猴腺病毒和杂合腺病毒载体的制作方法
【专利摘要】本发明提供重组腺病毒载体、其免疫原性组合物和它们在医药中的应用，和用于产生重组腺病毒载体的方法。具体而言，本发明提供包含源自黑猩猩腺病毒AdY25的衣壳的腺病毒载体，其中所述衣壳将外源目的核苷酸序列的核酸分子包入衣壳。
【专利说明】猴腺病毒和杂合腺病毒载体
[0001]本发明涉及源自黑猩猩腺病毒的新腺病毒载体、其免疫原性组合物和它们在医药中的应用。
[0002]本文中引用的全部出版物、专利和专利申请以引用的方式完整并入本发明中。
【背景技术】
[0003]传统上，疫苗基于全灭活或减毒的病原体。然而，对于许多传染性疾病如疟疾，这种方案是不切实际的并且研究的焦点已经改变成开发仅表达病原体衍生的那些抗原的’亚单位疫苗’，所述抗原诱导与保护相关的免疫。
[0004]亚单位疫苗向免疫系统呈递抗原，而不引入完整的感染性生物。一种这样的方法涉及施用来自感染性生物的特定的分离蛋白质。然而，这项技术经常仅诱导弱免疫反应并且分离的蛋白质可能具有与在其正常环境下的蛋白质不同的三维结构，导致产生可能不识别该感染的生物的抗体。
[0005]因此已经开发利用病毒载体递送抗原的替代性方法。病毒是通过将它们的DNA转染至宿主细胞中并诱导宿主细胞表达病毒基因组而复制的专性胞内寄生物。这种繁殖策略已经用来通过产生携带一种或多种异源转基因的重组非复制型病毒载体而创造载体化疫苗。重组病毒基因组转染或转导至宿主细胞中导致异源转基因在宿主细胞中的表达。当异源转基因编码抗原时，例如，抗原在宿主细胞内部的表达可以通过宿主免疫系统诱发保护性的或治疗性免疫反应。就这一点而论，病毒载体可以作为有效的疫苗发挥作用。可选地，异源转基因可以编码基因的功能性等位基因，所述等位基因的表达可以在称作基因治疗的过程中用来抵消基因的有害等位突变基因的作用。
[0006]腺病毒特别适合作为病毒载体使用。腺病毒是无包膜病毒，直径大约90_100nm，包含核衣壳和线性双链DNA基因组。病毒核衣壳包含五邻和六邻衣壳蛋白。独特纤突与每个五邻体基部结合并辅助病毒通过宿主细胞表面上的柯萨奇病毒-腺病毒受体与宿主细胞附着。已经鉴定到超过50种腺病毒血清型毒株，它们大部分在人类中造成呼吸道感染、结膜炎和肠胃炎。并非整合至宿主基因组中，腺病毒通常在宿主细胞的细胞核中作为附加体元件复制。腺病毒的基因组包含4个早期转录单位(El、E2、E3和E4)，所述早期转录单位主要具有调节功能并且使宿主细胞准备进行病毒复制。该基因组也包含在单个启动子控制下的5个晚期转录单位(L1、L2、L3、L4和L5)，所述晚期转录单位编码结构蛋白，包含五邻体(L2)、六邻体(L3)、支架蛋白(L4)和纤突蛋白(L5)。基因组的每一端包含病毒复制必需的反向末端重复序列(ITR)。
[0007] 重组腺病毒最早开发用于基因治疗，但是由这些基因递送介质诱发的强烈和持久的转基因特异性免疫反应促使它们用作疫苗载体。除了是高度免疫原性的之外，腺病毒还为临床疫苗开发提供许多其他优点。腺病毒基因组相对小(在26和45kbp之间)，被充分表征并易于操作。单个转录单位El的缺失使得病毒不能复制，这在临床应用中增加其可预测性并减少副作用。重组腺病毒可以容纳相对大的转基因，在一些情况下高达8kb，允许亚单位设计的灵活性和具有相对宽的趋向性，这促进转基因递送至多种多样的细胞和组织。对于临床应用重要地，充分建立了用于放大生产并纯化重组腺病毒至高滴度的方法。因而迄今，C亚组血清型AdHu2或AdHu5已经主要地用作载体。
[0008]然而，第一代基于原始型人腺病毒AdHu5的疫苗载体在临床试验中显示欠佳的功效，尽管前临床数据令人鼓舞。随后发现大比例的成年人具有显著滴度的针对普通人血清型如AdHu2和AdHu5的中和抗体，原因在于天然感染。中和抗体可以通过阻断病毒进入宿主细胞中并因此阻断靶转基因递送来降低病毒载体疫苗的效力。
[0009]预先存在的抗载体免疫力的出现正在通过开发新腺病毒载体予以解决，所述新腺病毒载体基于人类群体较小可能已经暴露的血清型，包括黑猩猩源的那些血清型2’3。然而，因为人类群体中无法解释的免疫力、与人腺病毒交叉反应性的变化水平和转化细胞系中的次优生长，一些这类黑猩猩腺病毒载体具有有限的功效。此外，鉴于诱导针对载体的中和抗体可能阻止该载体针对另一种适应症再施用，具有可用于针对不同疾病进行免疫的一系列不同腺病毒载体是有利的。
[0010]因此，本 领域中持续需要高度免疫原性的非人类腺病毒载体，所述载体有效地递送靶转基因、使针对腺病毒血清型的预存免疫作用最小化并且在转化的细胞系中高效复制。
[0011]发明简述
[0012]在第一方面，本发明提供本文中称作AdY25的黑猩猩腺病毒的完整基因组序列。
[0013]在第二方面，本发明提供一种包含源自黑猩猩腺病毒AdY25的衣壳的腺病毒载体，其中所述衣壳包裹包含与表达控制序列可操作地连接的外源目的核苷酸序列和腺病毒包装信号序列的核酸分子，所述表达控制序列控制所述外源目的核苷酸序列在动物细胞中翻译、转录和/或表达。
[0014]第三方面提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含根据第二方面的腺病毒载体，任选地与一种或多种另外的有效成分、医药上可接受载体、稀释剂、赋形剂或佐剂组
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[0015]第四方面提供根据第二方面的腺病毒载体或根据第三方面的免疫原性组合物在医药中的应用。具体而言，提供腺病毒载体和免疫原性组合物用于递送转基因至宿主细胞中、诱发动物中的免疫反应、加强动物中的免疫反应、治疗或预防至少一种疾病、在动物中诱导将打破针对自身抗原的耐受性的免疫反应和基因治疗。
[0016]本发明的第五方面提供了编码根据本发明第二方面的腺病毒载体的多核苷酸序列。
[0017]本发明的第六方面提供用根据本发明第二方面的病毒载体转导的宿主细胞。
[0018]本发明的第七方面提供产生根据本发明第二方面的病毒载体的方法，优选地通过在细菌人工染色体(BAC)中产生AdY25的分子克隆而产生。
[0019]本发明的第八方面因此提供了包含根据本发明第五方面的多核苷酸序列的细菌人工染色体(BAC)克隆。
[0020]本发明的第九方面提供了产生根据本发明第二方面的病毒载体的包装细胞系。
[0021]本发明的第十方面提供除AdHu5之外的腺病毒载体，所述腺病毒载体具有包含来自AdHu5的E40rf4、E40rf6和E40rf6/7编码区的核酸分子。
[0022]附图[0023]本发明参考以下图进行描述，其中:
[0024]图1显示不同腺病毒血清型的(A)六邻体蛋白和(B)纤突蛋白的氨基酸序列的系统进化序列比对结果。将序列聚类成六个腺病毒组A-F。
[0025]图2显示基于不同物种的野生型腺病毒的全基因组核苷酸序列的系统进化序列比对结果。将序列聚类成六个腺病毒组A-F。
[0026]图3A是AdHu5和以下三种表达绿色荧光蛋白(GFP)的基于AdY25的载体的病毒产量(感染单位/ml)的柱状图:i) AdY25E4 野生型(“Y25E4wt”)；ii) AdY25E4AdHu50rf6(“Y25Ad5E40rf6”)和 iii) AdY25AdHu5E40rf4/6/7 (“AdChOXl”)。
[0027]图3B是GFP灶点与AdHu5、AdCh63、AdY25E4野生型抗六邻体滴度的比率的柱状图以及如图3C中所述的构建体A-E (均表达TIPeGFP抗原)。
[0028]图3C是详述E4修饰的AdY25载体构建体A、B、C、D和E的结构的表。
[0029]图3D是标记基因:基于AdChOXl的表达TIPeGFP的载体的六邻体滴度的比率的柱状图，该载体具有GFP或mCherry荧光转基因。全部数据均代表至少两个独立的实验。误差线显示均值和SBL
[0030]图4是与AdCh63和AdCh68相比，ChAdOXl的细胞免疫原性(斑点形成细胞(SFC)/百万)的图示。
[0031]图5是E4修饰对IFN-y脾ELlSpot反应(SFC/百万)的影响的图示，所述反应针对用IO8或IO6感染单位(ifu)的基于AdY25的载体肌内免疫Balb/c小鼠(4只/组)后2周的两个表位Pb9和PI5，所述载体具有以下E4区:i)野生型E4区(“E4wt”)；ii)来自AdHu5 的 E40rf6 (“E40rf6”)；或 iii)来自 AdHu5 的 E40rf4、6 和 7 (“E40rf4/6/7”)。
[0032]图6是柱状图，其显示来自(A)UK和(B)冈比亚的人血清中针对Y25Ad5E40rf6(图
6中称作“ChAdOXl”)和AdCh63的载体-中和抗体的阳性率。
[0033]图7是携带TIPeGFP抗原的ChAdOXl和基于AdCh68的载体的体液免疫原性的图示。在初免后56日，小鼠用IO6Pfu MVA-TIPeGFP加强免疫。采集血清并且a)初免后50日和b)加强免疫后10日，通过终点ELlSA测量反应。显示均值和显著性。通过单因素方差分析进行统计分析。点线指示测定法的检测限。
[0034]图8A是三个不同剂量的携带结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)Ag85A抗原的ChAdOXl载体的细胞免疫原性(斑点形成细胞(SFC)/百万个脾细胞)的图示。使用以合成肽刺激的脾细胞，通过IFN-y ELl点测定法测定针对Ag85A的细胞免疫反应，所述合成肽对应于Ag85A中已知的免疫优性的⑶4+T细胞H-2d限制性表位(pl5)。
[0035]图8B是三个不同剂量的携带结核分枝杆菌Ag85A抗原的ChAdOXl的细胞免疫原性(斑点形成细胞(SFC)/百万个脾细胞)的图示。使用以合成肽刺激的脾细胞，通过IFN-yELl点测定法测定针对Ag85A的细胞免疫反应，所述合成肽对应于Ag85A中已知的免疫优性的CD8+T细胞H-2d限制性表位(piI)。
[0036]图9是二个不同剂量的携带甲型流感病毒核蛋白(NP)和基质蛋白I (Ml)的ChAdOXl和HAdV-5的细胞免疫原性(斑点形成细胞(SFC)/百万个脾细胞)的图示。使用以合成肽刺激的脾细胞，通过IFN-y ELl点测定法测定针对核蛋白(NP)的细胞免疫反应，所述合成肽对应于NP中已知的免疫优性的CD8+T细胞H-2d限制性表位。
[0037]发明详述[0038]本发明涉及源自黑猩猩腺病毒AdY25的新腺病毒载体、其免疫原性组合物和它们在医药中的应用。
[0039]AdY25是已经由本发明人首次测序的黑猩猩腺病毒。核苷酸序列在SEQ ID N0.1中提供。
[0040]因此本发明的第一方面提供具有SEQ ID N0.1的序列的核酸分子。在一个实施方式中，核酸分子是分离的。
[0041]本领域技术人员将理解存在本文所述的全部核酸序列的同源物、等同物和衍生物。因此，本发明也包括具有与本文所述的核酸序列在它们的整个长度具有实质上同一性的序列的核酸分子。
[0042]本领域技术人员将理解本发明也可以包括本文中例举的那些特定核酸分子的变体。这些变体可以在自然界中出现，例如因为株系变异。例如，包括添加、置换和/或缺失。本领域技术人员也将理解，就遗传密码的简并性而言，本文中例举的特定核酸分子的变异将是可能的。优选地，变体与本文所述的核酸序列在它们的整个长度具有实质上同源性。
[0043]如本文所用，具有“实质上同一性”的核酸序列优选地与所述序列具有至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.1%、98.2%,98.3%,98.4%,98.5%,98.6%、98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%、99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 或 99.9%的同一性。合乎需要地，术语“实质上同一性”表示所述序列与本文所述的任何序列具有比现有核酸序列更大程度的同一性。
[0044]当出于确定同源性或同一性程度的目的比较核酸序列时，可以使用程序如BESTFIT和GAP (二者均来自Wisconsin遗传学计算机组(GCG)软件包)。例如，BESTFIT比较两个序列并产生最相似区段的最佳比对结果。GAP使得序列沿其整个长度对齐并且通过在任一个序列中插入空位(如果适宜)找到最佳比对结果。适当地，在本发明的情境下，当讨论核酸序列的同一性时，通过将序列沿其整个长度对齐进行比较。在已作必要的修正的情况下，以上适用于本申请公开的全部核酸序列。
[0045]优选地，根据第一方面的核酸分子具有与SEQ ID N0.1至少98%的同一性，更优选地具有与SEQ ID N0.1至少98.6%同一性。
[0046]优选地，根据第一方面的核酸分子包含选自由以下所组成的组中的一个或多个核苷酸序列；
[0047](a) SEQ ID N0.1的第18302至21130位核苷酸或与之具有实质上同一性的序列；
[0048](b)SEQ ID N0.1的第13891至15486位核苷酸或与之具有实质上同一性的序列；和
[0049](C)SEQ ID N0.1的第32290至33621位核苷酸或与之具有实质上同一性的序列。
[0050]这些核苷酸序列编码AdY25的(a)六邻体蛋白、(b)五邻体蛋白和(c)纤突衣壳蛋白，其外部区域决定病毒载体的特性，包括血清型。
[0051]根据第一方面的核酸分子还可以包含选自以下所组成的组中的一个或多个核苷酸序列:
[0052](a)编码六邻体蛋白的核苷酸序列，所述六邻体蛋白包含SEQ ID N0.2的氨基酸序列或与之具有至少98.2%同一性的序列；或编码与SEQ ID N0.1的第18302至21130位核苷酸编码的蛋白质具有至少98.2%同一性的六邻体蛋白的核苷酸序列；[0053](b)编码五邻体蛋白的核苷酸序列，所述五邻体蛋白包含SEQ ID N0.3的氨基酸序列或与之相同至少98.3%的序列；或编码与SEQ ID N0.1的第13891至15486位核苷酸编码的蛋白质具有至少98.3%同一性的五邻体蛋白的核苷酸序列；
[0054](C)编码纤突蛋白的核苷酸序列，所述纤突蛋白包含SEQ ID N0.4的氨基酸序列或与之至少99.1%同一的序列；或编码与SEQ ID N0.1的第32290至33621位核苷酸编码的蛋白质具有至少99.1%同一性的纤突蛋白的核苷酸序列。
[0055]包含与根据本发明第一方面的核酸分子互补的序列的核酸分子处于本发明的范围内。
[0056]本申请也包括仅与根据本发明第一方面的核酸分子的杂交的核酸分子。因而，用于杂交的条件是足以仅使这类核酸序列将保持杂交的严格条件。本领域技术人员将能够容易地确定这类条件。
[0057]核酸可以是DNA (包括cDNA)、RNA (包括mRNA或PNA (肽核酸))或其混合物。
[0058]表1提供本文中公开的野生型AdY25序列的汇总:
[0059]表1
[0060]
【权利要求】
1.一种包含源自黑猩猩腺病毒AdY25的衣壳的腺病毒载体,其中所述衣壳包裹包含与表达控制序列可操作地连接的外源目的核苷酸序列和腺病毒包装信号序列的核酸分子，所述表达控制序列控制所述外源目的核苷酸序列在动物细胞中翻译、转录和/或表达。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体缺失功能性El基因座。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于所述载体缺失E3基因座。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的载体，其特征在于所述载体包含来自另一个腺病毒血清型的至少一个异源E4开放阅读框。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述载体缺失天然E4基因座并且包含来自另一个腺病毒血清型的异源E4基因座或其开放阅读框。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于所述载体缺失天然E4基因座和包含来自AdHu5的E40rf6编码区。
7.根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述E4基因座包含天然E40rf1、E40rf2和E40rf3编码区和来自AdHu5的异源E40rf4、Orf6和Orf6/7编码区。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的载体，其特征在于所述外源目的核苷酸序列编码蛋白质或多肽。
9.根据权利要求8所述的载体，其特征在于所述蛋白质或多肽选自包括抗原、分子佐剂、免疫刺激性蛋白或重组酶的组。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的载体，其特征在于所述外源目的核苷酸序列是miRNA或免疫刺激性RNA序列。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的载体，其特征在于所述衣壳包含选自以下所组成的组中的一种或多种衣壳蛋白 (a)AdY25六邻体蛋白，包含SEQID N0.2的氨基酸序列或与之具有98.2%同一性的序列； (b)AdY25五邻体蛋白，包含SEQID N0.3的氨基酸序列或与之具有98.3%的同一性的序列；和 (c)AdY25纤突蛋白，包含SEQID N0.4的氨基酸序列或与之具有99.1%同一性的序列。
12.一种免疫原性组合物，包含根据权利要求1至11中任一项所述的腺病毒载体和任选地一种或多种另外的有效成分、医药上可接受载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。
13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其特征在于所述免疫原性组合物用于医药。
14.根据权利要求12所述的免疫原性组合物在制造用于医药的药物中的应用。
15.根据权利要求13所述的免疫原性组合物或根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述应用包括递送转基因至宿主细胞中。
16.根据权利要求13所述的免疫原性组合物或根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述应用包括在动物中诱发免疫反应。
17.根据权利要求13所述的免疫原性组合物或根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述应用包括在动物中加强免疫反应。
18.根据权利要求13所述的免疫原性组合物或根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述应用包括治疗或预防至少一种疾病。
19.根据权利要求13所述的免疫原性组合物或根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述应用包括在动物中诱导将打破针对自身抗原的耐受性的免疫反应。
20.根据权利要求13所述的免疫原性组合物或根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述应用包括基因治疗。
21.一种多核苷酸序列，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的病毒载体。
22.—种宿主细胞，其用根据权利要求1至11中任一项所述的病毒载体转导。
23.产生根据权利要求1至11中任一项所述的病毒载体的方法。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于所述方法包括将根据权利要求21所述的多核苷酸结合到细菌人工染色体(BAC)中以产生Ad-BAC载体的步骤。
25.—种细菌人工染色体(BAC)克隆，其包含根据权利要求21所述的多核苷酸序列。
26.一种包装细胞系，其产生根据权利要求1至11中任一项所述的病毒载体。
27.根据权利要求26所述的包装细胞系，其特征在于所述细胞包含在根据权利要求1至11中任一项所述的病毒载体中功能性缺失的任何基因的互补物。
28.—种除AdHu5之外的腺 病毒载体，其包含核酸分子，所述核酸分子包含来自AdHu5的 E40rf4、E40rf6 和 E40rf6/7 编码区。
29.根据权利要求28所述的腺病毒载体，其特征在于所述核酸分子另外包含天然E40rf 1、E40rf2 和 E40rf3 编码区。
30.根据权利要求28或29所述的腺病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体源自AdY25或AdCh68。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的腺病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体缺失El和E3基因座。
32.一种分离的核酸分子，在其整个长度范围内具有与SEQ ID N0.1至少90%同一性的序列。
33.根据权利要求32所述的分离核酸分子，其特征在于其包含选自由以下所组成的组中的一个或多个核苷酸序列； (a)SEQ ID N0.1的第18302至21130位核苷酸或与之具有90%同一性的序列；(b)SEQ ID N0.1的第13891至15486位核苷酸或与之具有90%同一性的序列；和 (c)SEQ ID N0.1的第32290至33621位核苷酸或与之具有90%同一性的序列。
34.一种分离的核酸分子，其具有选自以下的序列: (a)与根据权利要求32或33所述的序列互补的序列；和 (b)在严格条件下与根据权利要求32或33所述的序列杂交的序列。
【文档编号】C12N15/86GK103930551SQ201280036659
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年5月25日 优先权日:2011年5月25日
【发明者】马修·道格拉斯·詹姆斯·迪克斯, 马修·盖伊·科廷汉姆, 阿德里安·薇薇安·辛顿·希尔, 莎拉·吉尔伯特 申请人:Isis创新有限公司