生产二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸组合物及其制作方法与用途
【专利摘要】本发明涉及分离的微生物以及其菌株与突变株、生物质、微生物油、组合物及培养物；生产所述微生物油、生物质和突变株的方法；以及使用分离的微生物、生物质及微生物油的方法。
【专利说明】生产二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸组合物及其制作方法
与用途
[0001]发明背景发明领域
[0002]本发明涉及分离的微生物以及其菌株与突变株、生物质、微生物油、组合物及培养物；生产微生物油、生物质及突变株的方法；以及使用分离的微生物、生物质及微生物油的方法。
【背景技术】
[0003]脂肪酸的分类是基于碳链的长度与饱和特性。根据链中所存在的碳数目，脂肪酸被称作短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子之间无双键存在时称作饱和脂肪酸，当有双键存在时称作不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时，不饱和的长链脂肪酸是单不饱和的；当存在一个以上的双键时，则是多不饱和的。
[0004]多不饱和脂肪酸(TOFAs)的分类是基于自脂肪酸甲基端开始的第一个双键的位置:ω-3(η_3)脂肪酸在第三个碳上具有第一个双键，而ω_6(η_6)脂肪酸则在第六个碳上具有第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是一种具有22个碳的链长度和6个双键的ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，通常命名为“22:6η-3”。其它ω-3LC_PUFAs包括命名为“20:5n-3”的二十碳五烯酸(1?八”)，和命名为“22:511-3”的ω-3 二十二碳五烯酸(“DPA η-3”)。DHA及EPA已被称作“必需”脂肪酸。co-6LC_PUFAs包括命名为“20:4n_6”的二十碳四烯酸(“ARA ”)和命名为“22:5n-6”的ω-6 二十二碳五烯酸(“DPAn-6”)。
[0005]由于位于细胞膜中，ω-3脂肪酸是影响细胞生理功能的重要的生物学分子，它能调节生物活性化合物的产生与基因表达，并起到生物合成底物的作用。Roche，H.Μ.，Proc.Nutr.Soc.58:397-401 (1999)。例如，DHA占人类大脑皮层中脂质的约15%至20%，占视网膜中脂质的30%至60%，在睪丸与精子中富集，并且是母乳中的一个重要组分。Berg6，J.P.和 Barnathan,G..Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.96:49-125 (2005)。DHA 占脑中 ω-3脂肪酸的至多97%，并且占视网膜中ω-3脂肪酸的至多93%。此外，DHA是胎儿与婴儿发育以及维持成人认知功能所必需的。引用同上。因为在人体中无法从头合成ω-3脂肪酸，因此这些脂肪酸必须从营养来源获取。
[0006]亚麻仁油与鱼油被认为是良好的ω-3脂肪酸膳食来源。亚麻仁油不含有ΕΡΑ、DHA, DPA或ARA，但却含有亚麻酸(C18: 3η_3)，其是使机体能够制造EPA的一种结构单元。然而有证据显示代谢转换的速率缓慢且多变，特别在健康不佳的那些个体中。根据具体的物种及其饮食，鱼油在脂肪酸组成的类型与水平方面存在显著的差异。例如，与野生鱼类相t匕，水产养殖所饲养的鱼的ω-3脂肪酸水平较低。此外，鱼油具有含环境污染物的风险，并且可能伴随着稳定性问题和鱼的腥臭或味道。
[0007]破囊壶菌(Thraustochytrids)是破囊壶菌目(Thraustochytriales)的微生物。破囊壶菌包括裂殖壶菌属(Schizochytrium)与破囊壶菌属(Thraustochytrium)的成员，并且已经确认为包括DHA与EPA在内的ω-3脂肪酸的一种替代来源。参见第5130242号美国专利。与相应的鱼油或微藻油相比，由这些海生异养型微生物所生产的油通常具有更简单的多不饱和脂肪酸分布(profiles)。Lewis, T.Ε.，Mar.Biotechnol.1:580-587(1999)。已报导破囊壶菌物种的菌株所生产的ω-3脂肪酸，在该生物体所生产的总脂肪酸中占很高的百分比。第5130242号美国专利；Huang，J.等的J.Am.0il.Chem.Soc.78:605-610(2001) ；Huang, J.等的 Mar.Biotechnol.5:450-457 (2003)。然而，分离的破囊壶菌在所生产的LC-PUFAs的种类和量方面不同，这使得一些先前所述的菌株在培养中可能具有不期望的ω-6脂肪酸水平和/或会表现低的生产力。因此，一直存在对展现出高生产力和所期望的LC-PUFA分布的微生物的分离的需求。
[0008]发明概述
[0009] 申请人:已经发现，可以通过在微生物发酵时改变发酵液的水相中溶解的二氧化碳(CO2)的量来调控破囊壶菌所产生的EPA和DHA的量，其中所述破囊壶菌产生具有至少3%EPA的生物质。本文中提供制备具有脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物生物质的方法，其包含:在具有溶解有气体的发酵液的发酵罐容器中发酵微生物，以产生生物质，其中微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；并且调节所溶解的气体中溶解的CO2水平。在一个实施方式中，可以调节溶解的CO2水平，来在生物质中实现所期望的EPA和/或DHA水平。在另一个实施方式中，在发酵液的水相中溶解的CO2的量在总溶解气体的约38至约600ppm范围内、并且具体地在总溶解气体的约38至约135ppm范围内。
[0010]本文还提供制备具有脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物生物质的方法，其包含:在含有气体的发酵罐容器中发酵微生物，以产生生物质，其中微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA 的生物质的破囊壶菌；并且用CO2补充气体。补充指的是以相对于细胞发酵所产生的量而言额外的量或者以环境条件下的量，向容器中加入或充入co2。在一个实施方式中，向容器中补充C02，从而在生物质中实现所期望的EPA和/或DHA量。
[0011]本文也提供了制备具有脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物生物质的方法，其包含:在发酵罐容器中发酵微生物，以产生生物质，其中该微生物包含生产具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；并调节容器中生物质的量。在本发明的一个实施方式中，调节生物质，从而在生物质中实现所期望的EPA或DHA水平。
[0012]制备具有脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物的方法，其包含:在发酵罐容器中发酵微生物以产生生物质，其中该微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；并且调节生物质上的压强，例如但不限于控制容器的背压(backpressure)。在一个实施方式中，调节压强，从而在生物质中实现所期望的EPA或DHA水平。
[0013]在另一个实施方式中，本文提供了制造具有脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物的方法，其包含:在发酵罐容器中发酵微生物以产生发酵液和生物质，其中该微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；并且调节发酵液中的温度。在一个实施方式中，调节温度，从而在生物质中实现所期望的EPA或DHA水平。
[0014]在多个实施方式中，也可以通过提高或降低容器中CO2的量来调节容器的水相或发酵液中溶解的CO2的量，从而调控EPA和DHA的量。可以通过额外调节发酵的生物质的量，来调节溶解的CO2的量。例如，通过在瓶和较大的发酵容器中发酵细胞。也可以通过改变温度，根据本文中所提供的实施方式来改变EPA和DHA。例如可以通过调节容器中温度来额外地调节溶解的CO2的量。例如，较低的容器温度会产生较高浓度的EPA和较低浓度的DHA。还可以通过调节容器中压强，来调节溶解的CO2的量。例如升高的压强很可能增加溶解的CO2，这会增加生物质中EPA的量并降低DHA的量。上述的每一种调节诸如补充CO2、增加或减少生物质、提高或降低温度、或者提高或降低压强，均可以与其他调节中的任意一个结合，从而在生物质以及由生物质所提取的任何油中实现所期望的EPA和DHA水平。还可以通过pH的改变来调节溶解的CO2。
[0015]在一些实施方式中，与脂肪酸和ω-3脂肪酸总重量的量相比，EPA和DHA的总量(以重量计)保持相对恒定。
[0016]在其他实施方式中，在对补充的CO2的量、压强、温度、或者生物质进行调节之前，测量生物质的EPA或DHA含量。
[0017]虽然不希望受任何理论约束，但是推测EPA或DHA的量的增加或减少与发酵液的水相中溶解的CO2的量直接相关，并且对CO2、压强和温度的上述调节会改变生物质中溶解的CO2的量。
[0018]在一些实施方式中，本发明提供制备具有升高浓度的EPA的微生物生物质的方法，该方法包含:使微生物在含有小于0.lmg/L维生素Β12的培养基中生长，以产生生物质。在一些实施方式中，培养基包含小于0.01mg/L维生素B12。在一些实施方式中，培养基包含小于0.00lmg/L维生素B12。在另一些实施方式中，培养基包含小于0.000lmg/L维生素B12。在一些实施方式中，培养基不包含维生素B12。
[0019]在一些实施方式中，培养基还包含以每50g的无脂生物质计小于Ig的酵母提取物。在一些实施方式中，培养基还包含以每50g的无脂生物质计小于0.5g的酵母提取物。在另一些实施方式中，培 养基还包含以每50g的无脂生物质计小于0.1g的酵母提取物。
[0020]在一些实施方式中，与由包含大于0.lmg/L维生素B12的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度相比，EPA浓度增加了至少400%。在一些实施方式中，与由来自包含大于0.0 lmg/L维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度相比，EPA浓度增加了至少300 %。在另一些实施方式中，与来自包含大于0.001mg/L维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度相比，EPA浓度增加了至少200%。在一些实施方式中，与来自包含大于0.000lmg/L维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度相比，EPA浓度增加了至少100%。
[0021]在一些实施方式中，本发明提供制备具有升高浓度的EPA的微生物生物质的方法，其包含:使微生物在含有小于0.lmg/L钴的培养基中生长，以产生生物质。在一些实施方式中，培养基包含小于0.0 lmg/L钴。在一些实施方式中，培养基包含小于0.00 lmg/L钴。在另一些实施方式中，培养基包含小于0.0001mg/L钴。在一些实施方式中，培养基不包含钴。
[0022]在一些实施方式中，微生物是破囊壶菌。在一些实施方式中，微生物产生脂肪酸总重量的至少3% EPA。
[0023]在一些实施方式中，培养基具有至少5%的溶解的CO2的水平。在一些实施方式中，培养基具有至少10%的溶解的CO2的水平。在一些实施方式中，培养基具有至少15%的溶解的CO2的水平。
[0024]本发明还提供分离的生物质以及由本文的任意一种方法的生物质所提取得到的微生物油。
[0025]附图简要说明
[0026]从下文的发明详述、附图和附带的序列描述中可较充分地理解本发明的各个实施方式，它们形成本专利申请的一部分。
[0027]图1示出了 PTA-9695在硫胺素梯度中的性能。
[0028]图2示出了 PTA-9695在维生素B12梯 度中的性能。
[0029]图3示出了 PTA-9695在生物素梯度中的性能。
[0030]图4示出了 PTA-9695在泛酸钙梯度中的性能。
[0031]图5示出了 PTA-9695在TSFM标准品(standards)中的性能。
[0032]图6-图19示出了在10% CO2下PTA-9695在维生素B12梯度中的性能。
[0033]图20-图49示出了在10% CO2下PTA-10208在维生素B12梯度中的性能。
[0034]发明详述
[0035]本文所提供的方法和组合物尤其适用于破囊壶菌，该破囊壶菌产生具有其产生的脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质。本文所提供的产生具有至少3% EPA的生物质的具体的破囊壶菌是在ATCC登录号PTA-10212下所保藏物种的分离的微生物。与ATCC登录号PTA-10212有关的分离的微生物按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道(UniversityBoulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(Patent Depository)。
[0036]产生具有至少3 % EPA的生物质的具体的破囊壶菌选自在ATCC登录号PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210 或PTA-10211下所保藏的分离的微生物。
[0037]本文所提供的【具体实施方式】涉及包含18s rRNA的分离的微生物，所述18s rRNA含有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少94%同一性的多核苷酸序列。
[0038]本文所提供的【具体实施方式】涉及分离的微生物，其包含与在ATCC登录号PTA-10212下所保藏的微生物的18s rRNA多核苷酸序列具有至少94%同一性的18s rRNA多核苷酸序列。
[0039]本文所提供的产生具有至少3% EPA的生物质的具体的破囊壶菌涉及在ATCC登录号PTA-10208下所保藏的物种的分离的微生物。
[0040]本文所提供的【具体实施方式】涉及在ATCC登录号PTA-10208下所保藏的物种的分离的微生物，其中该微生物所产生的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
[0041]本发明中产生具有至少3% EPA的生物质的具体破囊壶菌涉及具有在ATCC登录号PTA-10208下保藏的物种的特性的分离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。本文所提供的产生具有至少3% EPA的生物质的具体破囊壶菌选自分离的微生物，该分离的微生物选自在ATCC登录号PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211下保藏的突变株。与ATCC登录号PTA-10209, PTA-10210和PTA-10211有关的微生物按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年9月25日保藏于美国维吉尼亚州 20110-2209 马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(PatentDepository)。
[0042]本文所提供的各个实施方式涉及上面所描述的微生素、它们的突变株和第12/729013号美国专利申请中所认定的微生物，其通过引用全部并入本文。
[0043]本文所提供的一个实施方式涉及生产甘油三酯部分的分离的微生物，其中该甘油三酯部分的二十碳五烯酸含量是至少约12重量％。
[0044]本文所提供的一个实施方式涉及分离的生物质，其中该生物质的细胞干重中的至少约20重量％为脂肪酸，其中超过约10重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，并且其中该脂肪酸包含各低于约5重量％的二十碳四烯酸和二十二碳五烯酸n-6。在一些实施方式中，至少约25重量％的脂肪酸为二十二碳六烯酸。
[0045]在一些实施方式中，本发明涉及包含甘油三酯(triacylglycerol)的分离的生物质，其中至少约12重量％的甘油三酯为二十碳五烯酸。
[0046]在一些实施方式中，本发明涉及本发明的任意一种分离的生物质，其中该脂肪酸还包含各低于约5重量％的油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸和芥子酸。
[0047]本发明涉及在ATCC登录号PTA-9695下保藏的破囊壶菌物种的分离的破囊壶菌微生物或由其衍生的菌株，其中所述微生物或由其衍生的菌株所产生的总脂肪酸包含约10重量％或更少的二十碳五烯酸。本文所提供的实施方式涉及上述微物生或由其衍生的菌株以及第US2010/0239533号美国专利申请中所描述的其他相关微生素，该专利通过引用全部并入本文。
[0048]本文还提供了在具有脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物的生物质中提高EPA浓度的方法，其包含:在含有气体的发酵罐容器中发酵微生物，以产生生物质，其中微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；并且以足以提高生物质中EPA浓度的量用CO2补充气体。可以将EPA浓度的升高与例如未补充CO2的类似地发酵的微生物中的EPA浓度相比、或者与环境条件下类似地发酵的微生物的EPA浓度相比。
[0049]在另一个实施方式中，足以提高EPA浓度的CO2的量大于或等于容器中总气体的2%。在另一个实施方式中，容器中CO2的量大于或等于容器中总气体的约5%到至多约20%。在另一个实施方式中，容器中CO2的量大于或等于容器中总气体的约5%到至多约15%。
[0050]在另一个实施方式中，补充的CO2的量大于或等于容器中总气体的2%，以提高生物质中EPA浓度到大于脂肪酸总重量的约4重量％、更具体地大于脂肪酸总重量的约4重量％到至多约45重量％、更具体地大于脂肪酸总重量的约4重量％到至多约40重量％。
[0051]在另一个实施方式中，补充的CO2的量足以将EPA水平从脂肪酸总重量的约4重量％提高到约6-30重量％的范围内。在另一个实施方式中，所提供的CO2的量足以将EPA浓度从脂肪酸总重量的约15重量％提高到至多约40重量％。在另一个实施方式中，所提供的CO2的量足以将EPA浓度提高到大于脂肪酸总重量的约20重量％。在另一个实施方式中，CO2是以足以将EPA浓度从约20%提高到至多约25%的量提供的。
[0052] 在另一个实施方式中，本文所提供的是提高具有脂肪酸和一定浓度EPA的微生物的生物质中EPA浓度的方法，其包含:在发酵罐容器中发酵微生物来生产生物质；在生物质上提供足以提高生物质中EPA浓度的压强。可以将EPA浓度的升高与例如未提供压强的类似地发酵的微生物中的EPA浓度相比、或者与环境条件下类似地发酵的微生物的EPA浓度相比。在另一个实施方式中，在生物质上所提供的压强高于大气压强约0.5psi。在另一个实施方式中，容器具有大于或等于约0.4ps1、更具体地约0.4psi到至多约30ps1、甚至更具体地约I到至多约30psi的顶空压强(head pressure或背压)。在另一个实施方式中，容器具有约I到至多约20psi的顶空压强。在另一个实施方式中，将所提供的压强提供足以调节生物质中EPA的量的时间、具体地至多120个小时。
[0053]在另一个实施方式中，本文所提供的是制备生产脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物生物质的方法，其包含在足以提高生物质中EPA浓度的温度下在发酵容器中发酵微生物来生产生物质，其中微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌。在一些实施方式中，足以提高EPA水平的温度小于约30°C、更具体地小于或等于约22°C、并且更具体地该温度为小于或等于约21°C。可以将EPA浓度的升高与例如未调节温度的类似地发酵的微生物中的EPA浓度相比、或者与环境条件下类似地发酵的微生物的EPA浓度相比。
[0054]在另一个实施方式中，本文所提供的方法改变发酵时所产生的EPA的量，来生产生物质和所提取的油，其中所提供的EPA的量大于脂肪酸总重量的4重量％、具体地从大于约4重量％到至多约45重量％、更具体地从大于约4重量％到至多约40重量％。在另一个实施方式中，通过本文提供的方法所产生的EPA的量为脂肪酸总重量的约6重量％到至多约30重量％的量。在另一个实施方式中，通过本文提供的方法所产生的EPA的量为脂肪酸总重量的约15重量％到至多约40重量％的量。在另一个实施方式中，通过本文提供的方法所产生的EPA的量为脂肪酸总重量的大于约20重量％的量、更具体地从约20重量％到至多约25重量％的量。
[0055]在另一个实施方式中，所提供的期望的EPA水平为脂肪酸总重量的大于4重量％、具体地从大于约4重量 ％到至多约45重量％、更具体地从大于约4重量％到至多约40重量％的量。在另一个实施方式中，通过本文提供的方法所产生的期望的EPA水平为脂肪酸总重量的约6重量％到至多约30重量％的量。在另一个实施方式中，通过本文提供的方法所产生的期望的EPA水平为脂肪酸总重量的约15重量％到至多约40重量％的量。在另一个实施方式中，通过本文提供的方法所产生的期望的EPA水平为脂肪酸总重量的大于约20重量％、更具体地从约20重量％到至多25重量％的量。
[0056]提高具有脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物生物质的方法，其包含:在发酵罐容器中发酵微生物来生产生物质，其中微生物是产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；并且以足以提高生物质中EPA浓度的量增加生物质。在一些实施方式中，足以提高EPA浓度的量的生物质具有大于或等于10g/l的密度。在一些实施方式中，足以提高EPA浓度的量的生物质具有约10g/l到至多250g/l的密度。可以将EPA浓度的升高与例如其中未增加生物质的类似地发酵的微生物中的EPA浓度相比。
[0057]在一些实施方式中，在包含较高的CO2水平(例如在以容器中总气体的大于或等于2%、大于或等于5%、大于或等于10%、大于或等于15%、大于或等于20%、5%至20%、或5%至15%的量含有CO2的容器中)的培养基中生长的生物质的EPA浓度比由包含较低的CO2水平(例如分别在以容器中总气体的小于2%、小于5%、小于10%、小于15%、小于20%、0%至4%、或1%至3%的量含有CO2的容器中)的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少10 %、至少50 %、至少100 %、至少250 %、至少500 %、至少750 %、至少 1000%、至少 1100%、至少 1200%、至少 1300%、至少 1400%、至少 1500%、至少 1600%,至少1700%、至少1800%、至少1900%、或至少2000%。例如，包含较高的CO2水平(例如在以容器中总气体的大于或等于2%、大于或等于5%、大于或等于10%、大于或等于15%、大于或等于20%、5%至20%、或5%至15%的量含有CO2的容器中)的培养基中生长的生物质的EPA浓度比由环境CO2水平下容器中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少10%、至少50%、至少100%、至少250%、至少500%、至少750%、至少1000%、至少1100 %、至少 1200%、至少 1300%、至少 1400 %、至少 1500%、至少 1600 %、至少 1700%、至少1800%、至少1900%、或至少2000%。
[0058]培养基中维生素B12
[0059]本文中使用时术语“维生素B12”指的是天然存在和合成形式的、化学相关的一类化合物，包括但不限于维生素B12、钴胺素、氰钴胺素和羟钴胺。在一些实施方式中，本发明提供了通过使生产EPA的微生物在具有低水平维生素B12的培养基中或不含维生素B12的培养基中生长，来提高微生物生物质EPA浓度的方法。在一些实施方式中，本发明提供制备具有提高的EPA浓度的微生物的生物质的方法，其包含在含有小于0.lmg/L维生素B12的培养基中生长微生物来生产生物质。在一些实施方式中，培养基包含小于0.05mg/L、小于0.005mg/L、小于0.001mg/L、小于0.0005mg/L、小于0.000lmg/L的维生素B12或者不含维生素B12。
[0060]在一些实施方式中，培养基包含以每50g的无脂生物质计小于Ig的维生素B12源(例如酵母提取物、玉米浸溃固体(corn steep solids)、大豆粉以及其他复合氮源)。在一些实施方式中，培养基包含以每50g的无脂生物质计小于0.8g、小于0.5g、小于0.3g、小于0.lg、小于0.05g或小于0.0 1g的这种维生素B12源。在一些实施方式中，培养基还包含以每50g的无脂生物质计小于Ig酵母提取物、以每50g的无脂生物质中0.Sg酵母提取物、以每50g的无脂生物质中小于0.5g酵母提取物、以每50g的无脂生物质中小于0.3g酵母提取物、以每50g的无脂生物质中小于0.1g酵母提取物、以每50g的无脂生物质中小于0.05g酵母提取物、或者以每50g的无脂生物质中小于0.01g酵母提取物。本文使用时，术语“无脂生物质”指的是培养后微生物的目标无脂肪的细胞干重。
[0061]在一些实施方式中，在包含较低的维生素B12水平的培养基中(例如在含有小于0.lmg/L、小于 0.05mg L、小于 0.01mg/L、小于 0.005mg/L、小于 0.001mg/L、小于 0.0005mg/L、小于0.0001mg/L的维生素B12、或者不含维生素B12的培养基中)生长的生物质的EPA浓度比由包含较高的维生素B12水平的培养基中(例如分别包含至少0.1mg L、至少0.05mg/L、至少 0.01mg L、至少 0.005mg L、至少 0.001mg/L、至少 0.0005mg L、至少 0.0001mg/L、或至少0.00005mg/L维生素B12的培养基中)生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少150%、至少200%、至少250%、至少300 %、至少350 %、至少400 %、至少450 %、至少500 %、至少550 %、至少600 %、至少650%或至少700%。例如，在不包含维生素B12的培养基中生长的生物质的EPA浓度比由包含维生素B12(例如至少0.000lmg/L维生素B12)的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少150%、至少200%、至少250%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450%、至少500 %、至少550 %、至少600 %、至少650 %、或至少700 %。[0062]在一些实施方式中，在环境CO2水平下包含较低的维生素B12水平的培养基中(例如在含有小于 0.lmg/L、小于 0.05mg L、小于 0.01mg/L、小于 0.005mg/L、小于 0.001mg/L、小于0.0005mg/L、小于0.000lmg/L的维生素B12、或者不含维生素B12的培养基中)生长的生物质的EPA浓度比在环境CO2水平下由包含较高的维生素B12水平的培养基中(例如分别包含至少0.1mg L、至少0.05mg/L、至少0.01mg L、至少0.005mg L、至少0.001mg/L、至少0.0005mg L、至少0.0001mg/L、或至少0.00005mg/L维生素B12的培养基中)生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、或至少500%。在一些实施方式中，在环境CO2水平下包含较低的维生素B12水平的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在环境CO2水平下由包含较高的维生素B12水平的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高100 %至700 %、150 %至650 %、200 %至600 %、250%至550%、或300%至500%。在一些实施方式中，在高CO2水平下(例如至少5%、至少10%、至少15%、或至少20%的溶解的CO2水平)包含较低的维生素B12水平的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在高CO2水平下由包含较高的维生素B12水平的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少100%。在一些实施方式中，在高CO2水平下(例如至少5%、至少10%、至少15%、或至少20%的溶解的CO2水平)包含较低的维生素B12水平的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在高CO2水平下由包含较高的维生素B12水平的培养基中生长的微生物所得到的生物质中 EPA浓度高 5%至 200%、10%至 175%、15%至 150%、20%至 125%、或 25%至 100%。例如，在环境CO2水平下在不含维生素B12的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在环境CO2水平下由包含维生素B12 (例如至少0.000lmg/L维生素B12)的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少100 %、至少200 %、至少300 %、至少400 %、或至少500 %。另一个例子是，在至少10%的溶解的CO2水平下在不含维生素B12的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在至少10%的溶解的CO2水平下由包含维生素B12 (例如至少0.000lmg/L维生素B12)的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至 少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少100%。
[0063]在一些实施方式中，与具有大于0.lmg/L维生素B12的培养基中生长的相同微生物相比，在具有小于0.lmg/L维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度升高至少100 %、至少200 %、至少300 %、至少400 %、或至少500 %。在一些实施方式中，与具有大于0.0 lmg/L维生素B12的培养基中生长的相同微生物相比，在具有小于0.0 lmg/L维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度升高至少100%、至少200%、至少300 %、至少400 %、或至少500 %。在一些实施方式中，与具有大于0.00lmg/L维生素B12的培养基中生长的相同微生物相比，在具有小于0.001mg/L维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度升高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、或至少500%。在另外一些实施方式中，与具有大于0.0001mg/L维生素B12的培养基中生长的相同微生物相比，在具有小于0.000lmg/L维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度升高至少100 %、至少200 %、至少300 %、至少400 %、或至少500 %。在一些实施方式中，与具有一定量维生素B12的培养基中生长的相同微生物相比，在不含维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度升高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、或至少500%。可以通过使微生物在具有较高量维生素B12的培养基中生长、使相同微生物在具有较低量维生素B12的培养基中生长，并比较每个培养物中所得到的生物质中EPA的浓度，来测定生物质中EPA浓度的升高。在该测定中，除了它们的维生素B12水平之外，具有较低或较高量的维生素B12的培养基的内容物相同。
[0064]在一些实施方式中，在包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少0.01mg/L、至少0.005mg/L、至少0.001mg/L、至少0.0005mg/L、或至少0.000lmg/L维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质的EPA浓度为总脂肪酸的至少I重量％、至少2重量％、至少3重量％、至少4重量％、或至少5重量％的EPA。在一些实施方式中，在包含至少0.lmg/L、至少 0.05mg/L、至少 0.01mg/L、至少 0.005mg/L、至少 0.001mg/L、至少 0.0005mg/L、或至少0.0001mg/L维生素B12的培养基中生长的微生物的生物质的EPA浓度为总脂肪酸的1%至 50%、1%至 40%、1%至 30%、1%至 20%、2%至 50%、2%至 40%、2%至 30%、或 2%至20% 的 EPA。
[0065]培养基中钴
[0066]在一些实施方式中，本发明提供制备具有升高的EPA浓度的微生物的生物质的方法，其包含使微生物在含有小于0.lmg/L钴的培养基中生长来生产生物质。在一些实施方式中，培养基包含小于0.05mg/L、小于0.01mg/L、小于0.005mg/L、小于0.001mg/L、小于0.0005mg/L、小于0.000lmg/L的钴、或不含钴。
[0067]在一些实施方式中，培养基还包含以每50g的无脂生物质计小于Ig的酵母提取物、以每50g的无脂生物质计小于0.Sg的酵母提取物、以每50g的无脂生物质计小于0.5g的酵母提取物、以每50g的无脂生物质计小于0.3g的酵母提取物、以每50g的无脂生物质计小于0.1g的酵母提取物、以每50g的无脂生物质计小于0.05g的酵母提取物、或者以每50g的无脂生物质计小于0.01g的酵母提取物。
[0068]在一些实施方式中，在含有较低钴水平的培养基中(例如在包含小于0.lmg/L、小于 0.05mg/L、小于 0.0 lmg/L、小于 0.005mg/L、小于 0.00 lmg/L、小于 0.0005mg/L、小于0.000lmg/L的钴、或不含钴的培养基中)生长的生物质的EPA浓度比含有较高钴水平的培养基中(例如在分别包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少0.01mg/L、至少0.005mg/L、至少0.001mg/L、至少0.0005mg/L、至少0.0001mg/L、或至少0.00005mg/L钴的培养基中)生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少150%、至少200%.、至少250%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450 %、至少500 %、至少550 %、至少600 %、至少650 %、或至少700 %。例如，在不含钴的培养基中生长的生物质的EPA浓度比包含钴(例如至少0.0001mg/L钴)的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少10 %、至少25 %、至少50 %、至少75 %、至少100 %、至少150%、至少200%、至少250%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450%、至少500 %、至少550 %、至少600 %、至少650 %或至少700 %。
[0069]在一些实施方式中，在环境CO2水平下在包含较低钴水平的培养基中(例如，在包含小于 0.lmg/L、小于 0.05mg/L、小于 0.01mg/L、小于 0.005mg/L、小于 0.001mg/L、小于0.0005mg/L、小于0.000lmg/L或不含钴的培养基)生长的生物质的EPA浓度比在环境CO2水平下包含较高钴水平的培养基中(例如，在分别包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少 0.01mg/L、至少 0.005mg/L、至少 0.001mg/L、至少 0.0005mg/L、至少 0.000lmg/L 或至少0.00005mg/L钴的培养基中)生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。在一些实施方式中，在环境CO2水平下在包含较低钴水平的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在环境CO2水平下在包含较高钴水平的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高100%至700%、150%至650%、200%至600%、250%至550%或300%至500%。在一些实施方式中，在高CO2水平(例如，至少5%、至少10%、至少15%或至少20%的溶解的CO2水平)下在包含较低钴水平的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在高CO2水平下在包含较高钴水平的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或至少100 %。在一些实施方式中，在高CO2水平(例如，至少5%、至少10%、至少15%或至少20%的溶解的CO2水平)下在包含较低钴水平的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在高CO2水平下在包含较高钴水平的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高5%至200%、10%至175%、15%至150%、20%至125%或25%至100%。例如，在环境CO2水平下不含钴的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在环境CO2水平下包含钴(例如至少0.0OOlmg/L钴)的培养基中高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。另一个例子是，另一个例子是，在至少10%的溶解的CO2水平下不含钴的培养基中生长的生物质的EPA浓度比在至少10%的溶解的CO2水平下包含钴(例如至少0.000lmg/L钴)的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。
[0070]在一些实施方式中，与在具有大于0.lmg/L钴的培养基中生长的相同微生物相t匕，在具有小于0.lmg/L钴的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度提高了至少100%、至少200%、至 少300%、至少400%或至少500%。在一些实施方式中，与在具有大于0.01mg/L钴的培养基中生长的相同微生物相比，在具有小于0.01mg/L钴的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度提高了至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。在一些实施方式中，与在具有大于0.001mg/L钴的培养基中生长的相同微生物相比，在具有小于0.001mg/L钴的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度提高了至少100%,至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。在一些实施方式中，与在具有大于0.0001mg/L钴的培养基中生长的相同微生物相比，在具有小于0.0001mg/L钴的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度提高了至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。在一些实施方式中，与在具有一定量钴的培养基中生长的相同微生物相比，在不含钴的培养基中生长的微生物的生物质中EPA浓度提高了至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。可以通过使微生物在具有较高量钴的培养基中生长、使相同微生物在具有较低量钴的培养基中生长，并比较每个培养物中所得到的生物质中的EPA浓度，来测定生物质中EPA浓度的升高。在该测定中，除了它们的钴水平之外，具有较低或较高量的钴的培养基的内容物相同。
[0071]在一些实施方式中，在包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少0.01mg/L、至少
0.005mg/L、至少0.001mg/L、至少0.0005mg/L或至少0.000lmg/L钴的培养基中生长的微生物的生物质的EPA浓度为总脂肪酸的至少I重量％、至少2重量％、至少3重量％、至少4重量％或至少5重量^^^EPA。在一些实施方式中，在包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少 0.01mg/L、至少 0.005mg/L、至少 0.001mg/L、至少 0.0005mg/L 或至少 0.000lmg/L 钴的培养基中生长的微生物的生物质的EPA浓度是总脂肪酸的I重量％至50重量％、I重量％至40重量％、I重量％至30重量％、I重量％至20重量％、2重量％至50重量％、2重量％至40重量％、2重量％至30重量％或2重量％至20重量％的EPA。
[0072]含有少量维生素B12、酵母提取物和/或钴的培养基还可以包含至少5%、至少10%、至少15%或至少20%的溶解的CO2水平。本发明涉及本文所公开的方法的分离的生物质、以及涉及由这些方法的生物质所提取的微生物油。
[0073]本发明涉及包含本发明的任意微生物或其混合物的分离的培养物。
[0074]本发明涉及非人类的动物或人类用的食用产品、化妆品或药物组合物，其包含本发明的任意微生物或生物质或其混合物。
[0075]本发明涉及微生物油，其包含至少约20重量％的二十碳五烯酸与各小于约5重量％的二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸、芥子酸及十八碳四烯酸。在一些实施方式中，该微生物油还包含至少约25重量％的二十二碳六烯酸。
[0076]本发明涉及包含至少约10重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中甘油三酯部分中的至少约12重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，其中甘油三酯部分中的至少约25重量％的脂肪酸为二十二碳六烯酸，以及其中甘油三酯部分中的小于约5重量％的脂肪酸为二十碳四烯酸。
[0077]本发明涉及非人类的动物或人类用的食用产品、化妆品或药物组合物，其包含本发明的任意微生物油。在一些实施方式中，食用产品是婴儿配方奶粉。在一些实施方式中，婴儿配方奶粉是适合早产婴儿使用的。在一些实施方式中，食用产品是乳、饮料、治疗性饮品、营养饮品或其组合。在一些实施方式中，食用产品是用于非人类的动物或人类食品的添加剂。在一些实施方式中，食用产品是营养补充剂。在一些实施方式中，食用产品是动物饲料。在一些实施方式中，该动物饲料是水产养殖用饲料。在一些实施方式中，该动物饲料是家畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、牲畜饲料或其组合。
[0078]本发明涉及用于生产含有ω-3脂肪酸的微生物油的方法，该方法包括:在培养物中培养本发明的任意分离的微生物或其混合物，以生产含有ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，该方法还包含提取(extracting)该油。
[0079]本发明涉及用于生产含有ω-3脂肪酸的微生物油的方法，该方法包含从本发明的任意生物质中提取含有ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，使用有机溶剂提取过程诸如己烷提取来提取该微生物油。在一些实施方式中，使用无溶剂提取过程来提取该微生物油。
[0080]本发明涉及通过本发明的方法所生产的微生物油。
[0081]本发明涉及用于生产本发明的生物质的方法，其包括:使本发明的任意分离的微生物或其混合物在培养物中生长，以生产生物质。
[0082]本发明涉及通过本发明的方法所生产的生物质。
[0083] 本发明涉及用于生产本发明的突变菌株的方法，其包括:诱变本发明的任意微生物，并分离该突变菌株。
[0084]本发明涉及本发明的任意分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物用于制造治疗发炎或相关病况的药剂的用途。
[0085]本发明涉及本发明的任意分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物用于治疗发炎或相关病况的用途。
[0086]本发明涉及用于治疗发炎或相关病况的本发明的任意分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物。 [0087]本发明涉及在有需要的个体中用于治疗发炎或相关病况的方法，其包括:给该个体施用本发明的任意分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物以及药学上可接受的载剂。
[0088]本发明涉及由本发明的微生物生产微生物油和生物质的方法，以及使用微生物、生物质和微生物油的方法。
[0089]微生物
[0090]在一些实施方式中，用于本发明用途的微生物细胞是网粘菌门(PhylumLabyrinthulomycota)的微生物。在一些实施方式中，网粘菌门的微生物细胞是破囊壶菌，例如裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)。根据本发明，术语“破囊壶菌”是指破囊壶菌目(Thraustochytriales)的任何成员，其包括破囊壶菌科(Thraustochytriaceae),并且术语“网粘菌(Iabyrinthulid) ”是指网粘菌目(Labyrinthulales)的任何成员，其包括网粘菌科(Labyrinthulaceae)。
[0091]网粘菌科的成员从前曾被认为是破囊壶菌目的成员，但是在最近此类生物体的分类学归类的修订版中，网粘菌科现在被认为是网粘菌目的成员。网粘菌目和破囊壶菌目均被认为是网粘菌门的成员。分类学理论现在通常将这两个群的微生物与原生藻菌(Stramenopile)谱系中的藻类或藻样原生生物放在一起。破囊壶菌和网粘菌当前的分类学地位可以归纳如下:
[0092]界:藻菌界(Stramenopila)(管毛生物界(Chromista))
[0093]门:网粘菌门(Labyrinthulomycota)(不等鞭毛门(Heterokonta))
[0094]纲:网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)(Labyrinthulae)
[0095]目:网粘菌目(Labyrinthulales)
[0096]科:网粘菌科(Labyrinthulaceae)
[0097]目:破囊壶菌目(Thraustochytriales)
[0098]科:破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)
[0099]对于本发明的目的而言，描述为破囊壶菌的微生物细胞的菌株包括如下生物体:目:破囊壶菌目；科:破囊壶菌科；属:破囊壶菌属(种:物种，arudimentale、aureum、benthicola、globosum、kinne1、motivum、multirudimentale、pachydermum、proliferum、roseum 和 striatum)，吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种:物种，amoeboidea、kerguelensis、minuta、 profunda、 radiata、 sailens、 sarkariana、 schizochytrops、 visurgensis、yorkensis 和物种 BP-5601)，裂殖壶菌属(种:物种，aggregatum、limnaceum、mangrovei>minutum 和 octosporum)，Japonochytrium 属(种:物种，marinum)，Aplanochytrium 属(种:物种，haliotidis,kerguelensis,profunda和 stocchinoi) ,Althornia属(种:物种，crouchii),或Elina属(种:物种，marisalba和sinorifica)。出于本发明的目的，吾肯氏壶菌属内描述的物种将被看作是破囊壶菌属的成员。Aurantiochytrium和Oblongospora在本发明中是网粘菌门包括的两个额外的属。在一些实施方式中，微生物细胞属于破囊壶菌属、裂殖壶菌属及其混合物。
[0100]本发明涉及分离的微生物及由其所衍生的菌株。由本发明的分离的微生物所“衍生”的菌株可以为天然衍生或人工衍生，诸如突变株、变异株或重组菌株。本文中使用时术语“分离的”并不一定反映分离物已被纯化的程度，而是指从天然形式或天然环境中分离或隔离。分离物可包括但不限于分离的微生物、分离的生物质、分离的培养物、分离的微生物油及分离的序列(诸如本文中所公开的分离的多核苷酸序列)。本文中使用时术语“微生物”包括但不限于术语“微型藻”、“破囊壶菌”及与本文中所述的任意保藏微生物相关联的分类学分类。与本发明的任意一种微生物(包括本文中所述的保藏微生物)相关时所用的术语“破囊壶菌目” (“Thraustochytriales”)、“破囊壶菌” (“thraustochytrid”)、“裂殖壶菌属”(“Schizochytrium”)及“破囊壶菌属”(“Thraustochytrium”)是以包括了可获得的系谱信息的目前的分类学分类为基础的，并且不意图限制在本申请的申请日之后修订分类学分类的事件。
[0101]在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-10212下所保藏的物种的分离的微生物。与ATCC登录号PTA-10212相关联的分离的微生物在本文中也称为破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)ATCCPTA-10212。与 ATCC 登录号 PTA-10212 相关联的分离的微生物按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州 20110-2209 马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(PatentDepository)。在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-10212下所保藏的一种分离的菌株。在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、P TA-10208、PTA-10209、PTA-10210、或 PTA-10211 下所保藏的分离的菌株。
[0102]在一些实施方式中，本发明涉及具有在ATCC登录号PTA-10212下所保藏物种的特性的分离的微生物或由其所衍生的菌株。在ATCC登录号PTA-10212下所保藏物种的特性可以包括其生长性质与表型性质(表型性质的实例包括形态学性质与繁殖性质)、其物理性质与化学性质(诸如干重与脂质分布)、其基因序列及其组合，其中所述特性使这些物种区别于先前认定过的物种。在一些实施方式中，本发明涉及具有在ATCC登录号PTA-10212下所保藏物种的特性的分离的微生物，其中所述特性包括:含有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:1的同一性至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核苷酸序列的18s rRNA，在ATCC登录号PTA-10212下所保藏物种的形态学性质与繁殖性质，以及在ATCC登录号PTA-10212下所保藏物种的脂肪酸分布。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与在ATCC登录号PTA-10212下所保藏微生物基本相同的表型性质。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与在ATCC登录号PTA-10212下所保藏微生物基本相同的生长性质。在一些实施方式中，本发明涉及分离的微生物，其所包含具有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或与SEQ IDNO:1的同一性至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核苷酸序列的18s rRNA。在一些实施方式中，本发明涉及分离的微生物，其包含与在ATCC登录号PTA-10212下所保藏微生物的18srRNA多核苷酸序列的同一性至少94%的18s rRNA多核苷酸序列。
[0103]在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-10212下所保藏微生物的一种突变型菌株。在另一些实施方式中，该突变型菌株是在ATCC登录号PTA-10213、PTA-10214或PTA-10215下所保藏的菌株。与ATCC登录号PTA-10213、PTA-10214及PTA-10215相关联的微生物是按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州 20110-2209 马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(PatentDepository)。
[0104]在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-10208下所保藏物种的分离的微生物。与ATCC登录号PTA-10208相关联的分离的微生物在本文中也称为裂殖壶菌属(Schizochytrium sp) ATCCPTA-10208。与 ATCC 登录号 PTA-10208 相关联的微生物是按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(Patent Depository)。在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-10208下所保藏的分离的菌株。
[0105]在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-10208下所保藏物种的分离的微生物，其中该微生物所产生的总脂肪酸包含超过约10重量％、超过约11重量％、超过约12重量％、超过约13重量％、超过约14重量％、超过约15重量％、超过约16重量％、超过约17重量％、超过约18重量％、超过约19重量％或超过约20重量％的EPA。在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-10208下所保藏物种的一种分离的微生物，其中该微生物所产生的总脂肪酸包含约10重量％至约55重量％、约10重量％至约50重量％、约10重量％至约45重量 ％、约10重量％至约40重量％、约10重量％至约35重量％、约10重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、约20重量％至约40重量％、约20重量％至约35重量％或约20重量％至约30重量％的EPA。
[0106]在一些实施方式中，本发明涉及具有在ATCC登录号PTA-10208下所保藏物种的特性的分离的微生物，其中该微生物所产生的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。在ATCC登录号PTA-10208下所保藏微生物的特性包括其生长性质与表型性质(表型性质的实例包括形态学性质与繁殖性质)、其物理性质与化学性质(诸如干重与脂质分布)、其基因序列及其组合，其中所述特性可区别该物种与先前鉴定的物种。在一些实施方式中，本发明涉及具有在ATCC登录号PTA-10212下所保藏物种的特性的分离的微生物，其中该特性包括含有SEQ ID NO:2的多核苷酸序列的18s rRNA、在ATCC登录号PTA-10208下所保藏物种的形态学性质与繁殖性质、以及在ATCC登录号PTA-10208下所保藏物种的脂肪酸分布。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物所具有的物理性质与化学性质与在ATCC登录号PTA-10208下所保藏的微生物基本相同。
[0107]在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-10208下所保藏微生物的突变型菌株。在另一些实施方式中，该突变型菌株是在ATCC登录号PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211下所保藏的菌株。与ATCC登录号PTA-10209、PTA-10210及PTA-10211相关联的微生物是按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年9月25日保藏于美国维吉尼亚州 20110-2209 马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(PatentDepository)。
[0108]在一些实施方式中，本发明涉及产生甘油三酯部分的本发明的分离的微生物，其中该甘油三酯部分的EPA含量是至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重量％。在一些实施方式中，本发明涉及生产甘油三酯部分的分离的微生物，其中该甘油三酯部分的EPA含量是约12重量％至约55重量％、约12重量％至约50重量％、约12重量％至约45重量％、约12重量％至约40重量％、约12重量％至约35重量％、约12重量％至约30重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％或约20重量％至约30重量％。
[0109]在一些实施方式中，本发明涉及产生甘油三酯部分的本发明的分离的微生物的突变株、变异株或重组株，其中该甘油三酯部分的EPA含量是至少约10重量％、至少约11重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重量％。在一些实施方式中，本发明涉及产生甘油三酯部分的本发明的分离的微生物的突变株、变异株或重组株，其中该甘油三酯部分的EPA含量是约12重量％至约55重量％、约12重量％至约50重量％、约12重量％至约45重量％、约12重量％至约40重量％、约12重量％至约35重量％、约12重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、约20重量％至约40重量％、约20重量％至约35重量％或约20重量％至约30重量％。可通过公知的程序来产生突变型菌株。常用的程序包括辐射、高温处理及以诱突变剂处理。变异型菌株可以是本文中所述物种的其它天然存在的分离株和/或亚分离株。可通过分子生物学中用于表达外源基因或改变内源基因的功能或表达的任何公知的方法来产生重组型菌株。在一些实施方式中，突变株、变异株或重组型菌株比野生型菌株生产更高量的ω-3脂肪酸、尤其是EPA。在一些实施方式中，突变株、变异株或重组型菌株生产较低量的一种或多种脂肪酸，诸如较低量的DHA、ARA, DPA n-6或其组合。在一些实施方式中，突变株、变异株或重组型菌株比野生型菌株产生每升培养物中更大的细胞干重。这种突变株、变异株或重组型菌株是由本发明的分离的微生物所衍生的菌株的实例。
[0110]本发明还涉及具有在ATCC登录号PTA-9695下所保藏的破囊壶菌物种的特性的分离的破囊壶菌微生物，其中所述微生物或由其衍生的菌株所产生的总脂肪酸包含约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
[0111]本发明还涉及分离的破囊壶菌微生物或由其衍生的菌株，其包含甘油三酯部分，其中甘油三酯部分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，其中甘油三酯部分的二十二碳五烯酸n-6含量为至少约0.5重量％至约6重量％，并且其中所述微生物或由其衍生的菌株所产生的总脂肪酸包含约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
[0112]本发明还涉及具有与在ATCC登录号PTA-9695下所保藏的破囊壶菌或由其衍生的菌株相同的物种的分离的破囊壶菌微生物，其中所述微生物或由其衍生的菌株所产生的总脂肪酸包含约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
[0113]在一些实施方式中，由本发明的分离的破囊壶菌微生物所衍生的菌株是突变型菌株。
[0114]本发明还涉及在ATCC 登录号 PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697 或 PTA-9698 下所保藏的分离的微生物。
[0115]本发明还涉及包含本发明的任意一种破囊壶菌微生物或其混合物的破囊壶菌生物质。
[0116]本发明还涉及分离的破囊壶菌生物质，其中至少约50重量％细胞干重的生物质是脂肪酸，并且其中至少约50重量％的脂肪酸是ω-3脂肪酸。在一些实施方式中，至少约50重量％的脂肪酸是二十二碳六烯酸。本发明还涉及分离的破囊壶菌生物质，其中至少约25重量％细胞干重的生物质是二十二碳六烯酸。
[0117]在一些实施方式中，本发明还涉及分离的破囊壶菌生物质，其中约10重量％或更少的脂肪酸是二十碳五烯酸，并且其中二十二碳六烯酸与二十碳五烯酸的重量比为至少约
5: 10
[0118]在一些实施方式中，本发明还涉及分离的破囊壶菌生物质，其中约1.5重量％或更少的脂肪酸是二十碳四烯酸，并且其中二十二碳六烯酸与二十碳四烯酸的重量比为至少约 20: I。
[0119]在一些实施方式中，本发明还涉及分离的破囊壶菌生物质，其以至少约10: I的重量比包含二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸η-6。在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号ΡΤΑ-9695下所保藏物种的破囊壶菌。本文中分离的破囊壶菌也称为裂殖壶菌属(Schizochytrium sp)ATCC PTA-9695?与ATCC登录号PTA-9695相关联的破囊壶菌按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)下于2009年I月7日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(Patent Depository) ?
[0120]在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-9695下保藏的分离的破囊壶菌菌株。在一些实施方式中，本发明涉及与在ATCC登录号PTA-9695下保藏的破囊壶菌相同物种的分离的破囊壶菌微生物。
[0121 ] 在一些实施方式中，本发明涉及具有在ATCC登录号PTA-9695下保藏的物种或由其衍生的菌株的特性的分离的破囊壶菌。在ATCC登录号PTA-9695下保藏的破囊壶菌物种的特性包括其生长性质与表型性质(表型性质的实例包括形态学性质与繁殖性质)、其物理性质与化学性质(诸如干重与脂质分布)及其基因序列。在一些实施方式中，本发明的分离的破囊壶菌具有基本上 与在ATCC登录号PTA-9695下保藏的破囊壶菌的相同的表型性质。在一些实施方式中，本发明的分离的破囊壶菌具有基本上与在ATCC登录号PTA-9695下保藏的破囊壶菌的相同的生长性质。
[0122] 在一些实施方式中，本发明涉及本发明的分离的破囊壶菌的突变株、变异株或重组株，其中突变株、变异株或重组株所产生的总脂肪酸包含约10重量％或更少的二十碳五烯酸。可以通过公知的程序来产生突变型菌株。常用的程序包括辐射、高温处理及以诱突变剂处理。变异型菌株可以是本文中所述物种的其它天然存在的分离株和/或亚分离株。可以通过分子生物学中用于表达外源基因或改变内源基因的功能或表达的任何公知的方法来产生重组型菌株。在一些实施方式中，突变株、变异株或重组型菌株比野生型菌株生产更高量的ω-3脂肪酸(包括DHA和/或EPA)。在一些实施方式中，突变株、变异株或重组型菌株生产较低量的一种或多种脂肪酸，诸如较低量的EPA、ARA, DPA n-6或其组合。在一些实施方式中，突变株、变异株或重组型菌株比野生型菌株产生以每升培养物计更大的细胞干重。这种突变株、变异株或重组型菌株是由本发明的分离的破囊壶菌所衍生的菌株的实例。
[0123]在一些实施方式中，本发明涉及在ATCC登录号PTA-9695下保藏的破囊壶菌的突变型菌株。在另一些实施方式中，突变型菌株是在ATCC登录号PTA-9696、PTA-9697或PTA-9698下保藏的菌株。与ATCC登录号PTA-9696、PTA-9697或PTA-9698相关联的破囊壶菌菌株是按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年I月7日保藏于美国维吉尼亚州 20110-2209 马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(PatentDepository)。这些保藏的突变型菌株是在ATCC登录号PTA-9695下保藏的破囊壶菌的衍生物。
[0124]在一些实施方式中，本发明的分离的破囊壶菌(包括其突变株、变异株或重组株)在由破囊壶菌分离的一个或多个部分中包含脂肪酸。由破囊壶菌分离的一个或多个部分包括总脂肪酸部分、固醇酯部分、甘油三酯部分、游离脂肪酸部分、固醇部分、甘油二酯部分、极性部分(包括磷脂部分)以及它们的组合。
[0125]本发明还涉及包含本发明的任意破囊壶菌微生物或其混合物的分离的破囊壶菌培养物。在一些实施方 式中，培养物包含至少约5%的溶解氧。
[0126]本发明还涉及包含本发明的任意一种破囊壶菌微生物或生物质或者其混合物的动物或人类用的食用产品、化妆品或药物组合物。
[0127]本发明还涉及包含至少约70重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中甘油三酯部分的二十二碳六烯酸含量为至少约50重量％，并且其中甘油三酯部分的二十二碳五烯酸n-6含量为约0.5重量％至约6重量％。在一些实施方式中，微生物油还包含约1.5重量％或更少的甘油三酯部分的二十碳四烯酸含量。
[0128]本发明还涉及包含至少约70重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中甘油三酯部分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，并且其中甘油三酯部分的二十二碳五烯酸n-6含量为至少约0.5重量％至约6重量％，并且其中二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6的比例大于约6: I。
[0129]本发明还涉及包含至少约70重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中甘油三酯部分的二十二碳六烯酸含量为至少约60重量％。
[0130]在一些实施方式中，在微生物油的甘油三酯部分中至少约20%的甘油三酯在甘油三酯中选自sn-1、sn-2和sn_3位置的任意二者的二个位置上含有二十二碳六烯酸。在一些实施方式中，在微生物油的甘油三酯部分中至少约5%的甘油三酯在甘油三酯中的所有sn_l、sn-2和sn_3三个位置上均含有二十二碳六烯酸。[0131]在一些实施方式中，本发明的分离的微生物(包括其突变株、变异株或重组株)在由该微生物所分离的一个或多个部分中包含脂肪酸分布。由该微生物所分离的一个或多个部分包括总脂肪酸部分、固醇酯部分、甘油三酯部分、游离脂肪酸部分、固醇部分、甘油二酯部分、极性部分(包括磷脂部分)及其组合。特定部分的脂肪酸分布可以包括与本文中所公开的该特定部分相关联的任意脂肪酸分布。
[0132]本发明涉及生产突变株的方法，其包括诱变本发明的任意一种微生物并分离突变型菌株。
[0133]培养物与分离的生物质
[0134]本发明涉及培养物，其包含本发明的一种或多种分离的微生物。用于接种、生长及回收微生物区系(诸如微型藻与破囊壶菌)的各种发酵参数在本领域中是已知。参见第5130242号美国专利，其通过引用全部并入本文。液态或固态培养基可以含有天然海水或人造海水。供异养型生长的碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、海藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪类、油类、甘油、乙酸钠和甘露糖醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母提取物、聚蛋白胨、麦芽提取物、肉提取物、酪蛋白胺基酸、玉米浸液、有机氮源、谷氨酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵及硝酸铵。
[0135]用于在ATCC登录号PTA-10212下所保藏微生物生长的典型的培养基示于表1中:
[0136] 表1:PTA-10212容器培养基
[0137]
【权利要求】
1.制备具有脂肪酸和一定浓度EPA的微生物的生物质的方法，其包含: (a)在发酵罐容器中发酵所述微生物，以产生生物质，其中所述微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；和 (b)调节容器中生物质的量，以在生物质中获得所期望的EPA水平。
2.制备具有脂肪酸和一定浓度EPA的微生物的生物质的方法，其包含: (a)在发酵罐容器中发酵所述微生物，以产生生物质，其中所述微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；和 (b)调节所述生物质上压强，以在生物质中获得所期望的EPA水平。
3.制备具有脂肪酸和一定浓度EPA的微生物的生物质的方法，其包含: (a)在发酵罐容器中发酵所述微生物，以产生发酵液和生物质，其中所述微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；和 (b)调节所述发酵液中温度，以在生物质中获得所期望的EPA水平。
4.制备具有脂肪酸和一定浓度EPA的微生物的生物质的方法，其包含: (a)在含有气体的发酵罐容器中发酵所述微生物，以产生生物质，其中所述微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；和 (b)调节所述气体中CO2水平，以在生物质中获得所期望的EPA水平。
5.制备具有脂肪酸和一定浓度EPA的微生物的生物质的方法，其包含: (a)在发酵罐容器中发酵所述微生物，以产生具有水相的发酵液和生物质，其中所述水相具有溶解的气体，其中所述微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌；和 (b)调节所述溶解的气体中的溶解CO2至>2%。
6.如权利要求1和3-5中任意一项所述的方法，其还包含调节所述生物质上压强，以在生物质中获得所期望的EPA水平。
7.如权利要求1、2和4-6中任意一项所述的方法，其还包含调节所述发酵液中温度，以在生物质中获得所期望的EPA水平。
8.在具有脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物的生物质中增加EPA浓度的方法，其包含: (a)在含有气体的发酵罐容器中发酵所述微生物，以产生生物质，其中所述微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌； (b)以足以提高生物质中EPA浓度的CO2补充所述气体。
9.如权利要求8所述的方法，其中CO2的量大于或等于腔室中气体的2%(摩尔)，并且所述生物质中EPA浓度增加至大于脂肪酸总重量的约4重量％。
10.如权利要求9所述的方法，其中CO2的量大于或等于腔室中气体的约5%到至多约20% (摩尔)。
11.如权利要求10所述的方法，其中CO2的量大于或等于容器中气体的约5%到至多约15% (摩尔)。
12.如权利要求9所述的方法，其中EPA浓度从大于脂肪酸总重量的约4重量％增加到至多约45重量％。
13.如权利要求11所述的方法，其中EPA浓度从大于脂肪酸总重量的约4重量％增加到至多约40重量％。
14.如权利要求12所述的方法，其中EPA浓度从脂肪酸总重量的约4重量％增加到脂肪酸总重量的约6重量％至约30重量％的范围。
15.如权利要求9所述的方法，其中EPA浓度从脂肪酸总重量的约15重量％增加到脂肪酸总重量的至多约40重量％。
16.如权利要求9所述的方法，其中EPA浓度增加到大于脂肪酸总重量的20重量％。
17.如权利要求9所述的方法，其中EPA浓度从脂肪酸总重量的约20重量％增加到至多约25重量％。
18.在具有脂肪酸和一定浓度的EPA的微生物的生物质中增加EPA浓度的方法，其包含: (a)在发酵罐容器中发酵所述微生物，以产生生物质； (b)在所述生物质上提供大于或等于大气压强以上0.5psi的压强，提供的时间足以增加所述生物中EPA的浓度。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述容器具有从约0.4psi到至多约30psi的顶空 压强。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述容器具有从约Ipsi到至多约30psi的顶空压强。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述容器具有从约Ipsi到至多约20psi的顶空压强。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述压强的提供时间至多约120小时。
23.如权利要求2所述的方法，其中所述生物质具有大于或等于10g/l的密度。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述生物质具有约10g/l到至多约250g/l的密度。
25.如权利要求3所述的方法，其中将所述温度被调节至小于约30°C。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述温度小于约22°C。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述温度为约21°C。
28.如权利要求1至27中任意一项所述的方法制得的生物质。
29.由权利要求28所述的生物质提取到的油，其中所述生物质由在ATCC登录号PTA-10208下保藏的分离的微生物产生，其中所述油包含脂肪酸，其中所述脂肪酸还包含ω-3多不饱和脂肪酸，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸以所述ω-3多不饱和脂肪酸总量的大约≤90重量％的量包含DHA和ΕΡΑ，并且EPA的量为EPA和DHA总量的约6重量％到至多约65重量％。
30.如权利要求29所述的油，其中EPA的量为EPA和DHA总量的约6重量％到至多约.28重量％。
31.如权利要求29所述的油，其中EPA的量为EPA和DHA总量的约36重量％到至多约65重量％。
32.如权利要求29所述的油，其中EPA的量为EPA和DHA总量的约28重量％到至多约.36重量％。
33.由权利要求28所述的生物质提取到的油，其中所述生物质由在ATCC登录号PTA-10212下保藏的分离的微生物产生，其中所述油包含脂肪酸，其中所述脂肪酸还包含DHA和EPA，并且EPA的量为EPA和DHA总量的约15重量％到至多约70重量％。
34.由权利要求28所述的生物质提取到的油，其中所述生物质由在ATCC登录号PTA-9695下保藏的分离的微生物产生，其中所述油包含脂肪酸，其中所述脂肪酸还包含ω-3多不饱和脂肪酸，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸以所述ω-3多不饱和脂肪酸总量的约50至70重量％的量包含DHA和ΕΡΑ，并且EPA的量为EPA和DHA总量的约5重量％到至多约60重量％。
35.如权利要求34所述的油，其中所述DHA和EPA的量为所述ω-3脂肪酸总量的约.60重量％。
36.制备具有脂肪酸和一定浓度EPA的微生物的生物质的方法，其包含: (a)在含有气体的 发酵罐容器中发酵所述微生物，以产生生物质，其中所述微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌，其中所述微生物包含产生具有脂肪酸总重量的至少3% EPA的生物质的破囊壶菌； (b)用CO2补充所述气体。
37.如权利要求2所述的方法，其中在调节所述生物质上压强之前测定所述生物质、EPA或DHA的量。
38.如权利要求3所述的方法，其中在调节所述发酵液中温度之前测定所述生物质、EPA或DHA的量。
39.如权利要求4所述的方法，其中在调节容器中CO2之前测定所述生物质、EPA或DHA的量。
40.如权利要求5所述的方法，其中在调节溶解的CO2之前测定所述生物质、EPA或DHA的量。
41.生产油的方法，所述方法包含制备如权利要求1-27和36-40中任意一项所述的生物质,并且从所述生物质中获得油。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述油从所述生物质中提取得到。
43.制备微生物的生物质的方法，所述微生物具有增加的浓度的EPA，所述方法包含使所述微生物在含有小于0.lmg/L维生素B12的培养基中生长，以产生生物质。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述培养基包含小于0.0 lmg/L维生素B12。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述培养基包含小于0.00lmg/L维生素B12。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述培养基包含小于0.000lmg/L维生素B12。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述培养基不包含维生素B12。
48.如权利要求43至47中任意一项所述的方法，其中所述培养基还包含以每50g的无脂生物质计小于Ig的酵母提取物。
49.如权利要求43至48中任意一项所述的方法，其中所述培养基还包含以每50g的无脂生物质计小于0.5g的酵母提取物。
50.如权利要求43至49中任意一项所述的方法，其中所述培养基还包含以每50g的无脂生物质计小于0.1g的酵母提取物。
51.如权利要求43至50中任意一项所述的方法，其中所述EPA浓度与由含有大于.0.lmg/L维生素B12的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度相比，增加了至少400%。
52.如权利要求44至50中任意一项所述的方法，其中所述EPA浓度与由含有大于0.01mg/L维生素B12的培养基中生长的微生物得到的生物质中EPA浓度相比，增加了至少300%。
53.如权利要求45至50中任意一项所述的方法，其中所述EPA浓度与由含有大于0.001mg/L维生素B12的培养基中生长的微生物得到的生物质中EPA浓度相比，增加了至少200%。
54.如权利要求46至50中任意一项所述的方法，其中所述EPA浓度与由含有大于0.0001mg/L维生素B12的培养基中生长的微生物所得到的生物质中EPA浓度相比，增加了至少100%。
55.制备具有升高浓度的EPA的微生物的生物质的方法，其包含使所述微生物在含有小于0.lmg/L钴的培养基中生长，以产生生物质。
56.如权利要求55所述的方法,其中所述培养基包含小于0.0 lmg/L的钴。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述培养基包含小于0.00lmg/L的钴。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述培养基包含小于0.000lmg/L的钴。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述培养基不含钴。
60.如权利要求43至59中任意一项所述的方法，其中所述微生物是破囊壶菌。
61.如权利要求43至60中任意一项所述的方法，其中所述微生物产生所述脂肪酸总重量的至少3% EPA。
62.如权利要求43至61中任意一项所述的方法，其中所述培养基具有至少5%的溶解CO2水平。
63.如权利要求43至62中任意一项所述的方法，其中所述培养基具有至少10%的溶解CO2水平。
64.如权利要求43至63中任意一项所述的方法，其中所述培养基具有至少15%的溶解CO2水平。
65.如权利要求43至64中任意一项所述的分离的生物质。
66.由如如权利要求43至65中任意一项所述的分离的生物质提取到的微生物油。
【文档编号】C12P7/64GK104011217SQ201280035935
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2011年7月21日
【发明者】约瑟夫·W·普菲弗三世, 乔恩·米尔顿·汉森, 约瑟·R·加西亚, 董晓, 保罗·沃伦·伯赫恩斯, 柯克·E·阿普特 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司