诱导根的伸长或增加生物质的量的新基因及其应用的制作方法
【专利摘要】通过在植物中增加编码由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因等的表达，能够促进植物的根的伸长，增加生物质的量。
【专利说明】诱导根的伸长或增加生物质的量的新基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及诱导根的伸长、或增加生物质的量的新基因及其应用。
【背景技术】
[0002]已知适应沙漠等干燥地质的植物的根的伸长能力好，能够通过到达地下的深水系而避免干燥胁迫。如将承担该能力的基因导入一般作物，则可以促进植物的根的土壤水分、营养源的有效吸收，期待干燥胁迫抗性能力的提高以及产量的增加。此外，根也参与植物体的支持，因而根的发达对于强化植物制造性而言也是一个重要因素。 [0003]因而，传统上开展了对于调控植物的根的伸长的基因的研究。例如，专利文献I中采用T-DNA标记法，获得了与野生株相比根的伸长显著受到抑制的突变体，并记载了参与该表型的基因等的应用技术。此外，非专利文献I中作为通过基因导入法促进根的伸长的例子，记载了周期蛋白基因过表达的一个例子。非专利文献2中报告称，拟南芥的AtC0L3基因的敲除植物体具有侧根的伸长抑制这样的表型。
[0004]现有技术文献
[0005]专利文献
[0006]专利文献I日本国公开专利公报特开2004-187564号公报(平成16年7月8日公开)
[0007]非专利文献
[0008]非专利文献IDoerner et al., 1996Nature, 380:520-523
[0009]非专利文献2Datta et al.,2006Plant Cell, 18:70-84
【发明内容】
[0010]发明所要解决的问题
[0011]然而，参与根的发达的基因的探索目前还不能说是充分。因而，强烈需要发现诱导根的伸长的基因，以及该基因的应用技术、例如开发耐干性的植物体等技术的开发。
[0012]有鉴于上述问题点，本发明的目的在于，鉴定诱导根的伸长的新基因，并提供该基因的应用技术。
[0013]解决问题的方法
[0014]本发明等为实现上述目的进行了深入研究，对在沙漠等干燥地带生长的植物的基因信息以及分子机制进行了解析，结果发现了通过增强诱导表达根的伸长的基因。而且，在进一步进行研究时发现，通过用该基因转化植物，不仅能够增加根的伸长，还能够增加生物质的量，从而完成了本发明。即，本发明包括以下方案。
[0015](I)包含在植物中增加选自以下(a)~(e)中的任意基因的表达的步骤的、诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法:
[0016](a)编码由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
[0017](b)编码由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0018](c)编码由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0019](d)由SEQ ID NO:2所不的喊基序列构成的基因；
[0020](e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
[0021](2)(1)所述的诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其中，增加上述基因的表达的步骤包括导入选自上述(a)~(e)中的基因、制作转化植物细胞的步骤。
[0022](3)⑵所述的诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其还包括从上述植物细胞再生植物体的步骤。
[0023](4)用选自以下的(a)~(e)中的任意基因转化了的、诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物:
[0024](a)编码由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
`[0025](b)编码由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0026](c)编码由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0027](d)由SEQ ID NO:2所示的碱基序列构成的基因；
[0028](e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
[0029](5)选自以下的(a)~(e)中的任意基因的表达增加的、诱导了根的伸长、和/或增加了生物质的量的植物:
[0030](a)编码由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
[0031](b)编码由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0032](c)编码由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0033](d)由SEQ ID NO:2所示的碱基序列构成的基因；
[0034](e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
[0035](6) 一种植物，其为上述⑷或(5)所述的植物的后代、子孙、或克隆。
[0036](7)上述(4)~(6)中任一项所述的植物的繁殖材料。
[0037](8)包括增加选自以下的(a)~(e)中的任意基因的表达的步骤的、诱导植物的根的伸长的方法:
[0038](a)编码由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
[0039](b)编码由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因；
[0040](c)编码由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因；
[0041 ] (d)由SEQ ID NO:2所不的喊基序列构成的基因；
[0042](e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因。
[0043](9)包括增加选自以下的(a)~(e)中的任意基因的表达的步骤的、增加植物的生物质的量的方 法:
[0044](a)编码由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
[0045](b)编码由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0046](c)编码由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0047](d)由SEQ ID NO:2所示的碱基序列构成的基因；
[0048](e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
[0049](10) 一种植物体的制造方法，其包括
[0050]准备增加了选自以下的(a)~(e)中的任意基因的表达的转化植物的步骤，和
[0051]在上述转化植物的后代植物中，测定⑴根的伸长、和/或、(ii)生物质的量，选择该(i)根的伸长、和/或、(?)生物质的量显著提高的系统的步骤:
[0052](a)编码由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
[0053](b)编码由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或
(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0054](c)编码由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0055](d)由SEQ ID NO:2所示的碱基序列构成的基因；
[0056](e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
[0057](11)选自以下的(a)~(e)中的基因:
[0058](a)编码由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
[0059](b)编码由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或
(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0060](c)编码由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
[0061](d)由SEQ ID NO:2所示的碱基序列构成的基因；
[0062](e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
[0063](12)选自以下的(f)~(i)中的蛋白质:
[0064](f)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0065](g)由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有⑴诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性`的蛋白质；
[0066](h)由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质；
[0067](i)上述(11)所述的基因所编码的蛋白质。
[0068](13)包含上述(11)所述的基因的重组表达载体。
[0069](14)导入了上述(11)所述的基因或(13)所述的重组表达载体的转化体。
[0070](15) (14)所述的转化体，其为植物。
[0071](16) 一种增加植物的根的伸长诱导或生物质的量的试剂，其含有上述(11)所述的基因或(13)所述的重组表达载体作为有效成分。
[0072](17)选自以下的(j)~⑴中的多核苷酸:
[0073](j)由SEQ ID NO:3所述的碱基序列构成的多核苷酸；
[0074](k)由在SEQ ID NO:3所述的碱基序列中缺失、取代或者添加一个或数个碱基而得到的碱基序列构成、且具有作为响应于植物的干燥胁迫进行表达调控的启动子的功能的多核苷酸；
[0075](I)与由与上述(j)或(k)所述的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件杂交、且具有作为响应于植物的干燥胁迫进行表达调控的启动子的功能的多核苷酸。
[0076](18)具有上述(17)所述的多核苷酸作为启动子的重组表达载体。
[0077](19)导入了上述(17)所述的多核苷酸或(18)所述的重组表达载体的转化体。
[0078]发明的效果
[0079]本发明的基因是具有能够增加诱导植物的根的伸长的活性、或生物质的量的活性的新基因。根据本发明的基因及其应用技术，能够得到诱导了根的伸长的植物、或增加了生物质的量的植物等。该植物不仅具有例如耐干性以及稳定性提高的优点，还具有生物质增
产等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0080]【图l】(a)为显示土壤中的含水量的推移的图；(b)为显示干燥条件下与湿润条件下生长O~4日的野生种西瓜的根的状态的图。
[0081]【图2】显示干燥条件下生长的野生种西瓜与栽培种西瓜中的根的干燥重量的时间变化的图。
[0082]【图3】显示对于干燥胁迫下的野生种西瓜的根中的CLCOLl基因的时间表达、采用定量RT-PCR进行解析的结果的图。
[0083]【图4】显示采用了诱导载体的CLCOLl基因的野生种西瓜毛状根中的诱导表达的结果的图。
[0084]【图5】显示CLCOLl基因的表达水平的上升对毛状根的生长的效果的图。
[0085]【图6】显示对于强表达了CLCOLl基因的拟南芥转化体、对发芽后的根系发达进行解析的结果的图。
[0086]【图7】显示对用CLCOLl基因转化的植物以及对照植物的生长状况进行观察的结果的图。
[0087]【图8】显示对于用CLCOLl基因转化的植物以及对照植物、从钵中拔出植株、对根的伸长状况进行观察的结果的图。
[0088]发明的【具体实施方式】
[0089]以下，针对本发明的实施方式进行具体说明。而且，本说明书中记载的全部学术文献以及专利文献在本说明书中援引作为参考。在本说明书中，如无特殊提及，表示数值范围的“A~B”是指“A以上(包含A且大于A) B以下(包含B且小于B)”。
[0090]此外，在本说明书中使用时，碱基和氨基酸的符号适宜地采用IUPAC和IUB规定的单字母符号或三字母符号。在本说明书中使用时，术语“蛋白质”与“肽”或“多肽”可以互换使用。此外，术语“基因”与“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”可以互换使用，是指核苷酸的聚合体。这里，基因可以以DNA的形态(例如cDNA或基因组DNA)、或RNA (例如mRNA)的形态存在。DNA或RNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(有义链)，也可以是非编码链(反义链)。此外，基因可以化学合成，也可以变更密码子利用性(Codon usage)使得编码的蛋白质的表达提高。当然，编码相同氨基酸的密码子之间也可以发生取代。此外，基因只要是编码蛋白质即可，包括具有基于遗传密码的简并的任意碱基序列的DNA。
[0091]〈1.基因、蛋白质〉
[0092]本发明中的基因是选自以下的(a)~(e)中的基因。
[0093](a)编码由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
[0094](b)编码由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(?)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；[0095](c)编码由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因；
[0096](d)由SEQ ID NO:2所不的喊基序列构成的基因；
[0097](e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
[0098]此外，本发明的蛋白质是选自以下的⑴~⑴中的蛋白质。
[0099](f)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0100](g)由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有⑴诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质；
[0101](h)由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质；
[0102](i)上述(a)~(e)中任一项所述的基因所编码的蛋白质。
[0103]上述(a)~(e)的基因编码具有诱导植物的根的伸长的活性、或增加植物的生物质的量的活性的蛋白质，即上述(f)~(i)所述的蛋白质。因而，例如，通过在植物中增加这些基因的表达，能够促进植物的根的伸长、或增加植物的生物质的量。
[0104]首先，针对上述(a)的基因以及上述(f)的蛋白质进行具体说明。SEQ ID N0:1显示野生种西瓜(Citrullus lanatus sp.Nol01117-1)来源的CLCOLl蛋白质的氨基酸序列。CLCOLl蛋白质是由337个氨基酸组成的蛋白质，推测作为C0NSTANS样转录因子发挥功能。目前尚未充分了解CLCOLl蛋白质的功能，本发明人此次发现了其具有诱导(促进)根的伸长、或增加植物的生物质的量的功能。
[0105]上述野生种西瓜是在沙漠等干燥地带生长的，已知其即使在严酷的干燥条件下也具有根伸长的能力，对于干燥胁迫具有高抗性能力。如后述的实施例所示，此次本发明人发现:在该植物的根、特别是根尖端部(RootChip)，CLCOLl基因在干燥胁迫初期被诱导表达。此外，序列信息解析的结果，鉴定了 CLCOLl基因编码C0NSTANS样转录因子。
[0106]在CLCOLl基因在野生种西瓜毛状根中被诱导表达时，与非诱导的对照植物相比，促进了根的伸长。此外，相反地，当在野生种西瓜毛状根中制作了功能抑制系统时，根的伸展受到了抑制。而且，当在拟南芥中制作了稳定地过表达CLCOLl基因的系统时，主根的伸展得到了促进。由这些结果可知，CLCOLl基因作为野生种西瓜的应答干燥条件的根的伸长促进调控的关键因子发挥功能。此外，在用上述基因转化植物时，可知植物的生物质的量能够增加。
[0107]通过利用本基因，通过土壤水分、营养源的有效吸收，能够实现干燥胁迫抗性能的提高、作物产量的增加，并且通过用于植物的根的培养细胞系，能够进行有用物质的高效率制造。
[0108]上述(b)的基因意指该基因编码下述蛋白质，其并不限于具体序列，所述蛋白质是相对于具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质，功能上等同的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直系同源、部分肽、或与其他蛋白质、肽的融合蛋白质，且该蛋白质具有诱导根的伸长的活性(即上述(g)的蛋白质)。
[0109]在本说明书中“具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质”是指:具有通过在植物(包括培养细胞)中表达，诱导(促进)植物的根的伸长和/或发达、特别是主根的伸长和/或发达的功能的蛋白质。而且，表达该蛋白质的组织可以是根，但不限于此。即也可以说，在植物内表达目的基因编码的蛋白质的情况下，该蛋白质具有诱导植物的根(或根来源的细胞)的伸长、促进植物的根(根来源的细胞)的伸长速度(增殖速度)的活性。此外，在阻碍了植物中的目的基因的表达、功能的情况下，该活性可以作为抑制该植物的根的伸长的活性来进行评价。植物中的目的基因的表达抑制、功能阻碍，例如可以按照常规方法，通过公知的基因破坏株的制作、反义技术的利用来进行。
[0110]此外，“根”是指将植物体固定、支持于根基(例如大地)，此外从其吸收成分的器官。例如，不仅包含单子叶植物的须根、双子叶植物的主根，还包含不定根、气根、支柱根、板根、附着根、寄生根、块根、吸水根、呼吸根、牵引根、收缩根。
[0111]在本说明书中“生物质的量”是指与植物个体的整体、部分、个别器官、或者其组合相关的量。作为植物个体的整体、部分、或者个别器官，可以列举出例如，全体、地上部、根、茎、叶、果实、种子、胚、胚珠、子房、苗端、花药、花粉、穗等。此外，作为量，可以列举出例如，大小、长度、宽度、重量、面积、或体积等。因而，作为生物质的量的例子，可以列举出全体重、地上部重、产量、茎径、茎数、杆长、叶面积、叶数、穗数、一穗粒数、穗长、最大穗长、或全穗重等。此外，“增加”是指任何这些生物质的量单独、或多个组合地增加。作为增加的指标，可以通过例如，与对照植物(亲本植物、非转化体等)相比较，考察植物体的生物质的量来进行评价。
[0112]这里，作为可缺失、取代、或者添加的氨基酸的数目，只要不丧失上述功能，对其个数没有限制。是指采用定点诱变法等公知的突变导入法能够缺失、取代、或者添加的程度的数目。通常是30个氨基酸以内，优选20个氨基酸以内，更优选10个氨基酸以内，最优选5个氨基酸以内(例如5，4，3，2，1个氨基酸)。导入了突变的蛋白质是否赋予植物希望的形状，可以通过使编码该蛋白质的基因表达，并考察该植物的根的伸长是否得到促进、或者植物的生物质的量是否增加来进行判断。此外，这里所称的“突变”主要是指通过定点诱变法等人工导入的突变，但也可以是天然存在的同样的突变。
[0113]在突变的氨基酸残基中，优选突变成氨基酸侧链的性质保守的其他氨基酸。例如，作为氨基酸侧链的性质，可以列举出疏水性氨基酸(A、1、L、M、F、P，W、Y、V)、亲水性氨基酸具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L，1、P)、具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸及酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱侧链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。而且，例如，利用突变矩阵(mutational matrix)将氨基酸进行分类也是公知的(Taylorl986,J,Theor.Biol.119,205-218 ；Sambrook, J.et al., Molecular Cloning3rd ed.Α7.6_Α7.9，Cold Spring Harbor Lab.Press, 2001)。如将该分类简要总结如下,贝U可以列举出脂肪族氨基酸(L、1、V)、芳香族氨基酸(H、W、Y、F)、带电氨基酸(D、E、R、K、H)、带正电氨基酸(R、K、H)、带负电氨基酸(D、E)、疏水性氨基酸(H、W、Y、F、M、L，1、V、C、A，G、T、K)、极性氨基酸(T、S、N、D、E、Q、R、K、H、W、Y)、小型氨基酸(P、V、C、A、G、T、S、N、D)、微小氨基酸(A、G、S)以及大型(非小型)氨基酸(Q、E、R、K、H、W、Y、F、M、L、I)。而且，上述括号内均为氨基酸的单字母符号。
[0114]已知具有相对于某氨基酸序列通过缺失、添加I个或多个氨基酸残基、和/或用其他氨基酸取代进行修饰而得到的氨基酸序列的多肽，能够保持其生物学活性。而且，目标氨基酸残基更优选突变成具有尽量多的共通性质的氨基酸残基。
[0115]在本说明书中“功能上等同”是指:作为对象的蛋白质具有与CLCOLl蛋白质等同(同一和/或类似)的生物学功能、生化学功能。在本说明书中，作为CLCOLl蛋白质的生物学功能、生化学功能，可以列举出例如诱导根的伸长的功能、增加植物的生物质的量的功能。生物学性质还可以包括表达的部位的特异性、表达量等。
[0116]上述(c)的基因也是指编码下述蛋白质的基因，对其具体序列没有限定，所述蛋白质是相对于具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质，功能上等同的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直系同源、部分肽、或与其他蛋白质、肽的融合蛋白质等，且具有诱导植物的根的伸长的活性的、和/或增加植物的生物质的量的活性(即上述(h)的蛋白质)。
[0117]氨基酸序列的同源性是指在整个氨基酸序列(或者功能表达所必要的区域)中，具有至少80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、更优选、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上的序列的同一性。序列的同源性可以利用BLASTN(核酸水平)、BLASTX(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol., 215:403-410,1990)来确定。该程序基于 Karlin以及 Altschul 的算法 BLAST (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 87:2264-2268,1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:5873-5877,1993)。在利用BLASTN对碱基序列进行解析的情况下，参数是例如score=100、wordl ength=12。此外,在利用BLASTX对氨基酸序列进行解析的情况下，参数是例如score=50、wordlength=3。此外,在利用Gapped BLAST程序对氨基酸序列进行解析的情况下，可以按照Altschul等(Nucleic Acids Res.25 =3389-3402,1997)的描述来进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的缺省参数。这些解析方法的具体方法是公知的。为了使比较对象的碱基序列或氨基酸序列排列成最适状态，可以容许添加或缺失(例如间隙等)。
[0118]此外，在本说明书中“同源性”是指性质类似的氨基酸残基数的比例(homology、positive等)，更优选为一致的氨基酸残基数的比例(identity)。而且,关于氨基酸的性质如上述。
[0119]关于上述(d)的基因，SEQ ID NO:2不出了编码SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列的CLC0L1蛋白质的基因的碱基序列(ORF)。由全长1014个碱基组成，末尾的TAA为终止密码子。
[0120]上述(e)基因是指与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有诱导植物的根的伸长的活性、和/或增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
[0121]可以认为CLC0L1基因是参与根的伸长的关键因子，因而在整个维管束植物中广泛存在。即，本发明的基因也包括存在于各种植物中的、CLC0L1基因的同源基因。这里，作为用于分离同源基因的本领域技术人员熟知的方法，可以列举出杂交技术(Southern，E.Μ.，Journal of Molecular Biology, Vol.98, 503,1975)、聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki,R.Κ.，et al.Science，vol.230，1350-1354，1985，Saiki, R.K.et al.Science，vol.239，487-491,1988)。即，对于本领域技术人员而言，以CLCOLl基因的碱基序列(例如，SEQ IDNO:2所述的DNA)或其一部分作为探针、或者以与CLCOLl基因特异性杂交的寡核苷酸作为引物，从各种植物中分离CLCOLl基因的同源基因是通常能够进行的。
[0122]这里，严格条件是指:对于所称的碱基序列形成特异性双链的多核苷酸，而不形成非特异性双链得多核苷酸的条件。换言之，在同源性高的核酸之间、例如完全匹配的杂交物的熔点(Tm值)至低15°C、优选10°C、更优选5°C低的温度的范围的温度进行杂交的条件。例如可以列举出，在一般的杂交用缓冲液中以68°C、20小时的条件进行杂交的条件。作为一例，可以列举出:在由 0.25M Na2HPO4, pH7.2,7%SDS, ImM EDTA，I XDenhardt’ s 溶液组成的缓冲液中、温度60~68°C、优选65°C、更优选68°C的条件下进行16~24小时杂交，再于由20mMNa2HP04，pH7.2，1%SDS，ImM EDTA组成的缓冲液中、温度60~68°C、优选65°C、更优选68°C的条件下进行15分钟的洗涤2次的条件。作为其他例子，可以列举出:在含25%甲酰胺、更严格的条件中50%甲酰胺、4XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)、50mM HepespH7.0、10XDenhardt’ s溶液、20μ g/ml变性鲑鱼DNA的杂交溶液中，42°C预杂交过夜后，添加标记的探针，42°C保温过夜，由此来进行杂交。此后的洗涤中的洗涤液和温度条件可以在“1XSSC、0.1%SDS、37°C”左右、更严格的条件“0.5XSSC、0.1%SDS、42°C ”左右、再严格的条件“0.2XSSC、0.1%SDS、65°C”左右实施。这样，杂交的洗涤条件越严格，就越能够期待分离出与探针序列具有高同源性的DNA。只是，上述SSC、SDS和温度的条件的组合为示例，本领域技术人员能够通过适宜组合决定杂交的严格度的上述或者其他要素(例如探针浓度、探针长度、杂交反应时间等)，实现与上述同样的严格度。例如，本领域技术人员通过参照Molecular Cloning(Sambrook, J.et al., Molecular Cloning:a Laboratory Manual2nded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,IOSkyline Drive Plainview,NY(1989))等，能够容易地获得这样的基因。
[0123]此外，上述(e)基因在与上述(d)基因(SEQ ID NO:2所述的碱基序列)的同源性方面，优选具有至少80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、更优选、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列的同一性。而且，与SEQ ID NO:2所述的碱基序列的同源性可以通过FASTA检索、BLAST检索来确定。多核苷酸的碱基序列可以采用Science，214:1205(1981)中记载的双脱氧法来确定。
[0124]基因组DNA以及cDNA的制备可以由本领域技术人员利用常规手段来进行。基因组DNA可以例如这样制备:从植物抽提基因组DNA，制作基因组文库(作为载体可以利用质粒、噬菌体、粘粒、BAC、PAC等)，将其展开，使用基于上述基因(例如SEQ ID NO:2所述的基因)制备的探针，通过进行菌落杂交或者噬菌斑杂交，得到该克隆。此外，通过制作上述基因的特异性引物，并利用其进行PCR，也可以进行制备。此外，cDNA可以例如这样制备:基于从植物抽提的mRNA合成cDNA，将其插入λ ZAP等载体来制作cDNA文库，将其展开，像上述一样进行菌落杂交或者噬菌斑杂交、或进行PCR来制备。
[0125]作为由上述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的直系同源，可以示例出例如以下。
[0126]SEQ ID NO:4示出了栽培种西瓜中的CLC0L1蛋白质的同源蛋白质的氨基酸序列。本蛋白质具有与上述CLC0L1蛋白质完全同一的氣基酸序列。因而，可以说该蛋白质也具有诱导根的伸长的功能。而且，如后述的实施例所示，栽培种西瓜与野生种西瓜相比不耐干燥，此外，无法确认干燥应答性的根系发达和基因的表达上升。这种差异可以推断是因为栽培种西瓜与野生种西瓜的启动子序列的差异。SEQ ID NO:5示出了编码本蛋白质的ORF的碱基序列。
[0127]SEQ ID NO:6示出了黄瓜中的CLCOLl蛋白质的直系同源的氨基酸序列。本蛋白质是由337个氨基酸组成的蛋白质，同样是C0NSTANS样转录因子。在利用BLASTN进行同源性解析时，显示出与CLCOLl蛋白质非常高的同源性(Length=1014、Score=639bits (1649),Expect=0.0, Method !Compositional matrix adjust.1dentities=326/337 (96%),Positives=329/337(97%))。由此可以说该SEQ ID NO:6所示的蛋白质也具有参与根的伸长的功能。此外，SEQ ID NO:7示出了编码本蛋白质的ORF的碱基序列。
[0128]而且，虽然全长的氨基酸序列不明，但在甜瓜中也存在CLCOLl蛋白质的直系同源。在公开的甜瓜 unigene (cDNA)的 DB(http://www.1cug1.0rg/cgi_bin/ICuGI/tool/blast, cgi)中，使用BLASTN(eXpect〈le-2)针对CLCOLl蛋白质的氨基酸序列进行同源性检索。其结果，发现了与CLCOLl蛋白质显示非常高的同源性的序列(DB登录号:MU46046(Length=719Score=380bits(977), Expect(3)=e-112, Method:Compositional matrix adjust.1dentities=183/187(97%)，Positives=183/187 (97%))。可以说该甜瓜的推定直系同源也具有参与根的伸长的功能，其在本发明的范围内。
[0129]此外，在NCBI的nrDB中进行同源性检索时，发现了与上述CLC0L1基因的同源性高的多个基因。以下示出同一性(identities) 60%以上、同源性(positives) 70%以上的那些。
[0130]【表1】
[0131]`
【权利要求】
1.一种诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其包括在植物中增加选自以下(a)~(e)中的任意基因的表达的步骤: (a)编码由SEQID NO:I所不的氣基酸序列构成的蛋白质的基因； (b)编码由在SEQID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有⑴诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (c)编码由与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (d)由SEQID NO:2所不的喊基序列构成的基因； (e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
2.权利要求1所述的诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其中，上述增加基因的表达的步骤包括导入选自上述(a)~(e)中的基因，制作转化植物细胞的步骤。
3.权利要求2所述的诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其还包括从上述植物细胞再生植物体的步骤。
4.用选自以下的(a)~(e)中的任意基因进行了转化且诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物: (a)编码由SEQID NO:I所不的氣基酸序列构成的蛋白质的基因； (b)编码由在SEQID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有⑴诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (c)编码由与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (d)由SEQID NO:2所不的喊基序列构成的基因； (e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
5.一种诱导了根的伸长、和/或增加了生物质的量的植物，其中，选自以下的(a)~(e)中的任意基因的表达增加: (a)编码由SEQID NO:I所不的氣基酸序列构成的蛋白质的基因； (b)编码由在SEQID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有⑴诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (c)编码由与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (d)由SEQID NO:2所不的喊基序列构成的基因； (e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
6.一种植物，其为权利要求4或5所述的植物的后代、子孙或克隆。
7.权利要求4~6中任一项所述的植物的繁殖材料。
8.一种诱导植物的根的伸长的方法，其包括增加选自以下的(a)~(e)中的任意基因的表达的步骤: (a)编码由SEQID NO:1所不的氣基酸序列构成的蛋白质的基因； (b)编码由在SEQID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因； (c)编码由与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因； (d)由SEQID NO:2所不的喊基序列构成的基因； (e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因。
9.一种增加植物的生物质的量的方法，其包括增加选自以下的(a)~(e)中的任意基因的表达的步骤: (a)编码由SEQID NO:1所不的氣基酸序列构成的蛋白质的基因； (b)编码由在SEQID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因; (c)编码由与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (d)由SEQID NO:2所不的喊基序列构成的基因； (e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
10.一种植物体的制造方法，其包括 准备增加了选自以下的(a)~(e)中的任意基因的表达的转化植物的步骤，和 在上述转化植物的后代植物中，测定(i)根的伸长、和/或(ii)生物质的量，选择该(i)根的伸长、和/或(ii)生物质的量显著提高的系统的步骤: (a)编码由SEQID NO:I所不的氣基酸序列构成的蛋白质的基因； (b)编码由在SEQID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有⑴诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (c)编码由与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (d)由SEQID NO:2所不的喊基序列构成的基因； (e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
11.选自以下的(a)~(e)中的基因: (a)编码由SEQID NO:1所不的氣基酸序列构成的蛋白质的基因； (b)编码由在SEQID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (c)编码由与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因； (d)由SEQID NO:2所不的喊基序列构成的基因； (e)与由与上述(a)~(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
12.选自以下的(f)~⑴中的蛋白质: (f)由SEQID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质； (g)由在SEQID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有⑴诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质； (h)由与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质； (i)由权利要求11所述的基因编码的蛋白质。
13.包含权利要求11所述的基因的重组表达载体。
14.导入了权利要求11所述的基因或权利要求13所述的重组表达载体的转化体。
15.权利要求14所述的转化体，其为植物。
16.一种增加植物的根的伸长诱导或生物质的量的试剂，其含有权利要求11所述的基因或权利要求13所述的重组表达载体作为有效成分。
17.选自以下的(j)~(I)中的多核苷酸: (j)由SEQ ID NO:3所述的碱基序列构成的多核苷酸； (k)由在SEQ ID NO:3所述的碱基序列中缺失、取代或者添加一个或数个碱基而得到的碱基序列构成、且具有作为响应于植物的干燥胁迫进行表达调控的启动子的功能的多核苷酸； (I)与由与上述(j)或(k)所述的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件杂交、且具有作为响应于植物的干燥胁迫进行表达调控的启动子的功能的多核苷酸。
18.具有权利要求17所述的多核苷酸作为启动子的重组表达载体。
19.导入了权利要求17所述的多核苷酸或权利要求18所述的重组表达载体的转化体。
【文档编号】C12N5/10GK103703131SQ201280036950
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年7月24日 优先权日:2011年7月25日
【发明者】梶川昌孝, 横田明穗, 明石欣也, S.G.玛帆雅尼, P.莫素皮, S.M.奇特, 加藤纪夫 申请人:国立大学法人奈良先端科学技术大学院大学, 博茨瓦纳共和国