻片用H&E (顶行)和Masson’s三色(底行)染色，其中胶原和骨质呈蓝色。阳性对照包括表达BMP2的小鼠骨髓基质细胞(未显示)，阴性对照(neg.对照)仅由胶原载体独自组成。组织学结构在20X (嵌件(inserts))和40x放大率下呈现。注意到阴性对照组中留存有胶原载体基质，并且缺乏炎症细胞渗出物。在2，OOO hVSEL组中呈现含有骨髓空间的板层骨(箭头)。条=100微米。
[0025]图8显示hVSEL细胞生成的组织源于人体细胞。将颅盖缺陷内hVSEL细胞形成的组织用荧光人特异性泛-人白细胞抗原(HLA)免疫染色，然后与抗细胞核着色剂(antinuclear stain) (DAPI)的图像和鉴别干涉对比(DIC)图像合并。(A)阴性对照是仅移植介质的小鼠中血管的纵切面，表明缺少人HLA着色。(B-D)用人VSEL细胞注射的小鼠中的血管的纵切面表明由细胞质人HLA着色。组织成像在40 X下呈现，条=100微米。
[0026]图9显示小鼠血清中存在的人骨钙蛋白。显示的是每缺陷部位未植入(阴性对照)、仅植入载体(仅有海绵)、植入表达BMP的小鼠骨髓基质细胞或者植入2，000-500，000hVSEL细胞的动物血浆(3个月)中所呈现的完整人骨钙蛋白的循环水平。将骨钙蛋白水平以标准化为所有动物/移植组的针对总血清蛋白的平均值和S.D.呈现。与阴性对照相比*Ρ〈0.05。
[0027]图10显示在实验动物血中发现人体细胞。使用人特异性定量实时PCR测定所选小鼠组织(脾脏、股骨、肝右叶和全血)内存在的人体细胞。将纯小鼠骨髓用作阴性对照，将人骨髓成核细胞用作阳性对照。在2，000 hVSEL细胞移植的任何动物的脾脏、股骨和肝脏中均未观察到人DNA。检测动物外周血中的人特异性与阴性对照相比*Ρ〈0.05。 [0028]图11显示hVSEL细胞生成的软骨组织源于人体细胞。将hVSEL细胞形成的组织用荧光人特异性泛-人白细胞抗原(HLA)免疫染色，然后与II型胶原(Co II)的图像和鉴别干涉对比(DIC)图像合并。
[0029]发明详述
本发明提供在患者中治疗或再生骨软骨组织的方法。所述方法包括得到一种自体极小胚胎样干细胞(VSELs)群，然后给予细胞以治疗或再生骨软骨组织或者生成新组织。VSELs细胞可从骨髓中得到，或者从血中动员和收集得到。给药前，一般通过富集或纯化制备VSELs,并可将其结合至支持基质中。在某些实施方案中，本发明的VSEL制备物还包括一或多种生长因子，包括但不限于骨形成因子或蛋白(BMPs)。
[0030]根据本发明，VSELs的制备物可用于治疗或再生结缔组织，包括骨和软骨。软骨可以是弹性软骨、透明软骨或纤维软骨。在某些实施方案中，VSELs可用于修复关节软骨(例如骨关节炎造成的)。在另一些实施方案中，VSELs用于治疗退变性椎间盘疾病。本发明的VSEL制备物还可用于生成新骨和软骨组织，用于例如颅面修复中。
[0031]本发明提供的实验结果表明人VSEL细胞能在颅盖缺陷内生成骨质结构。生成的骨质造成人成骨细胞围绕的厚皮质结构，所述成骨细胞在收集时(3个月)主要具有静止或衬细胞表型。可见大量骨细胞嵌于皮质结构中，于Masons三色染色中观察到皮质组织的厚层。为验证所形成的组织源于人VSEL细胞，对带有人特异性泛人白细胞抗原抗体的组织进行染色。仅有从植入人VSEL细胞的动物中分离的组织呈现出骨髓染色，表明细胞源于人供体的细胞。也将纯化的和富集的hVSEL移植物的组织切片用对人骨钙蛋白(一种特异性成熟成骨细胞的标记物)特异性的抗体进行染色。
[0032]每次移植植入200、2，000、10，000 VSEL细胞能产生明显的骨填充。特别是，每次移植大量VSEL细胞不一定引起更快或更完全的再生。例如，与移植10，000或30，000 VSEL细胞的缺陷相比，更多的骨组织生成于移植2，000细胞/缺陷的动物中。[0033]本文所用的术语“给予”及其各种语法形式指给或应用。本文所用的术语“给药”包括体内给药以及直接给予离体组织。一般地，可将组合物以剂量单位制剂或者经胃肠外全身给予或者经局部给药，所述剂量单位制剂包含所要求的常规无毒性药学上可接受的载体、辅助剂和介质，或者可将组合物通过以下方式定位给药，包括但不限于注射、植入、移植、局部施用或者胃肠外给药。本文所用的术语“胃肠外”或“非肠道”指通过注射途径引入体内(即注射给药)，包括但不限于输注技术。
[0034]本文所用术语“自体的”指起源于相同的个体。
[0035]术语“细胞分化”指当细胞由一种非特定状态发展成为成熟或特异性的细胞类型时，细胞中出现的形态学和生理学中的定量变化。
[0036]本文所用术语“损害”指以损害其价值、用途或正常功能的方式引起某事物的物理伤害。
[0037]本文所用术语“可分化的”指进行细胞分化的能力。
[0038]术语“损伤”指由药物或外力引起个体机体结构或功能的损伤或损害，其可以是物理的或化学的。
[0039]本文所用术语“分开的”指诸如但不限于细胞、核酸、肽、多肽或蛋白质的物质，其为(I)当其在天然存在的环境中被发现时，基本上或大体上不含有正常的陪伴成分或者与其相互作用的成分。本文所用术语“基本上不含”或“大体上不含”指相当或明显地不含，或者约超过70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%，或者超过约99%不含。所述分开的物质任选包含随自然环境中物质未发现的物质；或者(2)如果该物质处于其自然环境，通过仔细考虑的人为干涉，可将该物质合成性(非天然)改变为非自然环境中发现的物质的组合物。这种产生合成材料的改变可在来自其天然状态内的物质上进行或从其天然状态除去。
[0040]本文所用术语“多能的”指细胞变成各种不同类型细胞的能力。
[0041]本文所用术语“成骨细胞”指当位于所有的骨表面附近和骨髓内的骨原细胞或间充质细胞，在生长因子影响下分化时出现的细胞。承担骨基质合成的成骨细胞分泌一种富含胶原的基质，其对羟磷灰石和其它晶体的后期矿化是必不可少的。胶原索(collagenstrands)形成类骨质:骨基质的螺旋纤维。成骨细胞引起钙盐和磷从血中沉淀，其与新形成的类骨质结合以矿化骨组织。一旦成骨细胞陷于它们分泌的基质中，它们即变成骨细胞。从最小至最后的分化，骨细胞系为(i)集落生成单位纤维原细胞(CFU-F) ；(ii)间充质干细胞/骨髓基质细胞(MSC) ； (3)成骨细胞；(4)骨细胞；
术语“骨生成”意指源于骨形成细胞或骨感受态细胞(osteocompetent cells)的新骨的形成。
[0042]成骨不全症(OI)指一组遗传性结缔组织疾病，其特征为骨和软结缔组织脆弱(Byers & Steiner (1992) Annu.Rev.Med.43: 269 289; Prockop (1990) J.Biol.Chem.265: 15349-15352)。男性和女性同样地受影响，目前估计总发病率为每5，000-14，000名活婴中有I名患病。听力损失、牙质生成发育不全(imperfecta)、呼吸功能不全、严重脊柱侧凸和肺气肿仅仅是与一或多种01相关的一些病症。
[0043]术语“骨质疏松症”指特征在于骨质减少和骨折的一类多样化的疾病。临床上，可将骨质疏松症分为I型和II型。I型骨质疏松症主要出现在中年妇女中，且与更年期绝经的雌激素缺失有关，而II型骨质疏松症与年龄增长有关。[0044]本文所用术语“多能性的”指细胞在体内变成各种细胞类型的能力。
[0045]术语“干细胞”指具有高增殖性潜能的未分化的细胞，其具有自我更新的能力，其能产生子细胞，子细胞可经历终末分化，成为一种以上的独特的细胞表型。
[0046]在某些实施方案中，可将本发明所述的先进的组合物用赋形剂、载体或介质(包括但不限于溶剂)配制成制剂。本文所用术语“赋形剂”、“载体”或“介质”指适于将本文所述的自体干细胞产物配制成制剂并给药的载体物质。本文所用的载体和介质包括无毒且不与其它组分相互作用的本领域已知的任何这类物质。本文所用词组“药学上可接受的载体”指可用于将所述本发明的组合物配制成制剂和给药的任何几乎无毒的载体，其中所述本发明的自体干细胞产物应能保持稳定和生物可用性。药学上可接受的载体必须具有足够高的纯度并且具有足够低的毒性，以使得其适于给予要治疗的哺乳动物。它还应保持活性药物的稳定性和生物利用度。所述药学上可接受的载体可以是液体或固体，并在与给定组合物的活性成分和其它成分混合时，可根据计划的考虑的给药方式，对其进行选择以提供所要求的体积、均一性等。
[0047]本文所用术语“再生”指失去或损伤部分的复制或重建。
[0048]本文所用术语“修复”指通过天然愈合过程或人工方法恢复病态或损伤的组织。
[0049]本文所用术语“治疗有效的”指包含人极小胚胎样干细胞(VSELs)的自体干细胞产物的量，该量在给予患者后能产生治疗或有益的效果。所述治疗效果可以是治愈、降低、预防或缓解疾病或病症，或者可以具有任何其它有益的效果。选择所述物质的浓度，以发挥其治疗效果，但浓度需足够低以避免在使用范围和医师的判断范围内发生明显的副作用。自体干细胞产物的有效量可能随所治疗的生物个体的年龄和身体状况、病情的严重程度、治疗的持续时间、并行疗法的性质、输注的时机选择、采用的特定化合物、组合物或其它活性成分、利用的特定载体和类似因素而变化。
[0050]本领域技术人员通过确定能引起给定的效果强度的剂量单位(意指使用的单位)的剂量，以下称为“单位剂量”，可以确定包含人极小胚胎样干细胞(VSELs)的自体干细胞产物药物的有效量。术语“剂量-强度关系”指其中个体接受者中效果的强度与剂量相关的方式。通常指定的效果强度为最大强度的50%。将相应的剂量称为50%有效剂量或个体的ED5tlt5术语“个体”的使用是区分基于本文所用的效果强度的ED5tl与平均有效剂量，也缩写为ED5tl，其由群体中的响应数据的频率确定。本文所用的“效力”是指本发明所述组合物达到所需响应的特性，而“最大效力”指可达到的最大效果。在治疗特定疾病或病症中有效的自体干细胞产物的量将取决于疾病或病症的性质，并可通过标准的临床技术确定。(参见，例如，Goodman and Gilman’s的治疗学的药理学基础(THE PHARMACOLOGICALBASIS OF THERAPEUTICS), Joel G.Harman, Lee E.Limbird, Eds.; McGraw Hill, NewYork, 2001:医师案头参考书(THE PHYSICIAN’S DESK REFERENCE), Medical EconomicsCompany, Inc., OradelI, N.J., 1995; and DRUG FACTS AND COMPARISONS, FACTS ANDCOMPARISONS, INC., St.Louis, M0., 1993)，其各自结合到本发明中作为参考。用于本发明所述制剂中的精确剂量也将取决于给药途径和疾病或病症的严重性，并应根据医师的判断和各患者的具体情况来决定。
[0051] 本文所用的术语“治疗”或“处理”可以互换使用，以包括消除，基本抑制、减缓或逆转病症的进展，基本缓解病症的临床或美学上的症状，基本预防病症的临床或美学上症状的出现，以及防止有害的或恼人的刺激。治疗进一步指完成以下一或多种:(a)减轻疾病的严重程度；(b)限制所治疗疾病的症状特征的发展；(C)限制所治疗的疾病的症状特征的恶化；(d)限制先前患有该疾病的患者的疾病的复发；和(e)限制先前无症状的所述疾病患者的症状复发。
[0052]术语“极小胎盘样干细胞”在此也被称为“VSEL干细胞”或“VSEL”，并指某些多能性的干细胞。在某些实施方案中，VSEL干细胞(“VSELs”)是人VSELs，并可具有的特征为lin_、CD45lP CD34+。在某些实施方案中，VSELs是人VSELs，并可具有的特征为lin_、CD45lPCD133+。在某些实施方案中，VSELs是人VSELs，并可具有的特征为lirT、CD45-和CXCR4+。在某些实施方案中，VSELs是人VSELs，并可具有的特征为I in_、CD45_、CXCR4+、CD 133+和CD34+。在某些实施方案中，人VSELs表达SSEA-4、0ct-4、Rex-l和Nanog的至少一种。VSELs也可具有的特征为细胞质的狭窄边缘围绕的大核，并含有胚胎型无结构的核染色质。在某些实施方案中，VSELs具有高度的端粒末端转移酶活性。在某些实施方案中，人VSELs可具有的特征为 lirT、CD45'CXCR4+、CD133+、0ct 4+、SSEA4+和 CD34+。在某些实施方案中，人 VSELs可为较小原始性的，并可具有的特征为1^、^45-、0乂0?4+、^133_和⑶34+。在某些实施方案中，可富集人VSELs用于多能性胚胎转录因子，例如Oct-4、Sox2和Nanog。在某些实施方案中，人 VSELs 可具有的直径为 4-5 μ m, 4-6 μ m, 4-7 μ m, 5-6 μ m, 5-8 μ m, 6-9 μπι 或7-10 μπι。可收集根据本发明给予的VSELs，并富集或纯化和直接使用，或者冷冻以备后来使用。根据本发明可给予自体或同种异体的VSELs。进一步地，VSELs可设计制备。[0053]VSELs可以通过任何方法收集和纯化。W0/2011/069117描述一种使用基于体积分离从外周血中分离干细胞群的方法。将新鲜单采细胞(apheresed cells)用IX BD Pharm裂解缓冲液裂解，以约1:10的比例(体积/体积)除去红血细胞。洗涤后，将细胞计数，然后以I X IO8细胞/ml的浓度，将2-2.5 X 101°个全部的有核细胞加载到ELUTRA?细胞分离系统(CaridianBCT)上。然后在不同的流速下，将细胞收集到装有900 ml PBS + 0.5% HSA介质的各袋中。典型地，在2400 rpm的离心速度下收集6个部分。最后，将所有部分的细胞转移到试管中，并在600 X g下旋转减速(spun down) 15分钟。各部分的体积特征通过评估SSC和FSC确认。如其中所公开的那样，部分2 (50 mL/min)高度富集VSELs，并可用于为临床应用提供VSELs群。可将该程序应用于其它设备。得到的VSELs群可通过FACS进一步纯化。
[0054]为检测人VSELs在骨损伤部位形成成骨细胞并加快骨损伤愈合的效用，使用单采和分离步骤从志愿人中分离VSELs，然后在SCID小鼠的颅盖缺陷模型中，检测hVSELs愈合骨骼的再生性能。
[0055]使用明胶海绵(Gelfoam ? )( 一种FDA批准的支架(或基质))，将hVSELs施用到SCID小鼠的颅骨缺陷中的骨上，以在骨损伤部位形成成骨细胞和促进骨损伤的愈合。将VSELs (从三个不同捐赠人单采得到并经FACS分离)施用于受伤部位时形成新骨，其通过μ CT扫描测量密度进行评估。组织学分析表明hVSELs显示骨生成、明显的新骨形成、完整的皮质样结构、骨小梁密度增厚和骨髓形成。最重要的是，新骨组织源于hVSEL，因为使用人特异性HLA抗体的骨组织的免疫组织化学显示出骨髓中和与矿化基质相邻的成骨样细胞中的丰富人HLA标记。以下所述的研究提供hVSELs在体内分化为成骨细胞并产生新骨组织的能力，和具有修复骨损伤及治疗骨质疏松潜能的第一个证据。它们还提供在人体中研究的基础，第一次测试自体人VSELs促进人颅面骨和骨质疏松症中骨重塑的能力。
[0056]根据本发明，给予治疗有效量的VSELs。在某些实施方案中，要植入的VSELs的量取决于所给予的组合物的量。例如，将在3x3 mm胶原海绵内范围为200-500,000 VSELs的细胞数目植入到3 mm直径的颅盖缺陷内(近似体积=1.0-5.0 mm3)，然后产生矿化组织。在某些实施方案中，可将本发明的组合物中原位给予的VSELs数目以每单位体积表达。在本发明的一实施方案中，给予至少约20 VSELs/mm3。在其它实施方案中，给予每mm3至少40，至少100，至少200，至少400，至少1000，至少2000，至少5000，至少10，000，至少50，000,至少100，000或以上的VSELs。在本发明的某些实施方案中，每mm3 VSELs的范围为约 20-约 500，000，或约 40-约 4000，或约 20-约 100，或约 100-约 400，或约 400-约 1000，或约 I, 000-约 5，000，或约 5，000-约 50，000 VSELs。
[0057]在某些实施方案中，可将本发明的组合物中原位给予的VSELs数目以每单位面积表达。在本发明的一实施方案中，给予至少约15 VSELs/mm2。在其它实施方案中，给予每mm2至少25，至少100，至少250，至少500，至少1000，至少2000，至少5000，至少10，000或者至少50，000 VSELs。在某些实施方案中，每mm2 VSELs的范围为约10-约100，000，或约25-约500，或约10-约40，或约40-约100，或约100-约500，或约500-约2，500，或约2，500-约 10，000， 或约 10，000-约 100，000。
[0058]在本发明的某些实施方案中，给予骨软骨缺陷的VSELs的数目为约200-约1000。在某些实施方案中，给予的VSELs的数目为约1，000-约5，000。在某些实施方案中，给予的VSELs的数目为约5，000-约20，000。
[0059]可植入的组合物可包含不同纯度的VSELs。在一实施方案中，VSELs为至少50%的纯度(即代表至少50%的有核细胞)。在另一实施方案中，VSELs为至少75%，至少85%，至少90%或至少95%的纯度。在另一实施方案中，VSELs为50%_80%，或者80%_90%，或者90%_95%或者95%-99%的纯度。
[0060]在某些实施方案中，本发明的方法和组合物涉及适用于成骨或软骨生长(chondrogenic growt)的基质。在骨中，细胞外基质(ECM)主要由被称为类骨质的有机相和矿物相组成,所述有机相构成了大约20%的骨质。骨的有机部分由90%以上的I型胶原、其它较少的胶原(如III型和V型)和5%的非胶原蛋白组成。骨中的非胶原蛋白包括骨钙蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、粘附蛋白，如纤连蛋白和玻连蛋白以及蛋白聚糖，如多功能蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和透明质酸。骨的矿物相由羟基磷灰石、磷酸钙化合物组成。骨基质中还螯合有生长因子，用作可溶性感应信号的贮库(reservoir)发挥作用，如骨形态发生蛋白(BMP)。
[0061]在本发明的一实施方案中，使用包含分散在其内部或在其表面上的VSELs的基质。所述基质任选包括一种将细胞保持在受试者器官表面位置上的粘合剂。在某些实施方案中，基质是一种可喷射的、可涂抹的或可层叠的(Iayerable)纤维蛋白胶(或纤维蛋白密封剂)，其包括纤维蛋白原和凝血酶。两个实例是Tisseel和DuraSeal。可对这样的胶或密封剂修饰以适应其密度和降解的特性。
[0062]在某些实施方案中，基质是一种由可生物降解的聚合物构成的结构。在某些实施方案中，基质是一种聚合物膜，其可自由停留或涂布在支持体上。在一实施方案中，聚合物是聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。在某些实施方案中，乳酸-乙醇酸的比例是50:50、65:35或75:25。在另一实施方案中，聚合物是聚交酯(PLA)。其它有用的聚合物包括但不限定为壳聚糖、甲壳质、透明质酸、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和葡糖胺聚糖。
[0063]ECM蛋白可用作骨缺陷愈合和植入物集成体(implant integration)的支架，并包括胶原蛋白(如明胶海绵(Gelfoam? ))、纤维蛋白、脱细胞基质(decellularizedmatrix)和骨涎蛋白(sialoprotein)。人工基质可用这样的蛋白质官能化,例如通过涂布或栓束(tethering)。ECM植入物的有用形式包括交联膜、海绵、凝胶、去矿化骨颗粒或小肠粘膜下层的裁片(cut pieces) 0某些非限制性实例是胶原蛋白、纤维蛋白、DCM和RGD肽。RGD是一种在许多ECM分子中发现的肽序列，包括纤连蛋白、玻连蛋白、骨涎蛋白和骨桥蛋白，并可与多种整联蛋白结合，如ανβ3、ανβ?、α 8 β 1> α ν β 8> α ν β 6> ανβ5和α IIb β 3ο (SMJl^PUShekeran et al., 201, J Biomed Mater Res Α.96(1): 261 -72.)。某些临床上可用的植骨材料是合成的硅酸盐取代的多孔羟基磷灰石(Actifuse ABX)、合成的 a-TCP (Biobase)、合成的 β -TCP (Vitoss)、合成的 β -TCP (Chronos)、加工处理的人多孔同种异体移植物(Tutoplast)和加工处理的牛轻磷灰石陶瓷(Cerabone)。
[0064]在某些实施方案中，所述方法和组合物将进一步包括成骨或软骨生长因子。这些因子包括但不限于 BMP-2 (BMB-2a)、BMP-3 (成骨素)、BMP-4 (BMP-2B)、BMP-5、BMP-6(Vgr-1),BMP-7 (0Ρ_1)、ΒΜΡ_8 (0P_2)、BMP_9 (⑶F_2)、BMP_10、BMP-11、BMP_12 (O)F-1l,CDMP-3)、BMP-13 (⑶F_6, CDMP—2)、BMP_14 (⑶F_5, CDMP-1) ,BMP-15 (⑶F—9B)、BMP_16、BMP-17、BMP-18 和 Vgr_2 (⑶F_3)。BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6 和 BMP-7 公开于美国专利 Nos.5，108，922 ；5, 013，649 ；5, 116，738 ；5, 106，748 ；5, 187，076 ;和 5，141，905中。BMP-8公开于PCT公布号W091/18098中，以及BMP-9公开于PCT公布号W093/00432中。BMP-1O公开于美国专利N0.5，637，480中，和BMP-1l公开于美国专利N0.5, 639, 638中。BMP-12和BMP-13公开 于美国专利N0.5，658，882中。BMP-15公开于美国专利N0.5，635，372中和BMP-16公开于美国专利N0.5，965，403中。BMP-17和BMP-18公开于美国专利 N0.6, 027, 917 中。其它因子包括 FGF-1、FGF-2、IFG-1、IGF-2、TGF-β K TGF-β 2,TGF-β 3和VEGF。在某些实施方案中，包括一或多种双膦酸盐(例如依替膦酸盐、氯膦酸盐、阿仑膦酸盐、帕米膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸盐(zoledronate))。
[0065]在某些实施方案中，本发明的VSEL组合物包含一或多种血液成分，包括但不限于红细胞、白细胞、单核细胞、血小板或富含血小板的血浆。
[0066]可将所述基质的结构改变成最适合将VSELs与损伤或缺陷部位接触或靠近的任何形状和尺寸。包含VSELs的基质可以是贴剂、包裹或管道的形式，并且可被构型为适于损伤或缺陷的轮廓和尺寸。在某些实施方案中，将种入VSELs的基质放置到能使得大多数VSELs直接与缺陷接触的位置处。在其它实施方案中，将VSELs放置在邻近损伤或缺陷处。
[0067]本发明提供通过给予包含VSELs的组合物治疗具有骨或软骨缺陷的人或其它哺乳动物的方法。组织缺陷包括但不限于先天性缺陷、疾病或创伤的后果或症状，或者来自外科或其它医疗手术导致的缺陷。
[0068]骨折包括其中骨破裂、折断或碎裂的损伤。骨愈合自然发生在大部分患者中。骨折一般伴随着出血和凝血、经成纤维细胞的胶原蛋白的产生以及胶原基质的矿化。随着时间的推移，产生的未成熟骨经过重塑而产生成熟的板层骨。然而，骨折修复失败(骨不连合)占所有骨折的10%。所述VSEL组合物和方法促进正常骨愈合和重塑并减少骨不连合的发生。
[0069]也可将所述VSEL的组合物和方法用于促进所需位置处的新骨形成。非限制性实例包括植入的器具和假体。根据本发明，植入的器具或假体用VSELs浸溃的材料形成或者用VSELs浸溃的材料涂覆。“浸溃的”指在其表面上和/或在其内部包含VSELs的材料。
[0070]因此，公开的VSEL组合物可用于骨骼的修复，再生和生长。非限定性的应用包括关节置换手术，不局限于髋关节置换术、膝关节置换术、肩关节置换术和踝关节置换术，骨熔接(fusion)，包括脊柱熔接，关节熔接，包括手腕、手指、脚趾和脊柱的骨的熔接，颅骨成形术，牙骨移植和植入物放置，以及疾病如癌症所致骨缺失的重建或更换。
[0071]本发明的VSEL组合物可用于治疗骨质疏松症。在本发明的某些实施方案中，将VSELs全身给药(例如静脉给药)，以使VSELs细胞进入整个骨架结构中。例如，VSELs表达CXCR4并应答CXCL12 (SDF-1)梯度，CXCL12和其它化学引诱物由骨髓基质细胞分泌。在本发明的某些实施方案中，给予至少5 X 103，或者至少104，或者至少5 X 104，或者至少105，或者至少5 X 105，或者至少IO6 VSELs0在某些实施方案中，VSELs的给药范围为约IO3-约104，或者约IO4-约105，或者约IO5-约IO6。
[0072]在本发明的一实施方案中，使用促进VSELs复位和/或粘附至骨组织的试剂。一种这样的试剂包含与VSELs结合的第一部分和与骨组织结合的第二部分。与VSELs结合的试剂包括但不限于，对VSEL标记物的特异性抗体(例如CXCR4，⑶133)。与骨结合的试剂包括但不限于，双磷酸盐类(例如阿仑膦酸盐)，其也已被用于将蛋白和MSCs靶向至骨上。在某些实施方案中，所述第一部分对表达在VSELs和其它细胞上的标记物可以是特异性的。在这样的情况下，可优选在给药前将所述试剂与纯化的VSELs—起培养。在本发明的另一实施方案中，可将一种与骨组织结合的试剂共价连接到VSEL。在这样的情况下，可在给药前将该试剂连接至任何VSEL成分。在本发明的一实施方案中，将患有骨质疏松症的患者用VSEL动员剂和促进VSELs复位和/或附着至骨组织的试剂来治疗。
[0073]关节软骨覆盖在动关节中的骨两端，以分散下面骨结构移动的力，同时提供几乎无摩擦的关节接合界面。这些特性由细胞外基质提供，所述基质由II型胶原和其它较少的胶原成分和高含量的粘蛋白聚集蛋白聚糖组成。低摩擦性能归因于关节面和滑液的特殊的分子组成，以及在装载于关节面上过程中组织液渗出的结果。关节软骨在成人损伤上具有有限的响应，主要是由于缺乏血管化和存在稠密蛋白聚糖丰富的细胞外基质。
[0074]本发明提供了一种用于软骨组织的修复、再生、重建或填充的VSEL组合物和方法。优选地，组合物附着于软骨组织(其中所述组合物被引入)并支持VSEL分化和增殖以修复所述软骨。在一实施方案中，所述组合物包含聚合物组合物，当其与VSELs和任何其它所需要的成分混合时，变为非液体(例如，凝胶)，这样使得该组合物被保持在并附着于引入部位。聚合物可以是改性的或天然的多糖，如壳聚糖、甲壳质、透明质酸、葡糖胺聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素 、硫酸皮肤素、肝素或硫酸肝素。在某些情况下，引入位点处的软骨通过刺穿、研磨或钻孔制备，以便为VSEL组合物提供空隙或位置和/或促进VSELs的植入。所述方法和组合物适于治疗软骨损伤，包括但不限于，部分厚度(部分向下至骨)或全层厚度(全部向下至骨)的损伤以及半月板撕裂。可治疗的涉及软骨变性的疾病包括但不限于，骨关节炎、类风湿关节炎、银屑病性关节炎、狼疮，痛风和莱姆病。
[0075]在某些实施方案中，使用同种异体的VSELs治疗骨软骨组织的损害或损伤。优选同种异体的VSELs用于治疗具有遗传源的骨骼病症。例如，在本发明一实施方案中，给予患者同种异体的VSELs治疗成骨不全症。该疾病的特征往往在于太少的I型胶原或质量差的I型胶原，原因是I型胶原基因之一的突变。另外，可使用患者自体的被设计在分化时表达I型胶原的VSELs。
[0076]当提供一个范围的值时，应理解的是，除非上下文中明确地指出，否则该范围最高和最低限度之间的各个居中值至下限单位的十分之一，以及任何其它规定或在该规定范围内的居中值都应包括在本发明内。可独立地被包含在较小的范围内的这些较小范围的上下限也包含在本发明中，服从于在规定的范围内的任何特别排除的极限。当所规定的范围包括一个或两个极限时，不包括这两个极限值的范围也包含在本发明内。
[0077]除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有如同本发明所属本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。虽然与本文所述类似或相同的任何方法和材料也可用于本发明的实施或试验中，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均结合到本发明中作为参考，以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。
[0078]必须注意的是，除非上下文中另外清楚地说明，本文及所附权利要求书中所用的单数形式“一”和“该”都包括复数称谓。
[0079]仅提供本申请的提交日之前公开的本文讨论的出版物内容，且各自全文结合到本发明中作为参考。此处不能被解释为承认本发明无权享有先于本发明的提前公开的这些出版物。此外，所提供的出版日期与实际出版的日期可能不同，这可能需要单独地确认。
实施例
[0080]提出下列实施例以提供给本领域普通技术人员如何进行和使用本发明的完整的公开内容和描述，但并不意味着其限定本
【发明者】认定的该发明的范围，也不意味着其表示下列实验是进行的所有或者唯一的实验。虽然一直努力确保有关所用数据(例如数量、温度等)的准确性，但应当考虑到有一些实验误差和偏差。除非另有指明，百分比为重量百分t匕，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度，和压力是或接近大气压。
[0081]实施例1.VSELs可在体内分化为成骨细胞样细胞
初步研究集中在确立小鼠VSELs分化为成骨细胞的能力上，成骨细胞是涉及骨形成的关键细胞类型。Dr.Taichman及其团队最近描述一种体内测定法，其可用于鉴定具有茎杆状活性的细胞。他们已经发现带有MSC-样活性的细胞以低密度出现在小鼠BM中，其在体内对5-氟尿嘧啶(5-FU)具有抗性并表达CXCR4 [46，47]。这些细胞特征在于FACS，并且随后发现为具有与VSELs [3-5]相同特性的Lin-Sca-1+ CD45-细胞。
[0082]为评估小鼠VSELs经历多谱系(mult1-lineage)分化的潜能，进行内髓移植研究。首先，MSCs从Co 12.3 Λ TK小鼠中获得，铺展到培养基中，然后植入SCID小鼠中，以生成其中将确立胸腺激酶组织的受区。使用该方法的基本原理是能够脱落(ablate)移植物生成的骨髓中的成骨细胞数，以清除供注射GFP标记的细胞的空间，供细胞谱系进展。作为对照，对新分离的VSELs中得到的mRNA评估成骨细胞特异性标记物Runx_2和脂肪细胞标记物PPAR Y的表达。与用I X 10_6 M地塞米松处理的成骨细胞细胞系MC3T3-E和骨髓基质细胞相比较，如果有Runx-2和PPAR Y的任何mRNA，则VSELs几乎不表达[47]。在1.5个月时，将小骨经手术暴露，并用从GFP小鼠中分离的VSELs进行注射。再经另外1.5个月后，收获移植物，通过细胞表面标志物和共聚焦显微镜测定所注射的GFP细胞的分化。对带有成骨细胞特异性标记物Runx-2和脂肪细胞标记物PPAR y的抗体的GFP表达细胞进行共定位(Co-localization)。大约一半表达Runx-2的细胞也表达GFP。类似地,接近一半表达PPAR Y的细胞是用GFP标记的。这些数据表明体内出现至少两个源于VSELs的细胞系的细胞谱系进展下降。更重要的是，VSELs能够在体内分化为成骨细胞样细胞中。
[0083]实施例2.人VSELs可在颅盖骨缺损模型中再生骨质
这些初步研究为测试人VSELs在颅盖骨缺损模型中形成骨质的效力提供研究基础。对于这些研究，NeoStem分离健康人自愿者的VSELs。将各自愿者在3日内用G-CSF (480 ug/日)处理，并抽取200 ml血液样本，经历单采血液成分术和FACS以分离VSELs。分离纯度为~70%或~90%的VSELs以及用作阴性细胞对照的CD34+细胞(VSELs是CD34-)，并装载于胶原Gelfoam?无菌海绵中作为载体。
[0084]将5 周龄雌性 SCID 小鼠(N:NIH-bg-nu-xid ；Charles River Labs)随机分组，每组10只动物。为产生颅盖缺陷，做一线形头皮切口，抬起双侧全厚头皮(bilateralful 1-thickness flaps)。切除覆盖在颅盖骨上的骨膜，使用带有水喷雾的环锯钻头制作一个5-mm穿颅缺陷。移除去该颅盖骨片后，将VSEL细胞或对照物(阴性-仅明胶海绵(Gelfoam)或 0)34+细胞)置于缺陷内。将切口用 4-0 Chromic Gut 缝线(Ethicon/Johnson& Johnson, NJ)缝 合,然后让小鼠恢复。术后3个月，将所有小鼠处死。收集颉盖,立即固定于10%中性缓冲福尔马林中48 h，然后扫描进行μ CT分析，接着用10% EDTA溶液脱钙2-3周，用梯度乙醇脱水，然后包封于石蜡中供组织学检查。
[0085]然后在用EVS Corp., μ CT 扫描仪(London, Ontario, Canada)上，以 8.93 μ m立体像素分辨率扫描骨样本，每次扫描共计667削波(slices)。使用GEMS
件制成一组扫描的3-D重建图。用固定阈值(1，000)提取矿化的骨相、骨体积分数(BVF)、骨矿物质密度(BMD)和骨小梁数(Th.N.)。骨体积分数的代表性图像和定量在图1 A、B中给出。数据表明仅植入载体(对照)或CD34+细胞的动物不生成任何骨组织(图1A，第一小图和3和4小图，右侧缺陷和1B)。植入来自健康捐赠者I的10，000纯VSEL细胞都能刺激骨质形成(图1A，左侧第二小图)。得自捐赠者I的VSELs生成骨质的效力的剂量依赖性似乎存在，虽然这种差异未达到统计学水平(图1B)。得自志愿者2和3的VSELs所生成的骨质(图1A，左侧起第3和4小图)提供比得自捐赠者I的VSELs甚至更大的骨质填充，即使当使用较少的细胞时，其表明在hVSEL促进骨质形成的能力上存在可能的个体差异。
[0086]无细胞移植的对照明胶海绵(Gelfoam)的组织学检查导致仅有低水平的中性粒细胞和结缔组织生长(图2 A, E)。2 X IO4⑶34+细胞的移植也未显示特定的组织再生，并由疏松的有组织的结缔组织和剩余的明胶支架材料组成(图2B，F)。来自所有三个捐赠者的2，000人VSELs的植入均产生小核心区(focal areas)的类似于骨样组织的肥大细胞(图2C，D)。在较高放大率下，VSEL处理组显示有明显的新骨形成、脂肪细胞和造血骨髓的补充。骨生成的程度似乎可逆性依赖于种入的细胞数量，与10，000细胞相比，2，000 VSEL细胞表明更完整的皮质样结构、更密集的骨小梁厚度和更多的骨髓，这再一次与干细胞和可能的支持或辅助细胞之间和之中出现的复杂的交互作用相吻合。无细胞移植导致仅有低水平的中性粒细胞和结缔组织生长(图2 A, E)0 2 X IO4⑶34+细胞的移植也未显示特定的组织再生，并由疏松有组织的结缔组织和剩余的明胶支架材料组成(图2B，F)。所有三个捐赠者的2，OOO人VSELs的植入均产生小核心区的类似于骨样组织的肥大细胞(图2C，D)。在较高放大率下，该VSEL处理组显示有明显的新骨生成、脂肪细胞和造血骨髓的补充。
[0087]VSELs引起骨的矿化作用的证据在Masson’ s三色染色中可见(图3)。该染色显示胶原蛋白为蓝色，与未矿化区域(红色染色)相比，VSEL处理大大增加胶原蛋白于颅盖缺陷内的蓄积。事实上，大部分缺陷都被新形成的骨组织填充。
[0088]为确定骨组织是否源于人或小鼠来源，将切片用人白细胞抗原(HLA)的特异性抗体、人中主要组织相容性复合体(MHC)或者同种型对照物进行染色(图4)。
[0089]人HLA的免疫组织化学确定有丰富的骨髓着色。与矿化基质邻近的人HLA的成骨细胞样细胞被特别强烈地着色，而相邻含有人细胞的切片在IgG对照染色剂存在下不着色。这些数据表明移植的人VSEL细胞有助于生成新骨组织。
[0090]内皮细胞是骨形成的关键。因此，发明人评估内皮细胞是否在骨组织中形成。使用对内皮特异性标记物CD31的人特异性抗体，与人特异性HLA标记物的共定位显示人内皮细胞进入到hVSEL植入物中出现的管状结构中，但在阴性对照组中未出现(图5)。
[0091]这些结果确立 可从志愿人中分离足量的VSELs (每200 ml TNC单采血液成分术约170，000, 000细胞)以便能够用于再生疗法。确立从人血中分离VSELs的程序的研究已经公开[28]，并结合到本发明中作为参考。
[0092]此外，小鼠模型中采用2000人VSELs能形成骨质的事实(图1)表明一旦分离出扩张的细胞，诱导分化或者任何其它细胞操作都是不必要的。事实上，骨再生的研究都是采用新鲜分离的人VSELs进行的。发明人已表明VSELs在植入宿主骨髓中时可在体内分化成为成骨细胞样细胞，其可通过Runx-2的表达表明(Taichman，2010)。
[0093]最重要的是，发明人已表明hVSELs可在损伤的骨中生成新骨(图3_6)。这些是hVSEL分化的首次体内研究并且是其再生能力的首次证实。这些结果为其在再生医学中的应用，尤其是骨修复中提供支持。
[0094]最后，发明人研究提供如何最佳给予hVSELs以再生骨的相关信息。首先，明胶海绵作为一种有用的支架将所述细胞施用于骨损伤处。明胶海绵胶被FDA批准用于处理伤口和内脏器官损伤，并已广泛用于人体研究中。因此，明胶海绵应能用作一种将hVSEL施用于人骨以治疗损伤和骨质缺失的支架。
[0095]实施例3.人VSELs可在颅盖骨缺损模型中再生骨质
招募健康白种男性和女性作为VSEL细胞捐赠人，并筛查已知的疾病、使用毒品和烟草和肥胖者。单采血液成分术之前2日，使各捐献者接受每日皮下注射G-CSF (粒细胞集落刺激因子(Neupogen?, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA)) (480Kg/day),以促进骨髓中 VSEL细胞的活动化，接着将其释放至血流中。单采血液成分术经有资质的技术人员进行2-3小时。随后依次通过淘析(CaridianBCT)和CD34/CD133微珠(Miltenyi Biotec)阳性选择来富集人VSEL细胞，然后采用Moflo XDP高速细胞分选仪(Beckman Coulter)流动分选活的Lin-CD45-CD34+CD133+ VSEL细胞。最后将高纯度的VSEL细胞冰冻于PBS_5% HAS中，然后在不附任何人员统计信息下，隔夜快递发货至密歇根大学。
[0096]将5 周龄雌性 SCID 小鼠(N:NIH-bg-nu-xid ；Charles River Laboratories,Raleigh, NC)随机分为5组(n=5)，每组10-13只动物(n=10_13)。将动物用异氟烷吸入麻醉，然后从鼻骨至后头部做线形头皮切口，抬起全层头皮。使用环锯术在各头顶骨中心处制成一个3-mm穿颅缺陷，同时连续灌注Hanks’平衡的盐溶液。移除该颅盖骨片以避免下方硬脑膜和脑组织的损伤。止血后，将预先已装载或者介质或者hVSEL细胞的支架(Gelfoam?，Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI)小心放入到缺陷中，使得支架装满整个缺陷并连接到手术外围处的骨边缘上。将切口用4-0 Chromic Gut缝线(Ethicon/Johnson & Johnson,Somerville, NJ)缝合，随后小鼠在电热板上从麻醉中恢复知觉。在移植后的第16周，将所有小鼠处死。在处死时，在麻醉下完成心脏内穿刺和吸引术来收集血清。
[0097]用DMEN + 10% FBS (Invitrogen, Grand Island, NY)冲洗 C57BL/6 小鼠(Jackson Laboratory)的股骨、胚骨和肱骨，分离骨髓。在37 °C下，在改良Dexter’s培养基(MDM培养基、10% FBS、10%马血清、I μ M氢化可的松、青霉素/链霉素(LifeTechnologies, Grand Island NY.))中进行塑型粘附。过夜粘附后，除去未粘附的细胞,更换新的培养基。3周内，培养物经胰蛋白酶化扩大，产生第一和第二代细胞(P1或匕)。在感染复数(MOI) 500时移植之前24小时，将80-90%融汇处P1或P2中的BMSCs用AdCMVBMP-7转换。按以上所述(Franchesi et al., 2000, J.Cell.Biochem 78:476-86)经Cre-lox重组构建AdCMVBMP-7，并经密歇根大学Vector Core生成。 [0098]确定5组小鼠来评估人VSEL细胞再生颅面缺陷的能力。第一组用作阴性对照组，其中仅将介质和Gelfoam?置于缺陷之中。第二组用作阳性对照组，其由被设计以表达huBMP-7的AdCMVBMP-7感染的P1或P2小鼠骨髓基质细胞组成。试验组由在Gelfoam?中的从三个不同个体中分离出的20、200或2000 VSEL细胞组成。细胞的剂量通过评估(i)报导存在于骨髓中的这些骨髓人MSCs的频率得到(范围为1/10，000-1/100，000骨髓单核细胞)，和需要约2xl06人骨髓粘附细胞以愈合小鼠的3 _头盖缺陷的观察结果来达到。加Λ 2000 VSEL细胞剂量以确保发明人观察VSEL细胞响应的能力，假定仅10%的移植细胞能够参与伤口的修复。
[0099]显微计算机断层扫描(μ€Τ).收取颅盖，并立即固定于10%中性缓冲福尔马林中达 48h。然后在 EVS Corp., microCT 扫描仪(London, Ontario, Canada)上，以 8.93 μ m三维像素分辨率扫描骨样本，每次扫描共计667削波。使用GEMS MicroView.软件制作设置的3-D重建图。对关键区域(ROI)逐一评估各个缺陷，用固定阈值(600)进行骨分析，以用于提取矿化的骨相、并计算骨体积分数(BVF)、骨矿物质密度(BMD)和骨小梁数(Th.N.)。
[0100]组织学检查.MCT分析后，将骨置于10% EDTA (pH 7.4)中脱钙10日，并包埋于石蜡中。切开颅盖的纵切面部分，并用苏木精和曙红(H&E)染色，或者使用Masson’ s三色染色，并用光学显微镜分析。在某些情况下，将显微镜玻片用对人HLA抗原的抗体(抗-HLA-ABC抗体(BioLegend, San Diego, CA))染色,或者按照用产物说明书(R&D Systems)用IgG对照(Sigma)结合HRPAEC染色系统试剂盒染色，以鉴定人体细胞。
[0101]血清骨钙蛋白水平.人骨钙蛋白水平采用夹心Mid-Tact骨钙蛋白EIA(Mid-Tact Osteocalcin EIA) (Biomedical Technologies, Stoughton, MA)并使用人重组骨钙蛋白作为标准品(Biomedical Technologies)测定。这种夹心EIA对完整人骨钙蛋白和主要的(1-43)片段均具有高度特异性。为将得到的血浆中骨钙蛋白水平归一化，采用抗牛血清白蛋白标准物的RC-DC蛋白分析试剂盒(BioRad Laboratories)测定总蛋白。
[0102]A VESL的实时PCR评估
采用DNA分离试剂盒有指定组织制备基因组的DNA (DNeasy血液和组织试剂盒(DNeasy Blood and Tissue Kit) (Cat.n0.69506) ; Qiagen, Inc., Valencia, CA)。将各反应中的所有样本浓度标准化以排除假阳性结果。使用15.0 μ?的TaqMan PCR MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA),其带有 100 nM 的人 AJi/ TaqMan 探针(前-5' -CATGGTGAAACCCCGTCTCTA-3'，反-5' -GCCTCAGCCTCCCGAGTAG-3' ,TaqMan 探针-5/ -FAM-ATTAGCCGGGCGTGGTGGCG-TAMRA-3/ ) ; (Applied Biosystems)和 I Pg 分离的组织DNA (总体积30 μ?)，进行实时聚合酶链反应。加热条件为50°C下进行2 min，95°C下进行10 min，接着95°C下15秒和60°C下I min循环40次。使用序列检测系统(ABI PRISM7700; Applied Biosystems)，测定作为荧光增加的表达水平。将DNA水平表示为归一化的抗小鼠卢-腐动蛋沒(Cat.n0.4331182; Applied Biosystems)的相对复制数目(％对照)，将由纯化的cDNA片段的系列稀释液构成的标准曲线通过经典PCR克隆。针对采用包含人VSEL的log倍数稀释液的小鼠骨髓建立的标准曲线，确定数值数据。阳性和阴性对照包括非-VSEL注射的小鼠获得的组织或者直接源于VSEL中的DNA。
[0103]统计分析.将数值数据表示为平均值土标准偏差。统计分析通过Kruskal-Wallis 方差单向分析，米用 GraphPad Instat 统计程序(GraphPad Software, San Diego,CA)进行。种属差异通过Mann- Whitney U检验测定。显著性水平设为P < 0.05。
[0104]通过显微计算机断层扫描评估骨形成
评估人VSEL在小鼠颅盖缺陷内形成骨的能力。在正常健康捐赠者的G-CSF动员后，分离VSEL细胞，然后置于在测得直径为3_的左侧顶骨内生成的颅盖缺陷内。将移植的细胞(范围为2，000-500，000细胞)传递到3x3 mm Collagraft?胶原海绵中的缺陷处。阴性的细胞对照组仅由海绵构成。阳性对照组包含设计用于过表达hBMP7的小鼠骨髓基质细胞。3个月后，通过MCT评估所有的试 样。数据表明与阳性对照组中矿化组织形成相比，仅植入载体的动物(阴性对照)未产生任何骨组织。全部三组试验捐赠者的2，000-500，000 VSEL细胞的植入均刺激骨形成。矿化作用的检查表明所有缺陷都不完全闭合。尽管如此，在2，000和10，000细胞/植入组生成的样品中，观察到强健的骨形成。有趣的是，在用30，000细胞/植入物处理的动物中形成的骨并不比那些用2，000细胞/植入物处理的动物产生更明显的骨组织，而500，000细胞/植入物比30，000和2，000细胞/植入物组别产生更大的骨结构。
[0105]采用GEMS MicroView.软件，考察各样本的矿物质含量。细胞产生矿化基质的效
力似乎与所使用的细胞的剂量呈逆相关，虽然这种差异未达到统计学水平(图6A)。例如，植入2，000人VSELs的缺陷比植入10，000或30，000细胞的那些缺陷产生更多的矿化组织。有趣的是，具有30,000 hVSELs的植入产生最低的矿化组织。当颅盖缺陷中植入500，000细胞时，矿化组织形成最大，虽然未达到统计学显著的量。
[0106]如前所述，从三个独立的捐献者中收集hVSEL分离株。为评估捐赠者之间骨形成功效的任何差异，以相同的细胞剂量评价得自各捐赠者的移植物。当将2，000 hVSEL细胞/植入物生成的骨与捐赠者I和3比较时，结果表明这些组别功效相等，但两者均比捐献者2生成更多的矿化组织(图6B)。但是，捐赠者I比其他两捐赠者生成明显更多的hVSEL细胞。捐赠者1、2和3分别生成的总VSEL细胞为312KU9K和11K。此外，当将更少的细胞/植入物与捐赠者2的2，000 hVSEL细胞/植入物相比较时，形成更多的骨质，表明在hVSEL细胞功能上可能的个体差异。[0107]通过组织学分析评估骨形成.脱钙后，生成通过各缺陷的连续切片，以准备用于组织学评估。植入物材料证实具有高度的生物相容性，其特征在于炎症水平很低且无异体响应的迹象。在对照组中，胶原海绵载体基质保持，并且经H&E或Masson’s三色染色，没有类骨质或成熟板层骨可被观察到(图7)。在植入2，000-30, 000 hVSEL细胞的实验组中，在颅盖缺陷中发现包含骨髓空间的板层骨(图7B-D)。在此，缺陷处载体基质被大量再吸收，极少的剩余颗粒嵌于围绕板层骨的纤维结缔组织之中。生成的骨主要由成熟板层骨组成(图 7B-D)。
[0108]hVSEL细胞形成骨的证明.为证实形成的骨确实由植入的人细胞生成，评估两种独立的方法。首先，将切片用泛-人特异性白细胞抗原(HLA)抗体染色。仅植入介质，即不含人VSELs的小鼠未证明对人HLA有任何交叉反应性(图8A)。植入人VSEL细胞的小鼠证明在成骨细胞上和骨细胞中特异性地明显人HLA染色(图8B-D)。
[0109]为进一步证明hVSEL细胞能生成骨，评估处死时(3个月)收集的动物血浆是否存在人特殊的骨钙蛋白。在其移植物中未接受任何hVSEL细胞的动物血清中未呈现任何的人骨钙蛋白(图9)。移植了 hVSEL细胞的动物确实具有存在于其血清中的循环人骨钙蛋白。骨钙蛋白水平，其大致对应接受500，000细胞/移植物的动物的骨形成的量，具有存在于血清中的最高浓度的骨钙蛋白，而移植较少VSEL细胞的动物血中呈现出较少的骨钙蛋白。
[0110]人细胞对骨缺陷的定位采用人特定JA/程序的定量实时PCR，对人VSELs从移植部位至外周组织的迁移进行评估。评估得自脾脏、股骨、肝右叶和全血的代表性组织样本中人DNA的存在。将未移植人细胞的动物和移植小鼠骨髓的动物用作阴性对照。将混有(1:1,000)小鼠骨髓的人前列腺癌细胞系作为阳性对照。确定人特异性表达低水平出现在移植人VSEL细胞的接受动物的血中(图10)。在移植人VSEL细胞的动物的脾脏、股骨或肝脏中未见到人DNA的迹象，表明从缺陷处迁移出的VSEL细胞的水平相对较低。
[0111]实施例4.人VSELs可再生软骨
人细胞对软骨的定位。数个切片中的组织学检查表明软骨中存在人VSELs。在数个切片中，观察到编织骨带有嵌入在软骨中的回忆软骨细胞的组织。进行进一步的分析以确定这种类型的细胞是否生成能表明软骨形成的II型胶原蛋白。经hVSEL细胞形成的组织采用荧光人特异性泛-人白细胞抗原(HLA)进行免疫印迹，并对II型胶原蛋白(Co II)印迹。图11显示合并的HLA、CO II和差动干扰对比(DIC)图。
[0112]虽然通过参考本文特定的实施方案对本发明进行了描述，但本领域技术人员应该清楚的是在不背离本发明的真实精神和范围下，可进行各种改变并替换各种等同物。另外，可进行许多修饰以适应本发明的特定情况、材料、物质的组成、方法、方法的步骤。所有这些修饰都意欲涵盖在本文所附的权利要求书的范围之内。
[0113]参考文献
1.Rodgerson, D.0.and Harris, A.(2011) A Comparison of Stem Cells forTherapeutic Use (治疗用途的干细胞比较).Stem Cell Rev and Rep.Pub.0n lineDOI 10.1007/sl2015-011-9241
2.Taichman, R.S.，Wang, Z.，Shiozawaj Y.，Jung, Y.，Song, J.，BalduinojA.，Wang, J.，Patel, L R.，Havens, A.，Kuciaj M.，Ratajczakj M.，KrebsbachjP.H.Prospective Identification and Skeletal Localization of Cells Capable ofMult1-Lineage Differentiation In Vivo (体内能够多细胞谱系分化的细胞的预期识别和骨豁定位).Stem Cells Dev.2010.3.Kuciaj Μ., Wuj I，Ratajczakj Μ.Ζ.Bone marrow-derived very smallembryonic-1ike stem cells: Their developmental origin and biologicalsignificance.(骨髓派生的极小胚胎样干细胞:它们的发育器官和生物学意义)Dev.Dyn.2007.4.Kuciaj M.，Zuba-Surmaj E.K.，Wysoczynskij M.，Wuj W.，Ratajczakj J.，Machalinskij B., Ratajczakj Μ.Z.Adult marrow-derived very small embryonic-likestem cells and tissue engineering.(成熟骨髓派生的极小胚胎样干细胞和组织工程学)[Review] [104 refs].Expert Opinion on Biological Therapy 7 (10): 1499-514，2007.5.Kuciaj M., Recaj R., Campbell, F.R., Zuba-Sunnaj E., Majkaj M.,Ratajczakj J., Ratajczakj M.Z.A population of very small embryonic-like (VSEL)CXCR4 (+) SSEA-1 (+) Oct-4+ stem cells identified in adult bone marrow ( 一群在成熟骨髓中鉴定的极小胚胎样(VSEL) CXCR4(+) SSEA-U+)Oct-4+干细胞).Leukemia1920:857-869.
【权利要求】
1.一种处理患者的骨软骨组织损害或损伤的方法，其包括给予患者有效量的包含极小胚胎样干细胞(VSELs)的组合物，其中所述VSELs分化以治疗骨软骨组织。
2.权利要求1的方法，其中VSELs分化为成骨细胞。
3.权利要求1的方法，其中VSELs分化为软骨细胞。
4.权利要求1的方法，其中将VSELs直接给予组织。
5.权利要求1的方法，其中将VSELs全身给药。
6.权利要求4的方法，其中所述组合物每mm3包含约20-约5x IO5 VSELs。
7.权利要求4的方法，其中所述组合物每mm3包含约40-约4，000VSELs。
8.权利要求4的方法，其中所述组合物每mm2包含约10-约Ix IO5 VSELs。
9.权利要求4的方法，其中所述组合物每mm2包含约25-约500VSELs。
10.权利要求4的方法，其中所述组合物包含适合的基质。
11.权利要求10的方法，其中所述基质是生物可降解的。
12.权利要求1的方法，其中所述组合物包含一或多种骨形成蛋白(BMPs)。
13.权利要求1的方法，其中所述骨软骨组织是骨。
14.权利要求1的方法，其中所述骨软骨组织是软骨。
15.权利要求1的方法，其中所述骨软骨组织是关节软骨。
16.权利要求1的方法，其中所述组合物包含为至少约50%VSELs的细胞。
17.权利要求1的方法，其中所述组合物包含为至少约70%VSELs的细胞。
18.权利要求1的方法，其中所述组合物包含为至少约90%VSELs的细胞。
19.权利要求1的方法，其中所述VSELs是自体的VSELs。
20.权利要求1的方法，其中所述VSELs是同种异体的VSELs。
21.权利要求1的方法，其中所述VSELs是人的。
22.权利要求1的方法，其中所述方法用于治疗成骨不全症。
23.权利要求1的方法，其中所述方法用于治疗骨关节炎。
24.权利要求1的方法，其中所述方法用于治疗骨质疏松症。
25.—种干细胞组合物，其包含有效量的足以再生或修复骨软骨组织的VSELs。
26.权利要求25的干细胞组合物，其每mm3包含约20-约5x IO5 VSELs。
27.权利要求25的干细胞组合物，其每mm3包含约40-约4000VSELs。
28.权利要求25的干细胞组合物，其每mm2包含约10-约Ix IO5 VSELs。
29.权利要求25的干细胞组合物，其每mm2包含约25-约500VSELs。
30.权利要求25的干细胞组合物，其包含适合的基质。
31.权利要求30的干细胞组合物，其中所述基质是生物可降解的。
32.权利要求25的干细胞组合物，其包含一或多种骨形成蛋白(BMPs)。
33.权利要求25的干细胞组合物，其可分化为成骨细胞。
34.权利要求25的干细胞组合物，其可分化为软骨细胞。
35.权利要求25的干细胞组合物，其包含为至少约50%VSELs的细胞。
36.权利要求25的干细胞组合物，其包含为至少约70%VSELs的细胞。
37.权利要求25的干细胞组合物，其包含为至少约90%VSELs的细胞。
【文档编号】C12N5/0735GK103748215SQ201280027627
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年4月9日 优先权日:2011年4月8日
【发明者】R.泰奇曼, P.H.克雷布斯巴赫, A.黑文斯, A.米什拉, D.O.罗杰森, 王敬成, 塩沢裕介, Y.永 申请人:密执安大学评议会, 尼奥斯泰姆公司