表达cd40l的哺乳动物细胞及其用途

表达cd40l的哺乳动物细胞及其用途
【专利摘要】本文报道了用于在存在IL-2和IL-21的情况下共培养兔B-细胞集合或单个放置的兔B-细胞的共培养系统，其中表达CD40L的CHO细胞用作饲养细胞。
【专利说明】表达CD40L的晡乳动物细胞及其用途
[0001] 本专利申请是B-细胞培养领域。本文报道了这样的培养系统，其用于刺激和扩展兔和人来源的抗体分泌细胞，如激活的B-细胞、成浆细胞以及在存在兔或人表达CD40L的饲养细胞的情况下从疾病中存活后免疫的兔或人分离的B-细胞。
_2] 发明背景
[0003]已经报道，来自不同物种的分离的B-细胞、成浆细胞和浆细胞难以在体外进行培养。实际上，这正常通过将原代B-细胞与杂交瘤配偶体融合产生无限增殖B-细胞系或无限增殖化来克服。对于兔，还开发了浆细胞瘤融合配偶体(Spieker-Polet，!!.，等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92 (1995) 9348-9352，但是杂交瘤技术在兔中不能很好地运行。对于兔B-细胞在体外的持续存活，提供必要的激活刺激剂和存活因子是必需的。已经描述了多种化 合物，如IL-2、IL-4、IL-1O及其他(参见例如Zubler，R.，等，Eur.J.1mmunol.14 (1984) 357-363 和 J.Exp.Med.160 (1984) 1170-1183)。
[0004]在生理学上，B-细胞在遭遇特异抗原加例如通过⑶40/⑶40L途径(综述于Neron, S.，等，Arch.1mmunol.Ther.Exp.59 (2011) 25-40)和 / 或通过来自天然背景的细胞因子和/或生长因子，例如通过树状突细胞或T细胞辅助的额外激活后被激活。
[0005]在体外系统中，可以通过与EL4-B5胸腺瘤细胞的共培养或添加可溶性的或固定化的抗⑶40抗体或⑶40L模拟⑶40/⑶40L的相互作用。仅有的系统缺少足够的效力并且仅描述了与使用不同饲养混合物(例如Zubler混合物；IL_4、IL-10等)(Zubler, R.,上文)或胸腺细胞上清液(TSN)的其他所需刺激剂的组合。
[0006]ffeitkamp, J-H.,等，(J.1mmunol.Meth.275 (2003) 223-237)报道了针对来自利用荧光病毒样颗粒选择的单个抗原特异性B-细胞的轮状病毒产生重组人单克隆抗体。在US2006/0051348中报道了针对多个近亲抗原产生多个分离抗体的方法。在W02008/144763和TO2008/045140中分别报道了针对IL-6的抗体及其用途，以及用于获得抗原特异性B-细胞的克隆群体的培养方法。在US2007/0269868中报道了用于获得抗原特异性B-细胞的克隆群体的培养方法。Masri等(在Mol.1mmunol.44 (2007) 2101-2106中)报道了从针对炭疽毒素的单个人淋巴细胞中获得的功能性Fab片段在大肠杆菌(E.coli)中的克隆与表达。在W02007/031550中报道了用于制备免疫球蛋白文库的方法。
[0007]在W02009/10515中报道了制备表达有用的抗体的杂交细胞的方法。在W02008/085878中报道了中和葡萄球菌(Staphylococcus)肠毒素B的高亲和力抗体。Amanna, 1.J.和Slifka，M.K.报道了通过两种独立的且互补的方法定量稀有的记忆B-细胞群体(J.1mmunol.Meth.317 (2006) 175-185)。在 W02011/052545 中报道了用于产生抗原特异性B-细胞群体的方法。
[0008]发明概沭
[0009]本文报道了用于从兔(或人)B_细胞开始快速、有效并可重复地产生兔(或人)抗体并包括至少一个培养步骤的新方法。
[0010]本文进一步报道了可以与表达兔⑶40L的哺乳动物细胞组合使用的饲养混合物，其提供高度有效的兔B-细胞刺激和培养系统。[0011]本文进一步报道了可以与表达人⑶40L的哺乳动物细胞组合使用的饲养混合物，其提供高度有效的人B-细胞刺激和培养系统。
[0012]如本文报道的一个方面是用于共培养兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的方法。
[0013]如本文报道的一个方面是用于在存在IL-2和IL-21的情况下/与其一起共培养兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的方法。在一个实施方案中，表达兔CD40L的哺乳动物细胞是CHO或BHK细胞。
[0014]如本文报道的一个方面是用于共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的方法。
[0015]如本文报道的一个方面是用于在存在IL-2和/或IL-21和/或IL_6的情况下/与其一起共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的方法。
[0016]在一个实施方案中，表达人⑶40L的哺乳动物细胞是BHK或CHO细胞。
[0017]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0018]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情况下。
[0019]在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
[0020]如本文报道的一个方面是用于产生兔抗体的方法，其包括以下步骤:培养分泌抗体的兔B-细胞和表达兔CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生兔抗体。
[0021]在一个实施方案中，表达兔⑶40L的哺乳动物细胞是CHO或BHK细胞。
[0022]如本文报道的一个方面是用于产生兔抗体的方法，其包括以下步骤:在存在IL-2和IL-21的情况下/与其一起培养一个或多个分泌抗体的兔B-细胞和表达兔⑶40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生兔抗体。
[0023]在一个实施方案中，表达兔⑶40L的哺乳动物细胞是CHO或BHK细胞。
[0024]在一个实施方案中，在培养开始时加入IL-2和IL-21。
[0025]在一个实施方案中，在培养开始时单独加入IL-2和IL-21。
[0026]在一个实施方案中，兔B-细胞是未经处理的或非成熟的兔B-细胞。
[0027]在一个实施方案中，所述B-细胞是IgG阳性的B-细胞(IgG+)。IgG阳性的B-细胞呈现可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。
[0028]如本文报道的一个方面是用于产生人抗体的方法，其包括以下步骤:培养分泌抗体的人B-细胞和表达人CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生人抗体。
[0029]在一个实施方案中，表达人⑶40L的哺乳动物细胞是BHK或CHO细胞。
[0030]如本文报道的一个方面是用于产生人抗体的方法，其包括以下步骤:在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下/与其一起培养一个或多个分泌抗体的人B-细胞和表达人⑶40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生人抗体。 [0031]在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0032]在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情况下。
[0033]在一个实施方案中，用于培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
[0034]在一个实施方案中，表达人⑶40L的哺乳动物细胞是BHK或CHO细胞。[0035]在一个实施方案中，在培养开始时加入白细胞介素。
[0036]在一个实施方案中，在培养开始时单独加入白细胞介素。
[0037]在一个实施方案中，人B-细胞是成熟的人B-细胞。
[0038]在一个实施方案中，所述B-细胞是IgG阳性的B-细胞(IgG+)。IgG阳性的B-细胞呈现可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。
[0039]如本文报道的一个方面是包含表达兔⑶40L的CHO细胞和IL_2以及IL-21的试剂盒。
[0040]如本文报道的一个方面是包含表达人⑶40L的BHK细胞和IL_2和/或IL-21和/或IL-6的试剂盒。
[0041]在一个实施方案中，所述试剂盒包含IL-2和IL-21。
[0042]在一个实施方案中，所述试剂盒包含IL-2和IL-21和IL_6。
[0043]在一个实施方案中，所述白细胞介素均是人白细胞介素。
[0044]如本文报道的 一个方面是用于共培养B-细胞的方法，其包括在存在IL-2或IL~21的情况下共培养B-细胞与表达⑶40L的哺乳动物细胞。
[0045]如本文报道的一个方面是用于共培养B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下共培养B-细胞与表达⑶40L的哺乳动物细胞。
[0046]如本文报道的一个方面是用于共培养兔B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下共培养兔B-细胞与表达兔⑶40L的哺乳动物细胞。
[0047]在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞或BHK细胞。
[0048]如本文报道的一个方面是用于共培养B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下共培养B-细胞与表达⑶40L的哺乳动物细胞。
[0049]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0050]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情况下。
[0051]如本文报道的一个方面是用于共培养人B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下共培养人B-细胞与表达人⑶40L的哺乳动物细胞。
[0052]在一个实施方案中，哺乳动物细胞是BHK细胞或CHO细胞。
[0053]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0054]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情况下。
[0055]在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
[0056]如本文报道的一个方面是用于培养分泌T-细胞抑制化合物的B-细胞的方法，其包括共培养B-细胞与表达⑶40L的哺乳动物细胞。
[0057]如本文报道的一个方面是用于培养分泌抗体的B-细胞的方法，其以以下顺序包括
[0058]i)在存在促有丝分裂刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的第
一步次培养，和
[0059]ii)在存在抗体产生刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的随后
第二次共培养。
[0060]在一个实施方案中，所述第一次和第二次共培养在相同的培养容器中进行。
[0061]在一个实施方案中，用于培养分泌抗体的B-细胞的方法包括共培养B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞，由此向培养中加入第一种促有丝分裂刺激剂，然后向所述培养中加入抗体产生刺激剂。
[0062]在一个实施方案中，在加入促有丝分裂刺激剂后至少一小时加入抗体产生刺激剂。在一个实施方案中，在向培养中加入促有丝分裂刺激剂后一至三天加入抗体产生刺激剂。
[0063]在一个实施方案中，所述促有丝分裂刺激剂选自⑶40-和⑶40L相互作用的化合物、ICOS-和 ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1 ( α / β )、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素_5、白细胞介素-7、白细胞介素-10、白细胞介素-14、白细胞介素-21、SAP (信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowanl颗粒(SAC ;热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF) α、1型干扰素(例如IFNa/β)，和II型干扰素(例如IFN Y )。还可以通过抗IgG、抗⑶20和/或抗⑶27抗体诱导B-细胞激活。 [0064]在一个实施方案中，所述抗体产生刺激剂选自⑶40-和⑶40L相互作用的化合物、ICOS-和 ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF, CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCLl3,CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1 ( a / β )、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素_5、白细胞介素-6、白细胞介素_9、白细胞介素-10、白细胞介素-13、白细胞介素-21、白细胞介素-33、SAP(信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowanl颗粒(SAC ;热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF) α、I型干扰素(例如IFN α / β )，和II型干扰素(例如IFN Y )。还可以通过抗IgG、抗⑶20和/或抗⑶27抗体诱导B-细胞刺激。
[0065]在一个实施方案中，在第一次共培养开始时加入促有丝分裂刺激剂。
[0066]在一个实施方案中，在第一次共培养开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天加入所述促有丝分裂刺激剂。
[0067]在一个实施方案中，在加入促有丝分裂刺激剂后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14天后加入抗体产生刺激剂。
[0068]在一个实施方案中，共培养中的每一次进行5-14天。
[0069]在一个实施方案中，培养5-21天的总时长。在一个实施方案中，培养6-14天的总时长。
[0070]在一个实施方案中，在第二次共培养开始前去除促有丝分裂刺激剂。在一个实施方案中，通过交换培养上清液和或用中性培养基洗涤细胞进行去除。
[0071]如本文报道的一个方面是用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤:
[0072]a)共培养放置的(cbposite)分泌抗体的B-细胞集合或单个B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞，
[0073]b)分离编码特异性结合抗原的抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列之核酸并分离编码所述抗体的可变重链结构域的氨基酸序列之核酸，
[0074]c)培养包含在一个或多个表达盒中含有b)中分离的核酸或其编码轻链和/或重链可变域的人源化形式的变体的细胞，[0075]d)从细胞或培养基中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
[0076]在一个实施方案中，共培养是在存在促有丝分裂刺激剂和/或抗体产生刺激剂的情况下。
[0077]在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤:
[0078]a)提供分泌抗体的(成熟的)B-细胞群体(其获得自实验动物或人的血液)，
[0079]b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色B-细胞群体的细胞，
[0080]c)将B-细胞染色群体的单个细胞或来自B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的容器，其为多孔平板的一个孔)，
[0081]d)在存在表达⑶40L的哺乳动物细胞和任选地IL-2和/或IL-21和/或IL_6的情况下培养放置的单独B-细胞，
[0082]e)测定在单独的B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
[0083]f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
[0084]g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
[0085]h)在细胞中引入核酸，
[0086]i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
[0087]在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤:
[0088]a)提供分泌抗体的(成熟的)兔B-细胞群体，
[0089]b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色兔B-细胞群体的细胞，
[0090]c)将兔B-细胞染色群体的单个细胞或来自兔B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的容器，其为多孔平板的一个孔)，
[0091]d)在存在表达兔⑶40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21的情况下培养放置的兔B-细胞，
[0092]e)测定在兔B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
[0093]f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
[0094]g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
[0095]h)在细胞中引入核酸，
[0096]i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
[0097]在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤: [0098]a)提供分泌抗体的(成熟的)人B-细胞群体，
[0099]b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色人B-细胞群体的细胞，
[0100]c)将人B-细胞染色群体的单个细胞或来自人B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的容器，其为多孔平板的一个孔)，[0101]d)在存在表达人CD40L的哺乳动物细胞和IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下培养放置的人B-细胞，
[0102]e)测定在人B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
[0103]f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
[0104]g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
[0105]h)在细胞中引入核酸，
[0106]i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
[0107]在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0108]在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情况下。
[0109]在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
[0110]在一个实施方案中，细胞集合包含约10个B-细胞至约1，000，000个B-细胞。在一个实施方案中，所述集合包含约500个B-细胞至约100，000个B-细胞。在一个实施方案中，所述集合包含约500个B-细胞。
[0111]如本文报道的一个方面是用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤:
[0112]a)共培养分泌抗体的兔B-细胞的集合或分泌抗体的单个放置的兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21，
[0113]b)分离编码特异性结合抗原的抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列之核酸并分离编码所述抗体的可变重链结构域的氨基酸序列之核酸，
[0114]c)培养包含在一个或多个表达盒中含有b)中分离的核酸或其编码轻链和/或重链可变域的人源化形式的变体的细胞，
[0115]d)从细胞或培养基中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
[0116]在一个实施方案中，共培养是在存在促有丝分裂刺激剂和/或抗体产生刺激剂的情况下。
[0117]在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤:
[0118]a)提供分泌抗体的(成熟的)兔B-细胞群体，
[0119]b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色B-细胞群体的细胞，
[0120]c)将B-细胞染色群体的单个细胞或来自B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的的容器，其为多孔平板的一个孔)，
[0121]d)在存在表达⑶40L的哺乳动物细胞以及任选地IL-2和IL-21的情况下培养放置的单独的B-细胞，
[0122]e)测定在单独的B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
[0123]f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
[0124]g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸或其编码轻链和/或重链可变域的人源化形式的变体用于表达抗体，[0125]h)在细胞中引入核酸，
[0126]i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
[0127]在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤:
[0128]a)提供分泌抗体的(成熟的)兔B-细胞群体，
[0129]b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色兔B-细胞群体的细胞，
[0130]c)将兔B-细胞染色群体的单个细胞或来自兔B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的的容器，其为多孔平板的一个孔)，
[0131]d) 在存在表达兔⑶40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21的情况下培养放置的兔B-细胞，
[0132]e)测定在兔B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
[0133]f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
[0134]g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
[0135]h)在细胞中引入核酸，
[0136]i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
[0137]在一个实施方案中，细胞集合包含约10个B-细胞至约1，000，000个B-细胞。在一个实施方案中，所述集合包含约500个B-细胞至约100，000个B-细胞。在一个实施方案中，所述集合包含约500个B-细胞。
[0138]如本文报道的一个方面是表达兔CD40L的哺乳动物细胞在共培养分泌抗体的兔B-细胞中的用途。
[0139]在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
[0140]在一个实施方案中，所述兔⑶40L具有SEQ ID N0:01的氨基酸序列。
[0141]如本文报道的一个方面是表达人CD40L的哺乳动物细胞在共培养分泌抗体的人B-细胞中的用途。
[0142]在一个实施方案中，哺乳动物细胞是BHK细胞。
[0143]在一个实施方案中，所述人⑶40L具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
[0144]如本文报道的一个方面是SAC在共培养分泌抗体的B-细胞和表达⑶40L的哺乳动物细胞中的用途。
[0145]如本文报道的一个方面是表达兔⑶40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21在共培养兔B-细胞中的用途。
[0146]如本文报道的一个方面是表达人⑶40L的哺乳动物细胞和IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培养人B-细胞中的用途。
[0147]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0148]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情况下。
[0149]在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
[0150]如本文报道的一个方面是用于共培养兔B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下培养单个放置的兔B-细胞或兔B-细胞集合与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
[0151]在如本文报道的所有方面的一个实施方案中，IL-2是人IL-2或小鼠IL_2并且IL-21 是人 IL-21 或小鼠 IL-21。
[0152]如本文报道的一个方面是用于共培养人B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下培养单个放置的人B-细胞或人B-细胞集合与表达人⑶40L的哺乳动物细胞的步骤。
[0153]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0154]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情况下。
[0155]在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
[0156]如本文报道的一个方面是表达兔⑶40L的哺乳动物细胞、IL-2和IL-21在共培养兔B-细胞用于改善细胞生长中的用途。
[0157]如本文报道的一个方面是表达人⑶40L的哺乳动物细胞、IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培养人B-细胞用于改善细胞生长中的用途。
[0158]在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0159]在一个实 施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情况下。
[0160]在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
[0161]如本文报道的一个方面是用于改善兔B-细胞的细胞生长的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下培养单个放置的兔B-细胞或兔B-细胞集合与表达兔⑶40L的哺乳动物细胞的步骤。
[0162]在如本文报道的所有方面的一个实施方案中，IL-2是人IL-2或小鼠IL_2并且IL-21 是人 IL-21 或小鼠 IL-21。
[0163]如本文报道的一个方面是用于改善人B-细胞的细胞生长的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下培养单个放置的人B-细胞或人B-细胞集合与表达人⑶40L的哺乳动物细胞的步骤。
[0164]在一个实施方案中,所述培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0165]在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情况下。
[0166]在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
[0167]附图详沭
[0168]本文报道的主题提供了用于从兔(或人)B_细胞开始快速、有效并可重复地产生兔(或人)抗体并包括至少一个培养步骤的一般性可应用方法。
[0169]已经发现，添加表达兔⑶40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21可以改善兔B-细胞的生长特性，即兔B-细胞(单个放置的细胞或作为细胞集合)比在缺少表达兔CD40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21的情况下可以更快速地生长至高细胞密度。因此，短时间内在培养上清液中获得高的兔B-细胞密度和相应地高IgG浓度是可能的。
[0170]本文报道的一个方面是表达兔⑶40L的CHO细胞。
[0171]如本文报道的一个方面是表达兔⑶40L的CHO细胞与IL_2和IL-21 —起在共培养兔B-细胞中的用途。
[0172]如本文报道的一个方面是可以与表达兔⑶40L的CHO细胞或其他饲养细胞组合使用，以提供高度有效的B-细胞刺激和培养系统的合成饲养混合物。
[0173]本文报道的一个方面是表达人⑶40L的BHK细胞。
[0174]如本文报道的一个方面是表达人⑶40L的BHK细胞与IL_2和/或IL-21 —起在共培养人B-细胞中的用途。
[0175]如本文报道的一个方面是可以与表达人⑶40L的BHK细胞或其他饲养细胞组合使用，以提供高度有效的B-细胞刺激和培养系统的合成饲养混合物。
[0176]本领域技术人员已知的方法和技术(其用于实施本发明)描述于例如Ausubel, F.M.,编辑，Current Protocols in Molecular Biology,卷 1-1II (1997)，Wiley 和 Sons ;Sambrook,等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)中。
[0177]
[0178]出于本文中的目的，“受体人构架”是包含来自人免疫球蛋白构架或如下文定义的人共有构架的轻链可变域(VL)构架或重链可变域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“来自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列在序列上相同。
[0179]“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
[0180]如本申请中所用的术语“氨基酸”表示羧基α-氨基酸组，其可以直接或以前体形式由核酸编码。可以通过由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码各氨基酸。每个氨基酸由至少一个密码子编码。不同密码子编码同一个氨基酸称为“遗传密码的简并性”。如本申请中所用的术语“氨基酸”表示天然发生的羧基α-氨基酸并且包括丙氨酸(三字母密码:ala, —字母密码:A)、精氨酸(arg, R)、天冬酰胺(asn, N)、天冬氨酸(asp, D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gin, Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his, H)、异亮氨酸(ile, I)、亮氨酸(leu, L)、赖氨酸(lys, K)、甲硫氨酸(met, Μ)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro, P)、丝氨酸(ser, S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr, Y)和纟颜氨酸(val, V)。
[0181]本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且包括多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
[0182]“抗体片段”指除完整抗体外的分子，其包含结合完整抗体结合的抗原的完整抗体的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2 ;双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0183]术语“嵌合”抗体指其中重链和/或轻链的部分自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种的抗体。
[0184] 抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有5大类抗体:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgGpIgG2UgG^IgG4、IgAjP IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、Y和μ。[0185]术语“克隆”表示来自/源自单个B-细胞的分裂和分泌抗体的B-细胞群体。因此，B-细胞克隆产生单克隆抗体。
[0186]如本文所用，术语“表达”指细胞内发生的转录和/或翻译过程。可在细胞中存在的相应mRNA量的基础上测定细胞中目的核酸序列的转录水平。例如，可通过RT-PCR或Northern杂交对从目的序列转录的mRNA进行定量(参阅Sambrook,等，1989,上文)。可通过多种方法，例如通过ELISA，通过测定多肽的生物活性，或通过使用不依赖该活性的测定，如Western印迹或放射免疫测定，使用识别并结合多肽的免疫球蛋白对目的核酸编码的多肽进行定量(参见Sambrook,等，1989,上文)。
[0187]“表达盒”指含有用于细胞中至少所含核酸表达的必需调节元件，如启动子和多腺苷酸化位点的构建体。
[0188]以瞬时表达或持久表达进行基因的表达。目的多肽一般是分泌的多肽，并因而含有N-端延伸(也称为信号序列)，其为多肽通过细胞壁转运/分泌到细胞外基质中所必需的。一般而言，信号序列可来自编码分 泌的多肽的任何基因。如果使用异源信号序列，其优选为宿主细胞识别和加工的(即通过信号肽酶切割的)一种序列。例如对于在酵母中的分泌，待表达的异源基因的天然信号序列可以被来自分泌基因的同源酵母信号序列所取代，如酵母转化酶信号序列、Ct-因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和汉森氏酵母属(Hansenula) α-因子前导序列，第二种描述于US5，010，182中)、酸性磷酸酶信号序列，或白假丝酵母(C.albicans)葡萄糖淀粉酶信号序列(EP0362179)。在哺乳动物细胞表达中，目的蛋白质的天然信号序列对于人或鼠类起源的免疫球蛋白是令人满意的，尽管其他哺乳动物信号序列是合适的，如相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌信号序列，例如单纯性疱疹糖蛋白D信号序列。编码该前区段的DNA片段框内连接，即有效连接至编码目的多肽的DNA片段。
[0189]术语“实验动物”表示非人动物。在一个实施方案中，实验动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、骆驼、骆马、非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、鲨鱼和爬行类动物。在一个实施方案中，实验动物是哺乳动物。
[0190]本文中的术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，其含有恒定区的至少一部分。所述术语包括天然序列Fe区和变体Fe区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fe区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或缺失。除非本文另有规定，Fe区或恒定区中氨基酸的编号根据EU编号系统，也称为EU 索弓 I,如 Kabat, E.A.，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD(1991), NIHPub I i cat ion91-3242,卷 1-3 中所述。
[0191]术语“饲养混合物”表示不同添加物，如生长因子、细胞因子和/或促进B-细胞激活和/或存活和/或抗体分泌的其他蛋白质的组合。饲养混合物可以是例如从胸腺细胞的培养上清液(TSN)(其是细胞因子的非限定性组合)中获得的天然的饲养混合物，或饲养混合物可以是合成的饲养混合物，例如包含IL-21和/或IL-2和/或IL-6的混合物。
[0192]“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR —般由四个FR结构域组成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以以下顺序出现:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。[0193]术语“细胞”或“宿主细胞”指其中可以转染或转染例如编码异源多肽的核酸的细胞。术语“细胞”包括用于增殖质粒的原核细胞，和用于表达核酸并产生编码的多肽的真核细胞。在一个实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞，任选地是CHO Kl细胞(ATCC CCL-61或DSM ACCl 10)或CHO DG44细胞(也称为 CHO-DHFR[-]、DSM ACC126)或 CHO XL99 细胞、CH0-T 细胞(参见例如 Morgan, D.，等，Biochemistry26 (1987) 2959-2963)，或 CHO-S 细胞、或 Super-CHO 细胞(Pak, S.C.0.，等Cytotechnol.22(1996) 139-146)。如果这些细胞不适合于在无血清培养基或悬浮液中生长，那么有待在目前方法使用之前进行适应。如本文所用，表述“细胞”包括受试者细胞及其后代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试者细胞和来自其中的培养物，而不考虑转化或次代培养的次数。也理解，由于有意的或无意突变，所有后代在DNA含量上不必完全相同。包括具有与如在最初转化的细胞中所筛选的功能或生物活性相同的功能或生物活性的变体后代。
[0194] “人抗体”是拥有这样的氨基酸序列的一种抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的或来自利用人抗体所有组成成分或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0195]“人共有构架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列选集中最常存在的氨基酸残基的构架。一般地，人免疫球蛋白VL或VH序列的选集来自可变域序列亚组。一般地，序列亚组是如 Kabat, E.A.,等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD(1991), NIHPublication91-3242,卷1_3中所述的亚组。在一个实施方案中，对于VL,亚组是如Kabat等,上文中所述的亚组K I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，上文中所述的亚组III。
[0196]“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以包含来自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
[0197]如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR;三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32 (LI)、50-52 (L2) ,91-96 (L3)、26-32 (Hl)、53-55 (H2)和 96-101 (H3)上。(Chothia, C.和 Lesk, Α.Μ.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性 CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1, CDR-H2 和 CDR-H3)发生在 LI 的氨基酸残基 24-34、L2 的 50-56、L3 的 89-97、Hl 的 31-35B、H2 的 50-65 和 H3 的 95-102上。(Kabat, E.A.，等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991), NIHPublication91-3242,卷1_3)。除了 VH中的CDRl外，CDR —般包含形成高变环的氨基酸残基。⑶R还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称为缩短的 CDR 或 a-CDR 的 CDR 的区内。示例性 a_CDR (a-CDR-Ll、a_CDR_L2、a_CDR_L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2 和 a_CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸残基 31-34、L2 的 50-55、L3 的 89-96、Hl 的31-35B、H2 的 50-58 和 H3 的 95-102 上。(参见 Almagro, J.C.和 Fransson, J.，Front.Biosc1.13(2008) 1619-1633)。除非另有说明，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等，上文编号。
[0198]术语“标记”表示表面标志物的存在或缺失，其可以通过添加特异性结合和标记的抗表面标志物抗体来确定。因此，在与各自的特异性结合和标记的抗表面标记物抗体温育后，例如在荧光标记物的情况下通过荧光的出现确定表面标记物的存在，而通过荧光的缺失确定表面标记物的缺失。
[0199]如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即群体包含的各抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制剂的产生过程中发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示自基本上同质的抗体群体获得的抗体的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，可以通过多种技术制备待根据本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法。
[0200]“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键结合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N至C端，每条重链具有可变区(VH)，又称作可变重链结构域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有可变区(VL)，又称作可变轻链结构域或轻链可变域，接着是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定域的氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型(称作卡帕(K)和拉姆达(λ))中的一种。
[0201]“核酸”或“核酸序列”(所述术语在该申请中可互换使用)指由各核苷酸(也称为碱基)a、c、g和t (或在RNA中为u )组成的聚合分子，例如DNA、RNA或其修饰。该多核苷酸分子可以是天然发生的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子或一个或多个天然发生的多核苷酸分子与一个或多个合成的多核苷酸分子的组合。该定义中也包括的是天然发生的多核苷酸分子，其中一个或多个核苷酸改变(例如通过诱变)、缺失或添加。核酸可以是分离的或整合在另一核酸中的，例如在表达盒、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸的特征在于其由各核苷酸组成的核酸序列。
[0202]本领域技术人员熟知程序和方法来将例如多肽的氨基酸序列转变成编码该氨基酸序列的对应核酸序列。因而，核酸的特征在于其由各核苷酸组成的核酸序列，同样在于由其编码的多肽的氨基酸序列。
[0203]术语“特异性结合”及其语法等同物表示，抗体以KT7M或更小的解离常数(Kd)结合其靶标，在一个实施 方案中以IO-8M-KT13M的解离常数结合其靶标，在其他实施方案中以KT9M-1O-13M的解离常数结合其靶标。所述术语进一步用于表示，所述抗体不特异性结合存在的其他生物分子，即其以10_6M或更大的解离常数(Kd)结合其他生物分子，在一个实施方案中以10-6Μ-1Μ的解离常数结合其他生物分子。[0204]“转染载体”是提供在宿主细胞中表达转染载体中所包含的编码核酸/结构基因所有所需元件的核酸(也表示为核酸分子)。转染载体包含原核质粒增殖单位，例如对于大肠杆菌而言依次包含原核复制起点和赋予对原核选择剂抗性的核酸，还包含在转染载体中的，赋予对真核选择剂抗性的一个或多个核酸和编码目的多肽的一个或多个核酸。优选的是每一种位于表达盒内的赋予对选择剂抗性的核酸和编码目的多肽的核酸，由此每一个表达盒包含启动子、编码核酸和转录终止子，包括多腺苷酸化信号。基因表达一般处于启动子控制下，并且此结构基因称为“有效连接”所述启动子。类似的，如果调节元件调节核心启动子的活性，那么调节元件与核心启动子有效连接。
[0205]术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL) —般具有类似的结构，其中每个结构域包含4个保守的构架区(FR)和3个高变区(HVR)。(参见例如Kindt, T.J.,等，KubyImmunology,第 6 版，W.H.Freeman and C0., N.Y.(2007),第 91 页)。单个 VH 或 VL 结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如,Portolano, S.，等，J.1mmunol.150 ( 1993) 880-887 ；Clackson, Τ.，等，Nature352 (1991) 624-628)。
[0206]如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体以及整合到其已经引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其有效连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
[0207]术语“年轻动物”表示在出现性成熟以前的动物。例如，年轻仓鼠的年龄是小于6周，特别是小于4周。例如，年轻小鼠的年龄是小于8周，特别是小于5周。
[0208]免疮
[0209]在本文报道的方法中，可以使用/加工从例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔或人获得的B-细胞。
[0210]在一个实施方案中，小鼠是NMR1-小鼠或balb/c-小鼠。
[0211]在一个实施方案中，仓鼠选自亚美尼亚仓鼠(仓鼠属(Cricetulusmigratorius))、中国仓鼠(中国仓鼠(Cricetulus griseus))和叙利亚仓鼠(Mesocricetulus auratus)。在一个实施方案中，仓鼠是亚美尼亚仓鼠。
[0212]在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞。在一个实施方案中，兔选自新西兰白(NZff)兔、Zimmermann-兔(ZIKA)、Alicia-突变品系的兔、basilea突变品系的兔、具有人免疫球蛋白基因座的转基因兔、rblgM敲除的兔，及其杂交育种的兔。在一个实施方案中，从免疫兔或针对具体抗原接种后的兔获得兔B-细胞。
[0213]在一个实施方案中，B-细胞是人B-细胞。在一个实施方案中，从非接种的健康人，或从针对具体抗原接种后的人，或从患有疾病的人，或从已经从疾病中存活的人获得人B-细胞。接种可以是向人或从具体疾病中存活者施用具体疫苗。
[0214]B-细朐的来源和分离
[0215]免疫实验动物或接种的人的血液提供了产生抗体的B-细胞的高度多样性。从中获得的B-细胞分泌抗体，其在⑶R内几乎没有相同的或重叠的氨基酸序列，因此显示了高度多样性。
[0216]在一个实施方案中，从免疫后4天直至免疫后15天或直至最近的加强获得例如从实验动物的血液获得的实验动物的或人的B-细胞。
[0217]在一个实施方案中，从免疫或最近加强后4天直至至多9天后获得B_细胞。
[0218]该时间跨度允许本文报道的方法具有高度灵活性。在该时间跨度内，提供最精确抗体的B-细胞从脾迁移到血液中(参见例如Paus, D.，等，JEM203 (2006) 1081 - 1091 ；Smith, K.G.S.,等，The EMBO J.I 6 (I 997) 2996 - 3O O6 ;Wrammert，J.，等，Nature453 (2008)667-672)。
[0219]共培养前的选择步骤
[0220]可从外周血单核细胞(PBMC)中富集产生特异性结合抗原的抗体的B-细胞。因此，在本文报道的所有方法的一个实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)获得B-细胞或从外周血单核细胞(PBMC)富集B-细胞集合。
[0221]可以通过使用淘选方法分别减少或富集不产生结合目的抗原的抗体的细胞，或以同样方法分别减少或富集产生结合目的抗原的抗体的细胞。其中结合配偶体呈现为附着到表面并且如果进一步加工结合的细胞，那么在细胞群体中选择性富集与配偶体结合的细胞，或者如果进一步加工溶液中剩余的细胞，那么在细胞群体中减少与配偶体结合的细胞。
[0222]本文报道的方法在一个实施方案中包括选择步骤，其中基于细胞表面标志物和荧光激活的细胞分选/门控选择产生特异性抗体的B-细胞。在一个实施方案中，分选/富集/选择成熟的B-细胞。为了从不同实验动物物种中选择B-细胞，可以使用不同的细胞表面标志物。
[0223]通过标记非靶标细胞群体和非特异性结合的淋巴细胞，可以选择性去除这些细胞。在此去除步骤中，一般可实现不完全的去除。虽然去除不是定量的，但是其为剩余细胞的后续荧光标记提供了优势，因为可减少或甚至最小化干扰细胞的数目。
[0224]可以使用不同的表面标志物标记不同的细胞群体，如CD3+-细胞(T-细胞)、CD19+-细胞(一般而言是B-细胞)、IgM+-细胞(成熟的天然B-细胞)、IgG+-细胞(成熟的B-细胞)、CD38+-细胞(例如成浆细胞)和IgG+CD38+-细胞(前浆细胞)。
[0225]用于选择成熟的IgG+-B-细胞，如记忆B-细胞、成浆细胞和浆细胞的免疫荧光标记可以用于本文报道的方法中。
[0226]为了选择或富集B-细胞,单个标记或双标记或三标记细胞。
[0227]需要进行标记，其导致标记约0.1 % -2.5%的总细胞群体。
[0228]在一个实施方案中，通过标记在群体中0.1% -2.5%的B-细胞上存在的表面分子选择B-细胞。在一个实施方案中，通过标记在群体中0.3% -1.5%的B-细胞上存在的表面分子选择B-细胞。在一个实施方案中，通过标记在群体中0.5% -1%的B-细胞上存在的表面分子选择B-细胞。
[0229]单细胞放置
[0230]本文报道的方法在一个实施方案中包括将B-细胞群体的B-细胞放置为单细胞的步骤。
[0231]在一个实施方案中，通过荧光激活的细胞分选(FACS)放置为单细胞。
[0232]在一个实施方案中，特异性标记的B-细胞放置为单细胞。在一个实施方案中，标记是用突光标记的抗体标记细胞表面标志物。
[0233] 在一个实施方案中，本文报道的方法提供了单克隆抗体。[0234]本文报道的所有方法的一个实施方案中，B-细胞是成熟的B-细胞并且成熟的B-细胞放置为单细胞。
[0235]用于从实验动物的血液获得的B-细胞的免疫荧光标记也可以用于标记从实验动物(如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的脾和其他免疫器官中获得的B-细胞。
[0236]多细胞放置
[0237]本文报道的方法在一个实施方案中包括放置B-细胞集合的步骤。在该B-细胞集合中，从外周血经历磁力亲和珠或FACS分离后，每孔中放置了全部的B-细胞。
[0238]在一个实施方案中，放置了约500个B-细胞。
[0239]在一个实施方案中，放置了约2，500个B-细胞。
[0240]在单个实验中，放置的B-细胞的总数例如对于人B-细胞而言可以增加至多90，000个B-细胞或更多。
[0241]共?养
[0242]本文报道了产生抗体的B-细胞与表达⑶40L的哺乳动物细胞(如CHO或BHK细胞)的共培养。
[0243]因此， 在本文报道的所有方法的一个实施方案中，B-细胞集合或单个放置的B-细胞与表达⑶40L的CHO细胞在存在IL-2和IL-21或饲养混合物的情况下共培养。
[0244]早已共培养约3、4、5、6、7、8、10、15或21天后，尤其3、4或5天后(约2，500个B-细胞的集合)，或尤其6、7或8天后(单个放置的B-细胞或约500个B-细胞的集合)，可以在上清液中获得充足的抗体分子。利用由此提供的抗体量，可以进行不同分析，以更详细地表征抗体，例如关于结合特异性。利用在筛选/选择过程中的该早期阶段中对抗体的改善表征，可以减少所需核酸分离物和必须进行的测序反应的数量。
[0245]本文报道的所有方法的一个实施方案是在存在饲养混合物的情况下产生抗体的B-细胞与表达⑶40L的CHO细胞的共培养。
[0246]所述饲养混合物可以是天然的饲养混合物或合成的饲养混合物。
[0247]天然的饲养混合物是例如胸腺细胞上清液(TSN)。其含有适当的可溶因子，但该试剂是异质的，成分描述并不充分并且在动物之间不同。
[0248]合成的饲养混合物是所谓的“Zubler饲养混合物”。其由鼠类细胞因子的确定组合组成(2ng/ml IL-1 β、50ng/ml IL_2、10ng/ml IL-10 和 2ng/ml TNF a )。
[0249]在本文报道的所有方法的一个实施方案中，饲养混合物是胸腺细胞培养上清液。在一个实施方案中，B-细胞不是人B-细胞。
[0250]在一个实施方案中，从各年轻动物胸腺的胸腺细胞培养中获得胸腺细胞培养上清液。与从成体动物血液中分离胸腺细胞相比，尤其适合使用年轻动物的胸腺。
[0251]在一个实施方案中，从人的血液中获得的人T-细胞培养中获得胸腺细胞培养上清液。
[0252]一般而言，本文报道的方法中的B-细胞与表达⑶40L的CHO细胞的共培养步骤可以在许多额外步骤之前并也可以在这些步骤之后。
[0253]已经发现，表达兔⑶40L的CHO细胞与IL_2和IL-21以及SAC的共培养可以用于激活早期(非成熟的或不成熟的)兔B-细胞。这些B-细胞不表达CD138。
[0254]在本文报道的所有方法的一个实施方案中，产生抗体的B-细胞与表达CD40L的CHO细胞的共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞并且⑶40L是兔⑶40L。在一个实施方案中，培养基基本上不含IL-4，即不向培养基中加入IL-4。在一个实施方案中，IL-2和IL-21与培养基一起在培养开始时被加入。
[0255]在本文报道的所有方法的一个实施方案中，产生抗体的兔B-细胞与表达兔⑶40L的CHO细胞的共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下，由此培养基基本上不含IL-4，并且由此IL-2和IL-21与培养基一起在培养开始时被加入。
[0256]已经发现，使用包含B-细胞、表达⑶40L的哺乳动物细胞、IL_2和IL-21的共培养基系统导致B-细胞的改善增殖，即与不包含IL-2、IL-21和表达⑶40L的哺乳动物细胞中的一种、两种或全部的系统相比，所述B-细胞更快速地分裂并且在更短的时间里在培养上清液中分别可以获得更高的细胞密度和抗体滴度。
[0257]还已经发现，对于兔B-细胞而言，包含表达兔⑶40L的CHO细胞、人或鼠IL-2以及人或鼠IL-21的共培养系统尤其适合。
[0258]通过IgG产生表征共培养的细胞
[0259]对于共培养后分泌的IgG的(定性和定量)测定，一般可以使用本领域技术人员已知的所有方法，如ELISA。在本文报道的所有方法的一个实施方案中，使用EILSA。对于人IgG水平的测定，已经使用了流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array, CBA)技术(可从 BD Biosciences 获得)。
[0260]根据表征结果，可以获得，即选择B-细胞克隆。
[0261]通过扩展和增殖表征共培养的细胞
[0262]对于细胞扩展的(定性和定量)测定，可以使用不同的读出系统(商品化的细胞活性测试“细胞滴度发光” (Promega) XFSE稀释法、3HThymidin掺入或细胞培养图像)评估共培养的B-细胞的增殖或生存力。
[0263]mRNA的分离、克降与测序
[0264]产生高抗体滴度的B-细胞克隆提供了一些量的允许使用简并PCR引物的编码(近亲)单克隆轻链和重链可变区的mRNA，并且避免了对高度特异性引物的需要。也减少了所需要的PCR循环数。因此，在一个实施方案中，逆转录酶PCR使用轻链和重链可变域的简并PCR引物。
[0265]对于B-细胞，可以分离总mRNA并逆转录成cDNA。利用各引物可以扩增近亲VH和VL区的编码核酸。
[0266]在本文报道的所有方法的一个实施方案中，氨基酸序列来自扩增的可变域的编码核酸。通过定位EVQL/QVQL至VSS (VH区)和DIVM/DIQM至KLEIK (VL区)的氨基酸序列鉴定可变域的编码核酸的精确起点和终点。
[0267]本f报道
[0268]本文报道的是分泌抗体的B-细胞通过以下途径的共刺激:(i)使用照射的哺乳动物，例如CHO(中国仓鼠卵巢)或BHK(幼仓鼠肾)，例如兔起源的或人起源的CD40L转染的饲养细胞的CD40/CD40L(CD154)途径，和(ii)各细胞因子或包含例如人或小鼠白细胞介素2(IL-2)和21 (IL-21)，和/或热杀死的福尔马林固定的葡萄球菌A菌株Cowanl颗粒(SAC)的饲养混合物对培养基的补充。
[0269]本发明的方面和实施方案[0270]如本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下共培养兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
[0271] 具有在存在IL-2和IL-21的情况下兔B-细胞(单个放置的细胞或细胞集合)与表达(例如细胞表面呈递的)兔CD40L的哺乳动物细胞的共培养步骤时，提供了快速、有效且可重复的方法用于从兔B-细胞开始产生兔或人抗体。
[0272]在一个实施方案中，兔B-细胞是天然的兔B-细胞或非成熟的兔B-细胞。
[0273]在一个实施方案中，兔B-细胞是IgG+B-细胞。
[0274]在一个实施方案中，IL-2是人IL-2。在一个实施方案中，IL_2是鼠类IL_2。
[0275]在一个实施方案中，IL-21是人IL-21。在一个实施方案中，IL-21是鼠类IL-21。
[0276]在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
[0277]在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
[0278]在 Iv实施方案中，IL~2是人IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0279]在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0280]在一个实施方案中，培养是在缺少IL-4的情况下。在一个实施方案中，培养基不含 IL-4。
[0281]在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
[0282]在一个实施方案中，所述兔⑶40L具有SEQ ID N0:01的氨基酸序列。
[0283]在一个实施方案中，在用抗原最后一次免疫或加强兔后4-9天后获得兔B-细胞。
[0284]在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤中的一个或多个:
[0285]-从免疫的兔中获得B-细胞，和/或
[0286]-单个放置所述B-细胞，和/或
[0287]-共培养B-细胞与表达兔⑶40L的哺乳动物细胞，和/或
[0288]-从共培养的兔B-细胞中获得编码兔抗体的可变域的核酸，和/或
[0289]-将兔抗体的可变域人源化，和/或
[0290]-培养包含编码抗体的可变域的核酸的哺乳动物细胞并从细胞或培养基中回收抗体。
[0291]如本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
[0292]具有人B-细胞(单个放置的细胞或细胞集合)与表达(例如细胞表面呈递的)人CD40L的哺乳动物细胞的共培养步骤时，提供了有效且可重复的方法用于从人B-细胞开始产生人抗体。
[0293]在一个实施方案中，从人的血液中获得人B-细胞。
[0294]在一个实施方案中，兔B-细胞是IgG+B-细胞。
[0295]在一个实施方案中，哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。
[0296]在一个实施方案中，向共培养中加入IL-2和/或IL-21和/或IL_6。
[0297]在一个实施方案中，IL-2是人IL-2。
[0298]在一个实施方案中，IL-21是人IL-21。
[0299]在一个实施方案中，IL-6是人IL-6。
[0300]在一个实施方案中，培养是在缺少IL-4的情况下。在一个实施方案中，培养基不含 IL-4。
[0301 ] 在一个实施方案中，所述人⑶40L具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
[0302]在一个实施方案中，在用抗原或疫苗免疫人后4-9天后获得B-细胞。
[0303]在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤中的一个或多个:
[0304]-从免疫的或接种的或患有疾病或从疾病中存活的人的血液中获得B-细胞，和/或
[0305]-单个放置所述B-细胞，和/或
[0306]-共培养B-细胞与表达人⑶40L的哺乳动物细胞，和/或
[0307]-从共培养的人B-细胞中获得编码人抗体的可变域的核酸，和/或
[0308]-培养包含编码人抗体的可变域的核酸和任选地编码人抗体的恒定区的核酸的哺乳动物细胞并从细胞或培养基中回收抗体。
[0309]本文报道的一个方面是IL-2和IL-21用于共培养B-细胞与饲养细胞的用途。
[0310]向B-细胞 与饲养细胞的共培养中加入IL-2和IL-21提供了高度有效的B-细胞刺激和改善的生长特性，如改善的生长速率和/或抗体分泌。
[0311]在一个实施方案中，饲养细胞是表达⑶40L的哺乳动物细胞。
[0312]在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞并且饲养细胞是表达兔CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
[0313]本文报道的一个方面是IL-2和/或IL-21用于共培养B-细胞与饲养细胞的用途。
[0314]向B-细胞与饲养细胞的共培养中加入IL-2和/或IL-21和/或IL_6提供了高度有效的B-细胞刺激和改善的生长特性，如改善的生长速率和/或抗体分泌。
[0315]在一个实施方案中，饲养细胞是表达⑶40L的哺乳动物细胞。
[0316]在一个实施方案中，B-细胞是人B-细胞并且饲养细胞是表达人CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。
[0317]如本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括共培养B-细胞与饲养细胞以及IL-2和IL-21的步骤。
[0318]在一个实施方案中，饲养细胞是表达⑶40L的哺乳动物细胞。
[0319]在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞并且饲养细胞是表达兔CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
[0320]如本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括共培养B-细胞与饲养细胞以及IL-2和/或IL-21和/或L-6的步骤。
[0321]在一个实施方案中，饲养细胞是表达⑶40L的哺乳动物细胞。
[0322]在一个实施方案中，B-细胞是人B-细胞并且饲养细胞是表达人CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。
[0323]如本文报道的一个方面是包含表达兔⑶40L的CHO细胞、IL_2以及IL-21的试剂盒。
[0324]如本文报道的一个方面是包含表达人CD40L的BHK细胞和IL-2或IL-21或IL-6或其组合的试剂盒。
[0325]本文报道的一个方面是用于培养分泌特异性结合T-细胞表面抗原并且介导阴性刺激物至T-细胞的抗体的B-细胞的方法，其包括在存在IL-2或IL-21或两者的情况下共培养B-细胞与表达⑶40L的哺乳动物细胞。
[0326]如果分泌T-细胞抑制性化合物的B-细胞必须从单个或集合的B-细胞开始扩增，并且由于分泌的T-细胞抑制性化合物会降低或消除饲养细胞的作用而不能使用来自T-细胞(例如胸腺瘤细胞)的饲养细胞，则该共培养系统是有用的。
[0327]本文报道的表达⑶40L的CHO细胞可以用于产生T-细胞特异性抗体。使用由T-细胞组成的或包含T-细胞抗原的饲养系统(如胸腺瘤细胞系EL4-B5)并不合适，因为B-细胞产生的T-细胞特异性抗体会干扰培养系统。对了 T-细胞特异性抗体分泌(B-)细胞的培养，人造的T-细胞独立系统将是理想的，如本文报道的系统。
[0328]在一个实施方案中，抗原不是⑶40L。
[0329]在一个实施方案中，T-细胞抑制性化合物是特异性结合T-细胞表面抗原的抗体。
[0330]在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞并且饲养细胞是表达兔CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
[0331]在一个实施方案中，向共培养中加入IL-2和IL-21。
[0332]在一个实施方案中，B-细胞是人B-细胞并且饲养细胞是表达人CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。
[0333]在一个实施方案中，向共培养中加入IL-2和/或IL-21和/或IL_6。
[0334]如本文报道的一个方面是用于培养分泌抗体的B-细胞的方法，其以以下顺序包括
[0335]i)在存在促有丝分裂刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的第
一次共培养，和
[0336]ii)在存在抗体产生刺激剂的情况下B-细胞与表达⑶40L的哺乳动物细胞的随后
第二次共培养。
[0337]在首先在存在促有丝分裂刺激剂，然后在存在抗体产生刺激剂的情况下的B-细胞连续培养时，B-细胞的共培养在扩增B-细胞的第一期和诱导抗体分泌的第二期是分开的。
[0338]在一个实施方案中，所述第一次和第二次共培养在相同的培养容器中进行。
[0339]在一个实施方案中，用于培养分泌抗体的B-细胞的方法包括共培养B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞，由此向培养中加入第一种促有丝分裂刺激剂，然后向所述培养中加入抗体产生刺激剂。
[0340]在一个实施方案中，在加入促有丝分裂刺激剂后至少一小时加入抗体产生刺激剂。在一个实施方案中，在向培养中加入促有丝分裂刺激剂后一至三天加入抗体产生刺激剂。
[0341]在一个实施方案中，所述促有丝分裂刺激剂选自⑶40-和⑶40L相互作用的化合物、ICOS-和 ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1 ( α / β )、白细胞介素-2、白细胞介素_3、白细胞介素-4、白细胞介素_5、白细胞介素-7、白细胞介素-10、白细胞介素-14、白细胞介素-21、SAP (信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowanl颗粒(SAC ;热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF) α、I型 干扰素(例如IFN α / β )、II型干扰素(例如IFN Y )、交联抗IgG抗体、交联抗CD20抗体和交联抗CD27抗体。
[0342]在一个实施方案中，所述抗体产生刺激剂选自⑶40-和⑶40L相互作用的化合物、ICOS-和 ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF, CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCLl3,CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1 ( α / β )、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素_5、白细胞介素-6、白细胞介素_9、白细胞介素-10、白细胞介素-13、白细胞介素-21、白细胞介素-33、SAP(信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowanl颗粒(SAC ;热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF) α、I型干扰素(例如IFNa / β )、II型干扰素(例如IFN Y )、交联抗IgG抗体、交联抗CD20抗体和交联抗CD27抗体。在一个实施方案中，在第一次共培养开始时加入促有丝分裂刺激剂。
[0343]在一个实施方案中，在第一次共培养开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或
14天加入所述促有丝分裂刺激剂。
[0344]在一个实施方案中，在加入促有丝分裂刺激剂后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14天加入抗体产生刺激剂。
[0345]在一个实施方案中,共培养的每一次进行5-14天。
[0346]在一个实施方案中，培养5-21天的总时长。在一个实施方案中，培养6-14天的总时长。
[0347]在一个实施方案中，在第二次共培养开始前去除促有丝分裂刺激剂。在一个实施方案中，通过交换培养上清液和或用中性培养基洗涤细胞进行去除。
[0348]如本文报道的一个方面是用于产生特异性地结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤:
[0349]a)共培养分泌抗体的单个放置的B-细胞或B-细胞集合与表达⑶40L的哺乳动物细胞，
[0350]b)培养包含在一个或多个表达盒内含有编码步骤a)中共培养的B-细胞分泌的抗体可变区或其变体的核酸的细胞，
[0351]d)从细胞或培养基中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
[0352]在一个实施方案中，共培养是在存在促有丝分裂刺激剂和/或抗体产生刺激剂的情况下。
[0353]在一个实施方案中，所述第一次和/或第二次共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
[0354]在一个实施方案中，IL-2是人IL-2。在一个实施方案中，IL_2是鼠类IL_2。
[0355]在一个实施方案中，IL-21是人IL-21。在一个实施方案中，IL-21是鼠类IL-21。
[0356]在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
[0357]在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
[0358]在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0359]在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0360]在一个实施方案中，培养是在缺少IL-4的情况下。在一个实施方案中，培养基不含 IL-4。
[0361] 在一个实施方案中包括共培养[0362]i)在存在促有丝分裂刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的第
一次共培养，和
[0363]ii)在存在抗体产生刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的随后
第二次共培养。
[0364]在一个实施方案中方法包括以下步骤
[0365]ab)分离编码特异性结合抗原的抗体 可变轻链结构域的氨基酸序列的核酸并分离编码所述抗体的可变重链结构域的氨基酸序列的核酸，
[0366]在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤:
[0367]a)提供分泌抗体的(成熟的)B-细胞群体，
[0368]b)用至少一种荧光染料染色B-细胞群体的细胞，
[0369]c)在单独的容器中放置B-细胞染色群体的单个细胞，
[0370]d)在存在表达⑶40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21的情况下培养放置的各B-细胞，
[0371]e)测定在各B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
[0372]f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
[0373]g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
[0374]h)在细胞中引入核酸，
[0375]i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
[0376]在一个实施方案中，从动物或人的血液中获得B-细胞。
[0377]在一个实施方案中，用1-3种，或2-3种荧光染料进行染色。
[0378]在一个实施方案中，所述容器是多孔板的孔。
[0379]在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞，或BHK细胞，或NSO细胞，或Sp2/0细胞。
[0380]如本文报道的一个方法是表达兔⑶40L的哺乳动物细胞、IL-2和IL-21在共培养分泌抗体的兔B-细胞中的用途。
[0381]在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
[0382]在一个实施方案中，IL-2是人IL-2。在一个实施方案中，IL_2是鼠类IL_2。
[0383]在一个实施方案中，IL-21是人IL-21。在一个实施方案中，IL-21是鼠类IL-21。
[0384]在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
[0385]在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
[0386]在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0387]在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0388]在一个实施方案中，培养是在缺少IL-4的情况下。在一个实施方案中，培养基不含 IL-4。
[0389]在一个实施方案中，所述兔⑶40L具有SEQ ID N0:01的氨基酸序列。
[0390]如本文报道的一个方面是表达人⑶40L的哺乳动物细胞与IL-2和/或IL-21和/或IL-6 —起在共培养分泌抗体的人B-细胞中的用途。[0391]在一个实施方案中，哺乳动物细胞是BHK细胞。
[0392]在一个实施方案中，所述人⑶40L具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
[0393]如本文报道的一个方法是SAC在共培养分泌抗体的B-细胞中的用途。
[0394]在一个实施方案中，共培养是与表达CD40L的哺乳动物细胞和/或IL_2的共培养。
[0395]提供以下实施例、图和序列，以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中得以显示。应理解，可以在所示方法中进行修饰，但不背离本发明的精神。
【专利附图】

【附图说明】
[0396]图12，500个纯化的兔B-细胞与5，000个Y -照射的表达兔⑶40L的CHO细胞或EL4-B5细胞共培养7天后B-细胞的增殖。
[0397]图2在存在或缺失不同刺激物的情况下共培养6天后B-细胞与饲养细胞的共培养的显微图像:a)EL4-B5细胞与Zubler混合物，b)表达rbCD40L的CHO细胞与人IL-21，
c)表达rbCD40L的CHO细胞与人IL-2，d)wt_CH0细胞与人IL-21以及人IL_2，e)表达rbCD40L的CHO细胞与人IL-21以及人IL_2，f)表达rbCD40L的CHO细胞与人IL-21以及人 IL-2 和 SAC。
[0398]图3每孔750个 分选的人IgG+记忆B-细胞与5，000个Y -照射的表达⑶40L的BHK细胞以及所示饲养混合物共培养。显示了 8天后分离的人记忆B-细胞的增殖。
[0399]图4未触及(untouched)的分离的人B-细胞的增殖。从PBMC分离后，每孔90，000个集合的人B-细胞与Y -照射的表达⑶40L的BHK细胞以及所示饲养混合物共培养。显示了 7天后的增殖(绝对细胞数量)。
[0400]图5显示通过FACS分析的作为增殖程度的CFSE稀释的点状图。显示了门控CD19+B-细胞(Y-轴)的CFSE染色(X-轴)。
[0401]图6温育3天后的B-细胞簇(在没有饲养细胞的情况下培养的)。单独(a)或在存在人IL-2 (b)或IL-2和SAC(c)的情况下培养三天的人B-细的显微图像。
[0402]图7每孔500个分选的兔IgG+B-细胞与10，000个Y -照射的表达兔⑶40L的CHO细胞以及不同来源的IL-2和IL-21及其组合共培养。显示了 7天后培养上清液的抗体滴度(中位数)；l:mu IL-2, 2:hu IL-2, 3:mu IL-21, 4:hu IL-21, 5:hu IL-2 和 hu IL-21, 6:huIL-2 和mu IL-21, 7:mu IL-2 和 hu IL-21, 8:mu IL-2 和 mu IL-21 ;y-轴:rb IgG[μg/ml]。
[0403]图8图7的共培养的CTG生存力测定的结果。
[0404]图9每孔500个融化的分选兔IgG+B-细胞与10，000个Y -照射的CHO-Kl细胞(低于检测极限)或10，000个Y-照射的表达兔CD40L的CHO细胞以及不同来源的IL-2和IL-21及其组合共培养。显示了 7天后培养上清液的抗体滴度(中位数)；l:mu IL_2，2:huIL-2, 3:mu IL-21, 4:hu IL-21, 5:hu IL-2和hu IL-21, 6:hu IL-2 和 mu IL-21, 7:mu IL-2和 hu IL-21, 8:mu IL-2 和 mu IL_21;y_ 轴:rb IgG[μg/ml]。
[0405]图10图9的共培养的CTG生存力测定的结果。
[0406]图11每孔500个分选的兔IgG+B-细胞与10，000个Y -照射的CHO-Kl细胞(右边的条；由于低于检测极限而不可见)或10，000个Y-照射的表达兔⑶40L的CHO细胞(左边的条)以及不同来源的IL-2和IL-21及其组合共培养。显示了 7天后培养上清液的抗体滴度(中位数)。
[0407]图12图11的共培养的CTG生存力测定的结果。
[0408]图13实施例14中低B-细胞密度(500个B-细胞)的B-细胞与饲养细胞的共培养的显微图像。
[0409]图14每孔2500个分选的兔IgG+B-细胞与10，000个Y -照射的CHO-Kl细胞(右边的条)或10，000个Y -照射的表达兔⑶40L的CHO细胞(左边的条)以及不同来源的IL-2和IL-21及其组合共培养。显示了 7天后培养上清液的抗体滴度(中位数)。
[0410]序列描述
[0411]SEQ ID NO:01 兔CD40L的氨基酸序列
[0412]SEQ ID NO:02 人CD40L的氨基酸序列 [0413]SEQ ID NO:03 小鼠CD40L的氨基酸序列
实施例
[0414]材料和方法
[0415]重鉬DNA抟术
[0416]使用如Sambrook, J.，等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)中所述的标准方法操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
[0417]DNA序列测定
[0418]通过在SequiServe GmbH(Vaterstetten, Germany)上进行的双链测序测定 DNA 序列。
[0419]DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
[0420]GCG，s (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)软件包版本 10.2 和Infomax’s Vector NTI Advance套件版本8.0用于序列创建、基因定位、分析、注释和阐明。
[0421]基因合成
[0422]通过Geneart GmbH (Regensburg, Germany)制备编码兔⑶40L的期望基因区段的cDNA。所述基因区段的侧翼是单个的限制性核酸内切酶切割位点，以利于如下所述克隆表达构建体。通过DNA测序验证亚克隆的基因片段的DNA序列。
[0423]细朐因子
[0424]Zubler 混合物:2ng/ml 小鼠 IL-1 β、50ng/ml 小鼠 IL_2、10ng/ml 小鼠 IL-10 和2ng/ml小鼠TNFa (终浓度)
[0425]测试用于建立确定的细胞因子混合物的细胞因子(如果没有另行说明，以终浓度给出):
【权利要求】
1.用于产生抗体的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下共培养兔B-细胞与表达兔⑶40L的哺乳动物细胞的步骤。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述B-细胞是非成熟的B-细胞。
3.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述IL-2是人IL-2并且所述IL-21是鼠类 IL-21。
4.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述B-细胞是单个放置的B-细胞。
5.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述B-细胞是IgG阳性的B-细胞(IgG+B-细胞)。
6.1L-2和/或IL-21用于共培养兔B-细胞与饲养细胞的用途。
7.权利要求6的用途，其特征在于所述饲养细胞是表达兔CD40L的哺乳动物细胞。
8.用于培养分泌特异性结合T-细胞表面抗原并且介导阴性刺激物至T-细胞的抗体的兔B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下共培养B-细胞和表达兔⑶40L的哺乳动物细胞。
9.用于培养分泌抗体的兔B-细胞的方法，其以以下顺序包括 i)在存在促有丝分裂 刺激剂的情况下兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的第一次共培养，和 ?)在存在抗体产生刺激剂的情况下兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的随后第二次共培养。
10.权利要求9的方法，其特征在于所述促有丝分裂刺激剂选自CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCLl2 (SDF-1)、CXCLl3, CXCL16, Flt_3L、白细胞介素-1 ( α / β )、白细胞介素-2、白细胞介素_3、白细胞介素_4、白细胞介素-5、白细胞介素-7、白细胞介素-10、白细胞介素-14、白细胞介素-21、SAP (信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowanl颗粒(SAC ;热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF) α、I型干扰素(例如IFN α / β )，和II型干扰素(例如 IFN Y ) ο
11.权利要求9或10任一项的方法，其特征在于所述抗体产生刺激剂选自CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF, CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1 ( α / β )、白细胞介素-2、白细胞介素_3、白细胞介素_4、白细胞介素_5、白细胞介素_6、白细胞介素_9、白细胞介素-10、白细胞介素-13、白细胞介素-21、白细胞介素-33、SAP (信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowanl颗粒(SAC ;热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpGODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF) α、I型干扰素(例如IFN α / β )，和II型干扰素(例如IFN Y ) ο
12.用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤: a)在存在IL-2和IL-21的情况下共培养分泌抗体的兔B-细胞的集合或单个分泌抗体的兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞， b)培养包含在一个或多个表达盒内含有编码步骤a)中共培养的兔B-细胞分泌的抗体可变区或其人源化变体的核酸的细胞，c)从细胞或培养基中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
13.权利要求12的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤: a)提供分泌抗体的(成熟的)兔B-细胞群体(其获得自实验动物或人的血液)， b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色兔B-细胞群体的细胞， c)将B-细胞染色群体的单个细胞放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的容器，其为多孔平板的一个孔)， d)在存在表达兔⑶40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL21的情况下培养放置的各兔B-细胞， e)测定在各兔B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性， f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸， g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸或其编码轻链和/或重链可变域的人源化形式的变体用于表达抗体， h)在细胞中引入核酸， i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
14.表达兔⑶40L的哺乳动物细胞、IL-2和IL-21在共培养分泌抗体的兔B-细胞中的用途。
15.SAC在共培养分泌抗体的B-细胞中的用途，任选地与表达⑶40L的哺乳动物细胞和/或IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培养分泌抗体的B-细胞中的用途。
16.用于产生抗体的方法，其包括在存在IL-2或IL-21或IL-6或其组合的情况下共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
17.权利要求16的方法，其特征在于所述B-细胞是非成熟的B-细胞。
18.权利要求16-17任一项的方法，其特征在于共培养是在存在IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
19.权利要求16-18任一项的方法，其特征在于所述B-细胞是单个放置的B-细胞。
20.权利要求16-19任一项的方法，其特征在于所述B-细胞是IgG阳性的B-细胞(IgG+B-细胞)。
21.1L-2和/或IL-21和/或IL-6用于共培养人B-细胞与饲养细胞的用途。
22.权利要求21的用途，其特征在于所述饲养细胞是表达人CD40L的哺乳动物细胞。
23.权利要求21-22任一项的用途，其特征在于使用IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21 和 IL-6。
24.用于培养分泌特异性结合T-细胞表面抗原并且介导阴性刺激物至T-细胞的抗体的人B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下共培养人B-细胞和表达人⑶40L的哺乳动物细胞。
25.用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤: a)在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下共培养分泌抗体的人B-细胞的集合或单个分泌抗体的人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞，b)培养包含在一个或多个表达盒内含有编码步骤a)中共培养的人B-细胞分泌的抗体可变区或其变体的核酸的细胞， c)从细胞或培养基中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
26.权利要求25的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤: a)提供分泌抗体的(成熟的)人B-细胞群体， b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色人B-细胞群体的细胞， c)将B-细胞染色群体的单个细胞放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的容器，其为多孔平板的一个孔)， d)在存在表达人CD40L的哺乳动物细胞和IL-2和/或IL21和/或IL-6的情况下培养放置的各人B-细胞， e)测定在各人B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性， f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸， g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域编码核酸用于表达抗体， h)在细胞中引入核酸， i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
27.权利要求25-26任一项的方法，其特征在于共培养是在存在IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
28.表达人⑶40L的哺乳动物细胞、IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培养分泌抗体的人B-细胞中的用途。
29.权利要求28的用途，其特征在于使用IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21和IL-6。
【文档编号】C12N5/0781GK103946236SQ201280057401
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2011年11月23日
【发明者】J·恩德尔, J·菲舍尔, P·科恩, S·奥夫纳, J·普拉策尔, S·西伯尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司