用于在仿生环境中培养细胞的装置和方法

用于在仿生环境中培养细胞的装置和方法
【专利摘要】本文公开了用于仿生流动装置的装置和方法。所述仿生流动装置包括微流体流动通道和与所述流动通道流体连接的入口，所述入口用于使流体流入流动通道。所述流动通道具有至少一个表面，所述表面具有在其中形成的拓扑图。选择流动通道的至少一个表面的拓扑图以使在表面以上的细胞层中的细胞实现排列、行为或形态。所述细胞排列、行为或形态至少部分地通过至少一个表面的拓扑图确定。
【专利说明】用于在仿生环境中培养细胞的装置和方法
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年6月15日提交的临时申请美国申请61/497376的优先权，在此将其全文引入作为参考。
发明领域
[0003]一般来说，本发明涉及用于在仿生环境中培养细胞的装置和用于制造和使用所述装置的方法。
_4] 发明背景
[0005]在受控制的体外条件下生长的肾细胞在肾功能性研究、医疗装置制备和药物测试中具有广泛的潜在应用。肾细胞培养允许生物学家研究肾相关的细胞的功能并观察细胞对各种条件的响应。高度受控制的肾环境可以用于执行肾的一些功能以帮助肾病患者，并且可以被组织工程使用以生成移植到肾病患者的特异性肾组织。此外，肾细胞可以在用于肾疗法和用于测试药物的肾毒性的药物开发中使用。受控制的体外环境也可以用于其它类型的细胞，如用于刺激干细胞的期望的细胞功能。
[0006]这些应用中的每一种得益于引起体外细胞在体内准确复制细胞的条件。尽管存在用于培养肾细胞的装置和方法，但传统的体外肾细胞环境是静态的，未能解释肾单位中经历的剪切应力。此外，以前的肾细胞培养的体外环境没有提供仿生刺激(cue)，如由细胞外基质(ECM)提供的那些，因此在以前的环境中生长的细胞不具有它们在体内所具有的表型和形态，例如细胞形状或排列。肾单位中肾细胞的适当排列，尤其是细胞之间的细胞间连接的形成对于肾细胞执行其过滤和吸收功能是必要的。因此，在先前的装置中生长的肾细胞未能模拟肾单位的条件。
[0007]发明概沭
[0008]因此，需要可以用于生长更好地复制肾单位的体内条件的肾细胞培养物的仿生装置。特别地，控制流动通道(flow channel)中细胞的几何形状和排列的装置可以用于生成比先前的装置更加接近地模拟体内条件的体外环境。微制造和微成型技术可以用于制备人工细胞基底，所述人工细胞基底具有模拟细胞外基质(ECM)对肾细胞具有的作用的微_、亚微-和纳米-拓扑图案(topographical pattern)。拓扑表面的设计允许紧密控制在基底上面生长的细胞。这种表面图案(surface patterning)连同附加的流动通道参数如通道高度、通道横截面积和流速一起可以用于生成紧密模拟特异性细胞类型的体内环境的高度受控制的体外条件。
[0009]因此，本文公开了用于仿生流动装置的装置和方法。仿生流动装置包括微流体流动通道和与流动通道流体连接的入口，所述入口用于允许流体流入流动通道。流动通道具有至少一个表面，所述表面具有在其中形成的拓扑图(topography )。选择流动通道的至少一个表面的拓扑图以使置于表面以上的细胞层中的细胞实现排列、行为或形态。细胞排列、行为或形态至少部分地通过至少一个表面的拓扑图来确定。
[0010]在一些实施方案中，选择表面的拓扑图以促进细胞层中的细胞与至少一个表面的粘着增加。表面的拓扑图可以包括宽度为至少约5μπι或更小的嵴。流动通道的至少一个表面可以具有至少两种不同的拓扑图。表面拓扑图可以引起细胞层的排列、行为或形态复制肾脏中细胞的排列、行为或形态。
[0011]在一些实施方案中，所述装置还可以包括用于使流体通过入口流过流动通道的流体源。所述流体诱导了对细胞层的剪切应力。对细胞层的剪切应力可以产生模拟细胞类型在体内经历的剪切应力的剪切应力的水平。在一些其它实施方案中，对细胞层的剪切应力可以为小于0.02达因/cm2。可以使通道的形状为使得流体流过流动通道产生沿着流动通道长度的多个剪切应力值。在使流体流过流动通道之后，可以拆卸流动通道用于检查细胞层。
[0012]在一些实施方案中，将亲细胞物质置于基底的部分上，用于在该部分中生长细胞层，所述基底的部分形成流动通道的表面。在一些实施方案中，将疏细胞(cytophobic)物质置于基底表面的部分上，用于阻止细胞层在基底的部分中的生长；所述基底的该部分可以形成或可以不形成流动通道的表面的部分。
[0013]在一些实施方案中，所述装置包括具有至少一个表面的至少第二流动通道，所述表面具有在其中形成的拓扑图。
[0014]根据另一个方面，本发明涉及用于模拟器官性能的方法。所述方法包括提供具有表面的流动装置和具有排列、行为或形态的细胞层的步骤，所述表面具有拓扑图。所述方法还包括选择导致对细胞层的多个水平的剪切应力的流速，和引导流体以选择的流速流过(flow through)流动通道的步骤,所述多个水平的剪切应力引起细胞模拟它们在体内表现的形态、行为或排列。 所述流动装置可以类似于以上描述的流动装置。
[0015]所述方法可以包括在使流体流过流动通道后拆卸流动通道并检查细胞层。可以固定细胞以保存细胞层用于分析。如果流过流动通道的流体包含治疗剂，则所述方法还包括分析细胞以确定治疗剂对细胞层的功效。如果流体包含潜在的毒素，则所述方法还包括分析细胞以确定潜在的毒素对细胞层的毒性。
[0016]根据另一个方面，本发明涉及用于生成仿生流动的系统。所述系统包括具有至少一个表面的流动通道，所述表面具有在其中形成的拓扑图。选择流动通道的表面的拓扑图以使在表面上生长的细胞层中的细胞实现排列、行为或形态，并且所述拓扑图可以促进细胞层中的细胞与至少一个表面的粘着增加。所述系统还包括入口和流体注入系统。所述入口与流动通道流体连接，用于允许流体流入流动通道。流体注入系统使流体流过流动通道，以诱导对细胞层的剪切应力。
[0017]在一些实施方案中，所述系统包括温度控制器，所述温度控制器用于使微流体流动通道的温度保持在几乎恒定的温度下。在一些实施方案中，所述系统包括观察设备，所述观察设备用于观察细胞层中的细胞。如果流动通道由至少第一流动通道层和第二流动通道层形成，则所述系统也可以包括固定装置，用于将第一流动通道层密封到第二流动通道层。
[0018]附图的简要i兑明
[0019]参考以下附图，可以从以下说明性描述中更好地理解所述系统和方法，其中:
[0020]图1A是在平整表面上生长的肾细胞培养物的图形；
[0021]图1B是根据本发明的说明性实施方案，在具有拓扑图案的基底上生长的肾细胞培养物的图形；[0022]图1C是在平整表面上生长的肾细胞培养物的照片；
[0023]图1D是根据本发明的说明性实施方案，在具有拓扑图案的基底上生长的肾细胞培养物的照片；
[0024]图2A是根据本发明的说明性实施方案，具有仿生流动通道的装置的分解实体模型；
[0025]图2B是根据本发明的说明性实施方案，具有来自图2A的仿生流动通道的组装的装置的实体模型；
[0026]图2C是根据本发明的说明性实施方案，用于与图2B的仿生流动装置一起使用的流动系统的方块图；
[0027]图3是根据本发明的说明性实施方案，用于生成和使用图2的仿生流动通道之一的方法的流程图；
[0028]图4是根据本发明的说明性实施方案，说明用于制备具有拓扑图案的基底的方法的一系列图形；
[0029]图5是是根据本发明的说明性实施方案，用于在表面上生成亲细胞和疏细胞区域并在所述表面上生长细胞的方法的流程图；
[0030]图6A、6B、6C和6D是具有不同的拓扑特征的仿生流动通道的四个说明性实施方案的横截面的透视图；
[0031]图7A是其拓扑图案具有渐变的基底的说明性实施方案的透视图；
[0032]图7B、7C和7D是其拓扑图案沿着通道具有变化的流动通道表面的三个说明性实施方案的俯视图；
[0033]图8A、8B、8C、8D、8E和8F是具有不同的拓扑图案的六个基底的说明性实施方案的透视图；
[0034]图9A和9B是根据本发明的说明性实施方案，用于使用图2的仿生流动通道之一的方法的流程图；
[0035]图10A、10BU0C和IOD是本发明的仿生流动装置的说明性实施方案的示意图；
[0036]图1OE是粘着到ECM涂覆区域的、通道内的细胞的相衬图像；
[0037]图1lA是在本发明的说明性实施方案中用于制造嵴/沟图案表面的镍合金模具的照片；
[0038]图1lB是在本发明的说明性实施方案中的聚苯乙烯基底的照片；
[0039]图1lC是在图16B中显示的聚苯乙烯基底边缘剖面图(edge profile)的照片；
[0040]图12A显示了暴露于2小时的0、0.02或1.0达因/cm2FSS的空白(顶排)或拓扑(底排)基底上生长的HK-2细胞的汇合层的荧光标记的核。箭头表示在拓扑基底上的沟的方向；
[0041]图12B是显示与沟对齐的％细胞的条形图。前三个条代表在空白基底(无拓扑图)上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞。后三个条代表在拓扑基底上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/cm2FSS的细胞；
[0042]图13A和13B显示了在空白或拓扑基底上培养并暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞的ZO-1表达的代表性图像；
[0043]图14A是显示沿着细胞周长整合并通过细胞周长归一化的ZO-1强度的条形图。前三个条代表在空白基底(无拓扑图)上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞。后三个条代表在拓扑基底上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞；
[0044]图14B是显示沿着细胞周长测量的ZO-1强度的标准偏差的条形图。前三个条代表在空白基底(无拓扑图)上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞。后三个条代表在拓扑基底上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞。
[0045]某些说明性实施方案的描述
[0046]为了提供本发明的全面理解，现将描述某些说明性实施方案，包括用于在仿生环境中培养细胞的装置和方法。然而，本领域中的普通技术人员将会理解，可以改进和修饰本文描述的系统和方法使其适用于正在处理的应用，并且本文描述的系统和方法可以用于其它适合的应用，并且此种其他添加和修饰将不背离其范围。
[0047]仿生流动装置包括具有流体入口和流体出口的流动通道。为了生成复制器官结构，如肾单位的流动通道，使器官的细胞的培养物在流动通道的至少一侧上生长。在体内，细胞外基质(ECM)在结构上支持肾单位的细胞并引起肾单位衬里细胞以特定排列彼此对齐(align with each other)。在仿生流动通道中，对细胞在其上生长的表面的拓扑图的适当选择使细胞具有将通过ECM生成的对齐(alignment)、形态、行为和/或排列。具有拓扑图的仿生流动通道不仅可以用于复制肾脏结构，而且可以复制经历流动的其它结构。例如，仿生流动装置的使用可以证明对于诸如以下的细胞的研究是有用的:膀胱中的尿道上皮细胞；小肠和大肠中的刷状缘细胞和肠上皮细胞；心脏、静脉、动脉和毛细血管中的血管内皮细胞；淋巴系统的毛细管和管道中的内皮细胞；肝上皮细胞或经历流体流动的任意其它结构。当研究许多这些系统 时，其可以有益于体外细胞更好地模拟体内细胞的形态、对齐或排列。
[0048]示例性的表面拓扑图对肾细胞的作用显示于图1中。图1A和IB显示了肾细胞培养物的两个图形。图1C和ID显示了拍摄的肾细胞培养物的两张照片。图1A是在平整表面104上生长的肾细胞102的培养物的图形，所述平整表面104如典型的培养板、培养皿或培养瓶。传统地，肾细胞在流体静态状态下培养，不经历剪切应力或拓扑图。即使肾细胞经历流体流动和剪切应力，所述细胞也不会对齐并且它们的形态不会受到影响。如在图1A中所见的，通常培养的肾细胞102不具有特征形状或对齐，而是出现随机对齐。另外，细胞102不形成超结构并且通常不彼此连接。图1C是在平整表面104上生长的肾细胞的培养物的照片。图1C说明了细胞102是如何缺乏特征形状和随机排列的。
[0049]图1B是在具有示例性拓扑图案的表面154上生长的肾细胞152的培养物的图形。所述表面具有比细胞152窄的沟156和嵴158。每个细胞152跨越几个沟156和嵴158。像细胞外基质(ECM)—样，这种沟和嵴的图案引起肾细胞152延长并且使它们自身与嵴平行对齐，促进细胞间连接并促进细胞152粘着到表面154。在左侧给出的比例尺(scale)给出了肾脏的一些上皮细胞的近似尺寸；然而，肾细胞的实际尺寸在整个肾单位中变化很大。细胞152的形态也是示例性的；一些类型的肾细胞，特别是柱状细胞更多是矩形的。在图1B中，沟156和嵴158的宽度大约相同，尽管它们不必如此。对于延长的宽度为约10 μ m的肾细胞如细胞152而言，沟156和嵴158的宽度应为约5 μ m或更小使得延长的细胞与多于一个的嵴接触。在图1B中，沟156和嵴158的宽度为约800nm。沟156和嵴158可以比这窄，但如果它们窄于约20 μ m,则纹理(texture)将对肾细胞具有有限的作用。然而，拓扑图案的大小取决于细胞的大小。此外，对于某些应用而言，可期望的是具有与细胞宽度有关的更宽的沟以便细胞在沟中静息(rest)。在此种实施方案中，嵴可以比沟窄。在其它实施方案中，嵴可以比沟宽。
[0050]除了控制细胞的方向和形状之外，沟和嵴还引起肾细胞152连接在一起并形成与在相同的时间段内生长在无纹理或“空白”基底上的细胞相比更加明确和发育更好的连接。在体内观察到的紧密细胞连接对于肾单位适当地过滤血液和重吸收水分而言是必要的。紧密连接阻止包括液体和溶解的溶质的流体进入细胞之间，因此离开肾单位的壁的流体必须通过上皮细胞，所述上皮细胞可以控制通过的流体和/溶质。当表面拓扑图，如沟156和嵴158引起汇合细胞对齐使得它们的膜可以连接以形成该流体不可渗透的屏障时，这些细胞连接也在体外环境中形成。流动通道可以以关于表面154的任意方向排列以引起流体以任意方向在细胞152上流动。在图6所示的实施方案中，流体平行或垂直于沟156和嵴158流动。
[0051]图1D是说明本发明的一个可能的实施方案的结果的照片。图1D显示了在具有拓扑纹理154的基底上生长的肾细胞培养物。如在说明图1B中，细胞152表现出以更加对齐和紧密连接的方式生长。
[0052]图2A是显示用于在仿生环境中培养细胞的装置200的示例性实施方案的分解实体模型。图2B显示了组装的装置。装置200包括基底202和具有三个流动通道212的流动池204。基底202的顶部具有在图2中未显示的拓扑图案，如图1B的图案。流动通道212的壁也可以或供选择地具有拓扑图，如图1B的图案。在基底202的刨平侧(surfaced side)顶端是细胞层，细胞优选地限制在流动池202中的流动通道212下面的基底区域。基底202可以由热塑性塑料，如聚苯乙烯或聚酰亚胺，生物可降解性聚酯，如聚己内酯(PCL)，或软的弹性体，如聚癸二酸甘油酯(PGS)制备。基底202可以供选择地由聚二甲硅氧烷(PDMS)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或由例如碳或氧化锌形成的纳米管或纳米线制备。基底202可以由可以在其上形成微米级拓扑图并且可以在其上生长细胞的任意材料制备。拓扑图案的实例显示在图7A-7D和图8A-8F中，并且关于图4描述了用于化学图案化基底202的方法。关于图5描述了用于生长细胞层的方法。
`[0053]流动池204具有从底部插入流动池204的三个流动通道212。在一些实施方案中，流动池由半透明材料如PDMS制备。供选择地，流动池可以由其他材料，如以上列出的任意可能的基底材料制备。可以采用3D实体打印机或光刻法在流动池204中生成流动通道212。如图2B中所显示的，当组装时，基底202形成流动通道的底壁，并且流动池中的流动通道212包括顶壁和两个侧壁。顶壁、底壁和侧壁在本文中共同称为“壁”。流动池204和基底202可以可逆地连接(reversibly attached),使得在实验开始后,可以移除流动池204，从而可以检查细胞层。入口 214和出口 216允许管道(tubing)进入流动通道212。入口 214提供了用于将流体引入到流动通道212的通路，而出口 216提供了用于移除已经通过流动通道212的流体的通路。进入入口 214的管道连接控制注入到流动通道212的体积和速度的工具，如具有注射泵的注射器。流体注入系统可以是在装置200安装在其中的仿生流动系统的部分。图2C中显示了示例性流系统240的框图。所述流动系统可以包括附加的特征，如温度控制系统和观察设备。通过入口端口 214引入的流体流生成了沿着流动通道212的壁并且越过沿着通道的底部的培养的细胞的均匀的层流。[0054]穿过培养的细胞的层流模拟肾单位内的流体的流动并将剪切应力引入流体和培养的细胞之间。调节流体的流速引起剪切应力沿着细胞改变。在肾近端小管中，细胞经历的流体剪切应力(FSS)为约I达因/cm2 ;然而，经历的剪切应力沿着肾单位的长度改变。已经观察到的剪切应力低至0.015达因/cm2，因此通过控制流速能够改变剪切应力允许使用单一的装置设计制备一系列仿生条件。对于具有宽度w和高度h的矩形通道和具有粘度μ的流体而言，壁剪切应力τ和流速Q具有以下关系:
【权利要求】
1.一种装置，其包括: 微流体流动通道，所述微流体流动通道具有至少一个表面，所述表面具有在其中形成的拓扑图；和 与所述流动通道流体连接的入口，所述入口用于允许流体流入流动通道；其中 选择所述流动通道的表面的拓扑图以使配置在表面以上的细胞层中的细胞实现至少部分地通过至少一个表面的拓扑图确定的排列、行为或形态。
2.权利要求1所述的装置，其中，选择所述表面的拓扑图以促进细胞层中的细胞与至少一个表面的粘着增加。
3.权利要求1所述的装置，所述装置还包括用于使流体通过入口流过流动通道的流体源，其中，所述流体诱导对细胞层的剪切应力。
4.权利要求3所述的装置，其中，在使流体流过流动通道之后，可以拆卸流动通道用于检查细胞层。
5.权利要求3所述的装置，其中，将所述流体源配置为使流体以导致对细胞层的剪切应力水平小于0.01达因/cm2的流速流动。
6.权利要求3所述的装置，其中，使所述通道的形状为使得流体流过流动通道产生沿着流动通道长度的多个剪切应力值。
7.权利要求1所 述的装置，其中，所述流动通道的至少一个表面具有至少两个不同的拓扑图。
8.权利要求1所述的装置，其中，所述表面的拓扑图包括宽度为约5μ m或更小的嵴嵴。
9.权利要求1所述的装置，其包括配置在基底的部分上的亲细胞物质，所述亲细胞物质用于在基底的部分中生长细胞层，并且其中所述基底的部分形成流动通道的表面。
10.权利要求1所述的装置，其包括配置在基底的表面的部分上的疏细胞物质，所述疏细胞物质用于阻止细胞层在基底的部分中的生长，并且其中所述基底的部分不形成任何流动通道的表面。
11.权利要求1所述的装置，其包括配置在基底的表面的部分上的疏细胞物质，所述疏细胞物质用于阻止细胞层在基底的部分中生长，并且其中所述基底的部分形成至少一个流动通道的表面的一部分。
12.权利要求1所述的装置，其中，所述表面拓扑图使细胞层的排列、行为或形态复制肾脏中细胞的排列、行为或形态。
13.权利要求1所述的装置，其还包括至少第二流动通道，所述至少第二流动通道具有第二流动通道的至少一个表面，所述第二流动通道的至少一个表面具有在其中形成的拓扑图。
14.一种用于模拟器官性能的方法，所述方法包括: 提供流动装置，所述流动装置包括: 流动通道，所述流动通道具有至少一个表面，所述表面具有在其中形成的拓扑图；和 配置在至少一个表面上的细胞层，所述细胞层具有排列、行为或形态； 选择流体的流速，所述流速为，当流体流过流动通道时，导致对细胞层的一定水平的剪切应力，所述一定水平的剪切应力使细胞模拟它们在体内表现的形态、行为或排列；和 引导流体以选择的流速流过流动通道。
15.权利要求14所述的方法，其中，至少部分地通过至少一个表面的拓扑图确定细胞层中的细胞的排列、行为或形态，并且选择至少一个表面的拓扑图以实现这样的排列、行为或形态。
16.权利要求15所述的方法，其中，选择表面的拓扑图以促进细胞层中的细胞与至少一个表面的粘着增加。
17.权利要求14所述的方法，其中，使所述流动通道的形状为使得流体流动产生沿着流动通道的长度的多个剪切应力水平，所述方法还包括: 选择产生对细胞层的多个水平的剪切应力的流速，所述对细胞层的多个水平的剪切应力模拟这样的细胞在体内器官的不同位置中将会经历的剪切应力。
18.权利要求14所述的方法，其还包括在使流体流过流动通道之后拆卸流动通道并检查细胞层。
19.权利要求14所述的方法，其还包括固定所述细胞以保存细胞层用于分析。
20.权利要求14所述的方法，其中，所述流体包含治疗剂，所述方法还包括分析细胞以确定治疗剂对细胞层的功效。
21.权利要求14所述的方法，其中，所述流体包含潜在的毒素，所述方法还包括分析细胞以确定潜在的毒素对细胞层的毒性。
22.一种用于生成仿生流动的系统。所述系统包括: 微流体流动通道，所述微流体流动通道具有至少一个表面，所述表面具有在其中形成的拓扑图，其中，选择流动通道的表面的拓扑图以使在表面上生长的细胞层中的细胞实现排列、行为或形态； 与所述流动通道流体连接的入口，所述入口用于允许流体流入流动通道；和 流体注入系统，所述流体注入系统用于使流体流过流动通道以诱导对细胞层的剪切应力。
23.权利要求22所述的系统，其中，选择所述流动通道的表面的拓扑图以促进细胞层中的细胞与至少一个表面的粘着增加。
24.权利要求22所述的系统，其还包括温度控制器，所述温度控制器用于使微流体流动通道的温度保持在几乎恒定的温度下。
25.权利要求22所述的系统，其还包括观察设备，所述观察设备用于观察细胞层中的细胞。
26.权利要求22所述的系统，其中，所述流动通道由至少第一流动通道层和第二流动通道层形成，并且其中所述系统还包括固定装置，所述固定装置用于将第一流动通道层密封到第二流动通道层。
【文档编号】C12M3/00GK103764813SQ201280037203
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年6月15日 优先权日:2011年6月15日
【发明者】约瑟夫·L·查莱斯特, 埃尔斯·弗罗利希, 杰弗里·T·伯恩斯坦 申请人:查尔斯斯塔克布料实验室公司