棒状细菌转化体和使用该转化体的缬氨酸的制造方法
【专利摘要】一种转化体，其通过在宿主棒状细菌中导入下述(a)、(b)和(c)中任意一种以上的DNA而得到，(a)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA或者其类似物；(b)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA或者其类似物；(c)来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的DNA或者其类似物。
【专利说明】棒状细菌转化体和使用该转化体的缬氨酸的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及缬氨酸生产技术。更详细而言，涉及为了赋予缬氨酸生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体和使用该转化体的高效的缬氨酸的制造方法。
【背景技术】
[0002]在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。
[0003]作为必需氨基酸之一的缬氨酸，是作为医药、食品、化妆品的成分、家畜饲料添加物等有用的物质。以往，缬氨酸通过发酵法、蛋白质的水解来生产。
[0004]但是，对于利用以可再生资源为原料的发酵法的缬氨酸生产，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段数非常多，并且代谢酶受会到作为产物的缬氨酸的反馈抑制，由于上述等原因，生产率低已成为工业生产的课题。
[0005]作为利用基因重组菌的缬氨酸生产技术，可列举出专利文献1、2所述的技术。
[0006]专利文献I中公开了使用谷氨酸棒杆菌来制造缬氨酸的技术，所述谷氨酸棒杆菌中编码与L-异亮氨酸的生物合成有关的酶的基因、编码与L-亮氨酸的生物合成有关的酶的基因、和编码与D-泛酸的生物合成有关的酶的基因弱化或缺失，编码与L-缬氨酸的生物合成有关的酶的基因以 使其表达增加的方式进行了突变。
[0007]另外，专利文献2中公开了利用使转氨酶C的活性增加后的棒杆菌属细菌来制造缬氨酸的技术。
[0008]但是，专利文献1、2的方法的缬氨酸的生产率在实用上还不充分。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献
[0011]专利文献1:日本特表2009-521960
[0012]专利文献2:日本特表2008-514191
【发明内容】
[0013]发明所解决的课题
[0014]本发明的课题在于，提供能够以糖类为原料高效地制造缬氨酸的微生物、和使用该微生物以糖类为原料高效地制造缬氨酸的方法。
[0015]解决课题的手段
[0016]棒状细菌通过糖酵解将葡萄糖分解为丙酮酸。对于棒状细菌而言，进一步利用乙酰羟酸合成酶将丙酮酸代谢为2-乙酰乳酸，利用乙酰羟酸异构还原酶将2-乙酰乳酸代谢为2，3- 二羟基异戊酸，利用二羟酸脱水酶将2，3- 二羟基异戊酸代谢为2-酮异戊酸，利用转氨酶将2-酮异戊酸代谢为缬氨酸。
[0017]本发明人发现，在棒状细菌中导入由序列号37的碱基序列构成的乙酰羟酸合成酶基因、由序列号57的碱基序列构成的乙酰羟酸异构还原酶基因和由序列号40的碱基序列构成的亮氨酸脱氢酶基因中任意一种以上的基因后的转化体，以糖类为原料高效地生产
缬氨酸。
[0018]由序列号37的碱基序列构成的DNA是谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因(ilvBN基因)的突变体，由序列号57的碱基序列构成的DNA是谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因(ilvC基因)的突变体。
[0019]另外，由序列号40的碱基序列构成的DNA是编码亮氨酸脱氢酶的DNA，在棒状细菌中可催化本来由转氨酶催化的由2-酮异戊酸向缬氨酸的转变。需要说明的是，转氨酶将氨基从其他氨基酸转移到2-酮异戊酸，与此相对，亮氨酸脱氢酶可以将氨基从无机NH4+转移到2-酮异戊酸。
[0020]另外，本发明人发现，该转化体中存在于宿主棒状细菌的染色体上的乳酸脱氢酶基因破坏或缺失时，可以进一步闻效地生广纟颜氣酸。
[0021]另外，本发明人发现，对于该转化体而言，使其在还原条件下的反应液中以实质上不增殖的状态反应的情况，与使其在好气性的反应液中边增殖边反应的情况相比，缬氨酸生产效率更高。
[0022]本发明基于上述见解而完成，提供以下的转化体和缬氨酸的制造方法。
[0023]第I项.一种转化体，其通过在宿主棒状细菌中导入下述(a)、(b)和(C)中任意一种以上的DNA而得到，
[0024](a)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA ；
[0025](b)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有乙酰羟酸异构还原酶活性的多肽的DNA ；
[0026](c)来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。
[0027]第2项.如第I项所述的转化体，其中，
[0028]在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA为由序列号37的碱基序列构成的DNA，
[0029]在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA为由序列号57的碱基序列构成的DNA，
[0030]来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的DNA为由序列号40的碱基序列构成的DNA。
[0031]第3项.如第I项或第2项所述的转化体，其中，还导入了来源于谷氨酸棒杆菌的编码二羟酸脱水酶的DNA、或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的DNA。
[0032]第4项.如第I项~第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为乳酸脱氢酶基因被破坏或缺失的棒状细菌。
[0033]第5项.一种谷氨酸棒杆菌VAL4 (保藏号:NITE BP-1122)转化体。
[0034]第6项.一种缬氨酸的制造方法，其包括:
[0035]使第I项~第5项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤；和
[0036]回收反应液中的缬氨酸的步骤。
[0037]第7项.如第6项所述的缬氨酸的制造方法，其中，在反应步骤中，转化体实质上不增殖。
[0038]发明效果
[0039]本发明的转化体为导入了特定序列的乙酰羟酸合成酶基因、特定序列的乙酰羟酸异构还原酶基因、和特 定序列的亮氨酸脱氢酶基因中任意一种以上的基因的棒状细菌，由此，与以往公知的转化体相比，可以从糖类更高效地制造缬氨酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1是示出实施例中使用的载体的构建的图。
[0041]图2是示出实施例中使用的载体的构建的图。
【具体实施方式】
[0042]以下，对本发明进行详细说明。
[0043](1)转化体
[0044]宿丰
[0045]棒状细菌为BargeysManual of Determinative Bacteriology(伯杰氏系统细菌学手册)，Vol.8，599 (1974)中定义的一组微生物，只要是在通常的需氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。
[0046]作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)> 产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、角军烧棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。其中，从安全且缬氨酸生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒杆菌。作为优选的菌株，可以列举:谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) R 株(FERM P-18976)、ATCC13032 株、ATCC13869 株、ATCC13058 株、ATCC13059 株、ATCC13060 株、ATCC13232 株、ATCC13286 株、ATCC13287 株、ATCC13655 株、ATCC13745 株、ATCC13746 株、ATCC13761 株、ATCC14020 株、ATCC31831 株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)等。其中，优选 R 株(FERM P-18976) ,ATCC13032 株、ATCC13869 株。[0047]需要说明的是,根据分子生物学的分类,黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium Iilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl, W.等，Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T, “Brevibacterium flavum”DSM2041I,“Brevibacteriumlactofermentum，，，DSM20412and DSM1412, and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.1nt J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等，棒状细菌的分类，发酵与工业，45:944-963 (1987)]。
[0048]旧分类的乳糖发酵短杆菌ATCC13869株、黄色短杆菌的MJ-233株(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41株(FERM BP-1498)等也是优选的谷氨酸棒杆菌。
[0049]作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872 株)等。
[0050]作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010 株、ATCC4336 株、ATCC21056 株、ATCC31250 株、ATCC31738 株、ATCC35698 株)等。
[0051]作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210 株、ATCC27289 株)等。
[0052]作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如 N0.239 株(FERM P-13221))、藤黄微球菌(Micrococcus Ieuteus)(例如 N0.240 株(FERM P-13222))、服微球菌(Micrococcus ureae)(例如 IAM1010 株)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(例如 IF03764 株)等。
[0053]另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏或缺失株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高缬氨酸的生产率或抑制副产物的生成。
[0054]其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。对于该基因破坏株而言，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使由丙酮酸向乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因的破坏株，特别优选谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。
[0055]这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，W02005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。
[0056]乙酰羟酸合成酶基因(ilvBN基因)
[0057]乙酰羟酸合成酶是催化下述反应的酶。
[0058]2丙酮酸一2-乙酰乳酸
[0059]在本发明中，作为乙酰羟酸合成酶基因，可以使用在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA。其中，优选由序列号37的碱基序列构成的DNA。
[0060]另外，在本发明中还可以使用:在严格条件下与由在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA或者序列号37的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA(类似物)。
[0061] 本发明中，“严格条件”是指一般的条件、例如Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆实验指南)，第二版,1989, Vol2, pll.45中记载的条件。具体而言,是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5~10°C的温度下发生杂交的情况。
[0062]另外，在本发明中还可以使用:由与在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA或者由序列号37的碱基序列构成的DNA的碱基序列的同一性为90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上的碱基序列构成、并且编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA (类似物)。
[0063]碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社七、才、f^ >制)计算出的值。
[0064]对于乙酰羟酸合成酶活性，可以将IOOmM磷酸钾(pH7.5)、50mM丙酮酸钠、IOmMMgCl2、0.1mM硫胺素焦磷酸、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸和被测酶混合，并以可示出丙酮酸的吸收的333nm( ε = 17.5/M *cm)下的减少为指标来测定。将I分钟形成I μ mo I的2-乙酰乳酸的活性设定为I单位的乙酰羟酸合成酶活性。
[0065]在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA或者由序列号37的碱基序列构成的DNA的类似物，例如可以通过使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交从其他生物种的DNA文库中选择，由此，可以以高概率得到编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA。
[0066]乙酰羟酸异构还原酶某闵(ilvC某闵)
[0067]乙酰羟酸异构还原酶是催化下述反应的酶。
[0068]2-乙酰乙酸一2，3- 二羟基异戊酸
[0069]在本发明中，作为乙酰羟酸异构还原酶基因，可以使用在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA。其中，优选由序列号57的碱基序列构成的DNA。
[0070]另外，在本发明中还可以使用:在严格条件下与由在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA或者序列号57的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有乙酰羟酸异构还原酶活性的多肽的DNA(类似物)。
[0071]另外，在本发明中还可以使用:由与在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA或者由序列号57的碱基序列构成的DNA的碱基序列的同一性为90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上的碱基序列构成、并且编码具有乙酰羟酸异构还原酶活性的多肽的DNA (类似物)。
[0072]对于乙酰羟酸异构还原酶活性，可以将IOOmM磷酸钾(pH7.5) UOmM乙酰乳酸、5mMMgCl2、0.2mM NADPH和被测酶混合，并以可示出NADPH的吸收的340nm( ε = 6220/M.cm)下的减少为指标来测定。将I分钟形成I μ mol的2，3- 二羟基异戊酸的活性设定为I单位的乙酰羟酸异构还原酶活性。
[0073]亮氨酸脱氢酶基因
[0074]在本发明中，可以使用来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因。其中，优选由序列号40的碱基序列构成的DNA。
[0075]另外，在本发明中还可以使用:在严格条件下与由来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因(DNA)或序列号40的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA(类似物)。
[0076]另外，在本发明中还可以使用:由与来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因(DNA)或序列号40的DNA的碱基序列的同一性为90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上的碱基序列构成、并且编码具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA(类似物)。
[0077]对于亮氨酸脱氢酶活性，可以将IOOmM甘氨酸/Na0H(pH9.5)、10mM2_酮异戊酸、200mM氯化铵、0.2mM NADH和被测酶混合，并以可示出NADH的吸收的340nm( ε = 6220/M.cm)下的减少为指标来测定。将I分钟形成I μ mol的缬氨酸的活性设定为I单位的亮氨酸脱氢酶活性。
[0078]如上所述，本发明的转化体为将下述(a)~(C)的基因中任一项以上导入宿主棒状细菌而得的菌株，
[0079](a)在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的基因、或其类似物；
[0080](b )在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的基因、或其类似物；
[0081 ] (c)来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因、或其类似物。
[0082]导入基因的组合可以为(a)与(b)的组合、(a)与(C)的组合、(b)与(C)的组合、(a)与(b)与(C)的组合中的任意一种。其中，优选(a)与(b)与(C)的组合。
[0083]二羟酸脱水酶基因
[0084]另外，在任意一种情况下都优选还向宿主中导入来源于谷氨酸棒杆菌的二羟酸脱水酶基因(特别是由序列号43的碱基序列构成的DNA)、或其类似物，由此，缬氨酸的生产率
进一步提闻。
[0085]类似物包括:在严格条件下与由序列号43的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的DNA、由与序列号43的碱基序列的同一性为90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上的碱基序列构成并且编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的DNA。
[0086]对于二羟酸脱水酶活性，可以以由2，3- 二羟基异戊酸形成2-酮异戊酸时伴随2-酮异戍酸增加的340nm下的吸光度上升为指标来测定(Dennis H.F.等，The roleand properties of the iron-sulfur cluster in Escherichia coli dihydroxy-aciddehydratase.J.Biol.Chem.，268:14732-14742 (1993))。活性测定用反应液可使用 50mMtris盐酸缓冲液pH8.0、10禮氯化镁、611112，3-二羟基异戊酸。可以在30°C下将酶液I添加到反应液从而开始反应，从反应液的吸光度减少的斜率与不含2，3- 二羟基异戊酸的反应液的吸光度减少的斜率之差，利用摩尔吸光系数190M—1Cirf1计算出活性值。
[0087]用于转化的载体的构建
[0088]将通过PCR扩增得到的编码乙酰羟酸合成酶的DNA、编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA和编码亮氨酸脱氢酶的DNA分别克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。
[0089]作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举:来源于乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum) 2256 的 pAM330 [日本特开昭 58-67699]、[Miwa，K.等，Cryptic plasmidsin glutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和[Yamaguchi, R.等,Determination of the complete nucleotide sequence of theBrevibacterium lactofermentum plasmid pAM330and the analysis of its geneticinformation.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267 (1985)]、来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13058 的 pHM1519[Miwa, K.等,Cryptic plasmids in glutamic acid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48: 2901-2903 (1984)]和 pCRY30 [Kurusu，Y.等，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.App1.Environ.Microbiol.57:759-764 (1991)]、来源于谷氨酸棒杆菌T250的pCG4 [日本特开昭57-183799]、[Katsumata, R.等，Protoplast transformation of glutamate-producingbacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311 (1984)]、pAGl、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭 62-166890]、pEKO、pEC5、pEKExl [Eikmanns，Β.J.等，Afamily of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors forcloning, controlled gene expression, and promoter probing.Gene, 102:93-98(1991)]
坐 寸ο
[0090]作为优选的启动子，可以列举来源于谷氨酸棒杆菌R的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(IdhA)的启动子PldhA等,其中，优选PgapA。
[0091]作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB TIT2终止子。
[0092]转化
[0093]转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu, Y.et al.，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447 (1990)]和[Vertes A.A.etal., Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。
[0094]转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。
[0095]作为碳源，可以列举:葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1~约10 (w/v% )即可。
[0096]作为氮源，可以列举:氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉膏、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1~约10(W/v% )即可。
[0097]作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01~约l(w/v% )即可。
[0098]作为营养物质，可以列举例如肉膏、蛋白胨、多价蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1~约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。
[0099]培养基的pH优选约5~约8。
[0100]作为优选的微 生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui, M.et al., Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutami cum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite, ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]
坐寸ο
[0101]培养温度设定为约15°C~约45°C即可，培养时间设定为约I天~约7天即可。
[0102]宿主染色体基因的破坏或缺失
[0103]如前所述，优选宿主棒状细菌中存在于其染色体上的乳酸脱氢酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因、丙酮酸羧化酶基因和马来酸脱氢酶基因中的一种以上被破坏、或缺失，由此可以进一步高效地制造缬氨酸。
[0104]通过制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，使缺失型基因与染色体上的基因之间发生同源重组，由此能够将染色体上的基因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有:使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。
[0105]具体而言，例如通过J.Mol.Microbiol.Biotechnol., Vol.8, 243-254 (2004)所述的方法可以获得乳酸脱氢酶基因破坏或缺失的棒状细菌。[0106](II)缬氨酸的制造方法
[0107]通过包括使上述说明的本发明的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤、和回收反应液中的缬氨酸的步骤的方法可以制造缬氨酸。
[0108]微牛物的增葙
[0109]在反应之前，优选将转化体在需氧条件下、在约25°C~约38°C的温度下培养约12小时~约48小时而使其增殖。
[0110]培养用培养基
[0111]反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。
[0112]作为碳源，也可以使用:糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等);甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。
[0113]碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。
[0114]作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉膏、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1~约10(W/v% )即可。
[0115]作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01~约l(w/v% )即可。
[0116]作为营养物质，可以列举肉膏、蛋白胨、多价蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1~约10(w/v% )即可。
[0117]还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。
[0118]培养基的pH优选约6~约8。
[0119]作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui，M.etal.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate andsuccinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培养基[Omumasaba，C.A.et al., Corynebacteriumglutami cum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite, ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。
[0120]反应液
[0121]作为反应液，可以使用含有碳源、氮源和无机盐类等的天然反应液或合成反应液。
[0122]作为碳源，可使用糖类。作为糖类，可以列举:葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等。另外，也可以使用将稻草、甘蔗渣、玉米秸等不可食用农产废弃物、或者柳枝稷、象草、芒草等能源作物用糖化酶等糖化后得到的含有葡萄糖、木糖等多种糖的糖化液。其中，优选单糖、更优选葡萄糖。另外，也优选含有葡萄糖的糖类(二糖、寡糖、多糖)。
[0123]作为碳源，除糖类外，也可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。
[0124]碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。
[0125]反应液中的糖类的浓度优选为约I~约20(w/v% )、更优选为约2~约10(w/v% )、进一步优选为约2~约5 (w/v% )。 [0126]另外，包括糖类在内的总碳源在反应液中的浓度通常设定为约2~约5 (w/v% )即可。
[0127]作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉膏、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在反应液中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1~约10(w/v% )即可。
[0128]作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在反应液中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01~约l(w/v% )即可。
[0129]还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。
[0130]反应液的pH优选约6~约8。
[0131]作为具体的优选的棒状细菌用反应液，可以列举前述的BT培养基等。在这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。
[0132]反应条件
[0133]反应温度即转化体的存活温度优选约20°C~约50°C，更优选约25°C~约47°C。反应温度为上述温度范围时，能够高效地制造缬氨酸。
[0134]另外，反应时间优选约I天~约7天，更优选约I天~约3天。
[0135]培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。
[0136]反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行。
[0137]<还原备件>
[0138]在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，能够更高效地生产缬氨酸。
[0139]还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV~约-500mV，更优选约_250mV~约_500mV。
[0140]反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEY JAMES公司制造，ORP电极)可以准确地测定。
[0141]处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液的液体介质，反应液用水溶液的制备方法可以参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用培养液制备方法(Pfennig, Net.al.(1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, AHandbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed.by Starr, M.P.et.al.ρ.926-940, Berlin, Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等而得到期望的还原条件下的水溶液。
[0142] 具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约IOmmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸懼水等处理约I分钟~约60分钟、优选约5分钟~约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而制成还原条件下的反应液用水溶液。
[0143]另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。
[0144]将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。
[0145]反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的PH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。
[0146]缬氨酸的回收
[0147]通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出缬氨酸。可以通过回收反应液来回收缬氨酸，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出缬氨酸。作为这种公知的方法，可以列离子交换树脂法、浓缩法、晶析法、活性炭吸附洗脱法等。
[0148]实施例
[0149]以下，利用实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
[0150]实施例1突变乙酰羟酸合成酶基因的克隆
[0151](I)缬氨酸类似物耐性株的获得
[0152]在30 °C 下将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) R 株在 300 μ g/ml的N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍中曝露I小时，接着将其在A培养基[将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7H200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042%(w/v) MnSO4 *2H201ml>0.02% (w/v)生物素溶液 lml、0.01 % (w/v)硫胺素溶液 2ml、酵母提取物2g、维生素测定酪蛋白氨基酸7g溶解于蒸留水1L]中培养至约109cells/ml。回收菌体，将其用基本培养基(BT培养基)洗涤后，涂布于含有4%葡萄糖、作为缬氨酸类似物的4% DL-α-氨基丁酸的BT平板培养基上，在30°C下培养5天。
[0153]将在含有缬氨酸类似物的平板培养基上生长的突变株接种至加入了 A液体培养基IOml的试管中，在33°C下进行需氧振荡培养16小时。通过离心分离(4°C、14500rpm、2分钟)回收所得到的培养菌体，用2ml BT培养基[Omumasaba, C.A.等，Corynebacteriumglutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]洗菌后，用Iml BT培养基进行悬浮。接着，以终浓度达到OD61tl = 0.1的方式从悬液接种至10ml BT培养基中，在33°C下进行需氧振荡培养48小时，筛选L-缬氨酸生产率高的菌株。
[0154]对采样得到的培养液进行离心分离(4°C、14500rpm、l分钟)，用氨基酸分析系统(岛津制作所制、Prominence)分析所得的上清液，由此进行缬氨酸的定量。分析条件如以下的表1所示。
[0155]表1
[0156]氨基酸分析系统测定条件
[0157]
【权利要求】
1.一种转化体，其通过在宿主棒状细菌中导入下述(a)、(b)和(C)中任意一种以上的DNA而得到， (a)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA ； (b)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有乙酰羟酸异构还原酶活性的多肽的DNA ； (c)来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽的 DNA。
2.如权利要求1所述的转化体，其中， 在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA为由序列号37的碱基序列构成的DNA， 在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA为由序列号57的碱基序列构成的DNA， 来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的DNA为由序列号40的碱基序列构成的DNA。
3.如权利要求1或2所述的转化体，其中，还导入了来源于谷氨酸棒杆菌的编码二羟酸脱水酶的DNA、或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的DNA。
4.如权利要求1~3中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为乳酸脱氢酶基因被破坏或缺失的棒状细菌。
5.一种谷氨酸棒杆菌VAL4(保藏号:NITE BP-1122)转化体。
6.一种缬氨酸的制造方法，其包括: 使权利要求1~5中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤；和 回收反应液中的缬氨酸的步骤。
7.如权利要求6所述的缬氨酸的制造方法，其中，在反应步骤中，转化体实质上不增殖。
【文档编号】C12N15/09GK103946370SQ201280041150
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年8月21日 优先权日:2011年8月22日
【发明者】汤川英明, 乾将行 申请人:公益财团法人地球环境产业技术研究机构