通过尿分析来定量肾标志物的方法

通过尿分析来定量肾标志物的方法
【专利摘要】本发明涉及患者中的肾病理学状态的体外诊断方法。根据本发明，这样的方法包括下列步骤：a)获得来自所述患者的尿样品；b)在所述样品中检测至少一种关于所述肾病理学状态的标志物和至少一种对于尿道上皮细胞和/或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物；和c)通过用所述至少一种对于尿道上皮细胞和/或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物对所述至少一种关于所述肾病理学状态的标志物进行标准化，来测定所述至少一种关于所述肾病理学状态的标志物的表达阈值。
【专利说明】通过尿分析来定量肾标志物的方法
1.发明领域
[0001]本发明的领域为尿肾脏病学的领域。更确切而言，本发明涉及泌尿系统的病理学状态的体外诊断方法。
2.现有技术
[0002]肾疾病可以损害肾的不同的结构区室:血管、肾小球、肾小管、间质。这些损害导致急性和/或慢性肾功能不全，其最后发展是肾的功能单元的完全破坏，所述肾的功能单元被细胞外基质的扩展所代替，即肾纤维化。各种各样的病因学相应于肾的这些损害:排泄道的阻塞、炎症、自身免疫性、变态反应、沉积疾病、高血压、糖尿病、血管病、局部缺血、毒性，等等。肾疾病可以触及天生的肾或在肾移植后的同种异体移植物。在法国，估计每年有3000个新的移植患者病例(肾脏、心脏、肝脏、骨髓、肺，等等)。对于经移植的患者的系统随访使得能够研究向着纤维化发展的肾疾病的早期时间。上皮-间充质转变(epithelio-mesenchymal transition ；EMT)的标志物在肾组织中的表达使得能够早期地检测肾组织的纤维性疾病，其可以由局部缺血、排斥或免疫抑制剂(特别是环孢菌素 A (CsA))的毒性引起(Slattery 等人，Am J Pathol.2005 年 8 月，167 (2): 395-407 ；Hertig等人，American Journal of Transplantation, 2006 ;Galichon等人，FibrogenesisTissue Repair, 201 1 ；Galichon 等人,Transplantation, 2011)。
[0003]EMT是这样的动态过程，在其过程中细胞丧失其上皮特征并获得间充质特征。这些改变同时影响细胞的形态学以及其运转。当它损害肾小管细胞时，它表现出向着纤维化和慢性肾功能不全的发展(Hertig等人，J Am Soc Nephrol, 2008)。因此,需要在已经经历了移植的患者中监视该现象的出现以便调整或修改免疫抑制治疗。
[0004]目前，用于检测和监视任何肾病理学状态的参考方法是活组织检查。活组织检查在于通过经皮、经静脉或手术途径抽取肾中的组织探心试样。然后，使该样品经历组织学检查以检测病理学状态的可能征候(肾小球、肾小管、血管或间质区室的破坏、细胞浸润或肥大)。
[0005]然而，该方法包括多个缺点。样品抽取对于患者来说不是没有风险。观察到许多并发症，例如血尿，阻塞性肾功能不全甚至无尿症，在肾周区域中血肿的出现，动静脉瘘的出现，和更罕见地出血，移植物丢失，死亡。除了与任何侵入性动作相关的风险外，还可能的是在不代表肾的总体状态的区域中进行活组织检查并因此由于该取样而低估或高估患者的真实状况。
[0006]此外，鉴于活组织检查不能够以接近的时间间隔系统地进行，该方法也无法使得能够早期地检测病理学状态的出现。另外，实施肾活组织检查是一项花费大的、复杂的、侵入性的且对于患者而言痛苦的操作。
[0007]因此，需要找到一种非侵入性的、简单的、经济的、可靠的、早期的且具有最小的对于患者的可能风险的诊断方法。
[0008]3.发明目标[0009]本发明的目标尤其在于缓解现有技术的这些缺点。
[0010]更确切而言，在至少一个实施方案中，本发明的目标是提供肾病理学状态或具有肾反响的病理学状态的早期诊断方法。
[0011]在至少一个实施方案中，本发明的另一个目标是利用非侵入性的诊断方法。
[0012]在至少一个实施方案中，本发明的目标还在于利用可靠且精确的诊断方法。
[0013]在至少一个实施方案中，本发明的另一个目标是利用对于实施来说简单的诊断方法。
[0014]在至少一个实施方案中，本发明的另一个目标是利用更经济的诊断方法。
[0015]在至少一个实施方案中，本发明的另一个目标是利用用于追踪治疗的功效和耐受性的方法。[0016]最后，在至少一个实施方案中，本发明的另一个目标是利用对于患者而言疼痛更少的诊断方法。
[0017]4.发明说明
[0018]这些目标，以及后面将会出现的其他目标，全部或部分地借助于患者中的病理学状态的体外诊断方法来达到。
[0019]根据本发明，这样的方法包括下列步骤:
[0020]a)获得来自所述患者的尿样品；
[0021]b)在所述样品中检测至少一种关于所述病理学状态的标志物和至少一种对于尿道上皮细胞和/或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物；和
[0022]c)通过用所述至少一种对于尿道上皮细胞和/或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物对所述关于所述病理学状态的标志物进行标准化，来测定所述至少一种关于所述病理学状态的标志物的表达阈值。
[0023]因此，本发明基于使用包含在尿中的细胞和微颗粒，以便从其中提取遗传物质，并将与病理学状态相关联的目的基因的表达与对于未被所述病理学状态所触及的尿细胞而言特异的基因的表达进行比较。
[0024]这是因为，尿包含少量的来自尿排泄道上皮的正常更新的尿道上皮细胞。尿还可以包含白细胞、肾小管或肾小球细胞、血液等以及微颗粒，以尤其随肾病理学状态的存在而可变的量。
[0025]“微颗粒”是指可以在激活或凋亡过程期间由大多数细胞所释放的复杂的囊泡状结构。它们由暴露出跨膜蛋白和受体的磷脂双层构成，并且包含来自其母细胞的胞质成分例如酶、转录因子和mRNA。
[0026]“尿道上皮细胞”是指构成从肾盂至尿道的人尿道上皮的移行上皮细胞。这些细胞具有各式各样的形状:圆柱形、风筝形、伞形、小气球形。
[0027]“对于尿道上皮细胞而言特异的标志物”是指这样的基因，所述基因由尿道上皮细胞或尿道上皮微颗粒特异地表达(无论这在细胞内还是在其表面上)，并且由所述细胞进行的所述基因的合成水平不依赖于可以影响肾细胞的病理学状态。因此，该概念不同于持家基因的概念，所述持家基因的表达是到处存在的，无论细胞类型、细胞功能或其状态是什么。
[0028]尽管少见，但用目前的分子生物学和生物化学方法可能从包含在患者的尿样品中的细胞和微颗粒中提取出核酸和蛋白质。为了消除与样品中的细胞和微颗粒的量相关的偏差，惯例是根据持家基因例如GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、18S核糖体RNA、亲环蛋白A或B、β-联蛋白或者HPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)的基因的表达来表不目的基因的表达(Absolute quantification of mRNA using real-time reversetranscription polymerase chain reaction, S.A.Bustin, Journal of MolecularEndocrinology, 2000, 25, 169-193)
[0029]然而，该方法没有考虑病理学状态的细胞特异性。因此，与影响精确细胞类型的病理学状态相关的基因的表达的改变可以被来自存在于尿中的其他细胞类型的持家基因的大量表达所掩盖。
[0030]因此，本发明的贡献之一是用不依赖于受影响的细胞类型的基因的表达来对目的基因的表达进行标准化。该标准化步骤使得能够测定相对于不依赖于肾来源的尿细胞的数量和性质变动的尿标志物而言病理学标志物的表达阈值。在这种情况下，可能的是，知晓该标志物是大量地表达，还是相反地非常低地表达。该特征使得能够获得可靠的、精确的且更准确地反映患者的健康状态的诊断测试。因此，根据本发明的方法可以用于诊断目的或者用于监视病理学状态的发展。
[0031]此外，从尿样品开始工作具有许多优点:
[0032]-所述样品是容易可得的；
[0033]-所述取样是非侵入性的且不痛的；
[0034]-所述取样是经济的。
[0035]该方法的简单性还使得能够在所有类型的分析实验室中施行，而不要求特殊的技术能力或除了通常所使用的那些之外的其他器材。因此，用于施行该方法的特殊投入的不存在使得能够降低分析成本。
[0036]最后，该标准化方法可以应用于不同的病理学状态(肾的或非肾的)，如果这些病理学状态改变排泄出且存在于尿中的尿道上皮细胞和/或微颗粒的表达和/或量。
[0037]此外，本发明涉及这样的体外诊断方法，其中步骤b)包括检测所述至少一种对于尿道上皮细胞和/或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物的转录产物以及所述至少一种关于所述病理学状态的标志物的转录产物。
[0038]研究转录产物比研究细胞基因组中基因的存在更可靠。这是因为，众所周知，细胞基因组中基因的存在并不必然可与其在所述细胞中的表达相关联，因为特定基因的表达的调节服从于许多参数。因此，检测转录产物使得能够获得更精确且更可靠的结果。
[0039]本发明的另一个目标是这样的方法，其中步骤b)借助于核酸扩增技术来实施，所述核酸扩增技术选自RT-PCR、定量PCR、终点PCR、半定量PCR或其组合。
[0040]PCR(聚合酶链式反应)是指在于在体外以大量拷贝复制靶DNA片段的技术。RT-PCR (逆转录酶-聚合酶链式反应)是指从所提取的信使RNA开始的互补DNA的体外合成。定量PCR，也称为实时PCR，是指靶DNA片段的体外复制技术，其还使得能够测量该靶片段的初始量。半定量PCR与定量PCR的区别在于，PCR在数个点处中断，从而使得能够评价初始的DNA的量。该类型的PCR在当DNA的量异常地低时是有用的。终点PCR将Northern印迹技术与经典的PCR相联合，以便经由在琼脂糖凝胶上的条带的比较来评价DNA的初始量。[0041]这些有着低的实施成本的方法具有提供快速且可靠的结果的优点，这与诊断测试的要求相容。
[0042]此外，本发明还涉及这样的体外诊断方法，其中步骤b)借助于核酸杂交技术来实施，所述核酸杂交技术选自原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、生物芯片、Northern印迹或Southern印迹。
[0043]本发明还涉及这样的体外诊断方法，其中步骤b)通过核酸测序方法来实施。 [0044]本发明的目标还在于这样的体外诊断方法，其中所述病理学状态为肾病理学状态，并且选自肾纤维化、肾上皮细胞的表型变化、移植物排斥、癌症、肾小球疾病(糖尿病、膜外性肾小球肾炎、极小肾小球损伤、节段性和局灶性透明变性等)、肾小管疾病(急性肾小管坏死、上皮-间充质转变的标志物的表达、萎缩、细胞排斥、排泄道的阻塞等)、肾间质疾病(炎症、纤维化)、肾血管疾病(动脉高血压、血栓性微血管病、体液性排斥等)。
[0045]“上皮-间充质转变(EMT) ”是指这样的生物学过程，所述生物学过程使得通常与基底细胞相互作用的极化上皮细胞能够参加多个允许其获得间充质细胞表型的生物化学转化，所述间充质细胞表型包括增加的迁移能力、侵袭性特征、增加的对于凋亡的抗性以及细胞外基质的组分的大量增加(Kalluri R, Weinberg RA, The basics ofepithelial-mesenchymal transition, J Clin Invest.119 (2009) 1420-1428)。上皮表型变化是可以在临床情况下在组织中进行研究的EMT的标志物(例如，在肾小管上皮中的波形蛋白和 β _ 联蛋白)(Hertig A 等人，Early epithelial phenotypic changes predictgraft fibrosis, J Am Soc Nephrol.19(2008) 1584-1591)。
[0046]本发明的另一个目标是这样的方法，在所述方法过程中所述患者已经接受了器官移植，并且所述肾病理学状态为在肾移植物中间质纤维化、肾小管萎缩或上皮-间充质转变的存在。
[0047]因此，根据本发明的方法使得能够有效地和早期地检测出诱导肾中的上皮表型变化的肾病理学状态例如炎症或EMT的出现。
[0048]本发明的目标还在于这样的体外诊断方法，其中至少一种对于所述肾病理学状态而言特异的遗传标志物选自:人的CD45(SEQ ID1)、CD68(SEQ ID2)和VM(SEQ ID3)基因，以及与这些基因具有至少80 %，优选地至少85 %，优选地至少90 %，优选地至少95 %，优选地至少99%的序列同源性的基因。
[0049]作为精确表示，人的CD45基因还具有符号PTPRC (C型蛋白质酪氨酸磷酸酶受体)。在下面的描述中，将会不加区别地用符号CD45或PTPRC来表示人的CD45或PTPRC基因。
[0050]发明人已经令人惊讶地发现，在临床上稳定的但其移植物活组织检查表明存在上皮表型变化的肾移植患者的尿中，这些基因的表达大大地增加。该过表达可与上皮-间充质转变期间突然发生的上皮表型变化的存在以及在肾同种异体移植的活组织检查中肾小管-间质损害的存在相关联，其中这些活组织检查在移植后三个月在全身筛查的背景下进行。在本发明的范围内，可能的是，仅探究单个基因(对于病理学状态而言特异的标志物)的表达。然而，优选的是，为了使诊断精细，探究不同的其在尿中的表达报告特定肾病理学状态的存在的基因的组合。作为例子，可以提及用尿空斑蛋白进行标准化的CD45或PTPRC和CD68的基因表达的探究，以检测在移植物中炎性细胞的存在。还可以探究某些肿瘤标志物的表达。作为关于透明细胞癌的标志物的例子，可以提及在监视肾癌的背景下消旋酶、窖蛋白-1(SEQ ID29)、RORl (SEQ ID30)、CDlO (SEQ ID31)、角蛋白 7、波形蛋白(SEQ ID3)、TP53 (SEQ ID26)的探究。
[0051]通过用BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)软件，在 NCBI 网站(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi ? PROGRAM = blastn&BLAST_PROGRAMS =megaBlast&PAGE_TYPE = BlastSearch&SHOff_DEFAULTS = on&LINK_L0C = blasthome)上可得的算法blastn，进行核苷酸序列的线性比较，测定两个核苷酸序列之间的“同源序列”或“序列同源性”。
[0052]为该分析所选择的参数如下:
[0053]-数据库:人基因组+转录物(HumanG+T)；
[0054]-不排除环境序列的模型或样本；
[0055]-程序的优化:blastn (Somewhat similar sequences)；
[0056]-短的请求(shortqueries)=关于输入序列的自动参数(automaticallyadjusted parameters for input sequence)；
[0057]-阈值(expectthreshold) = 10 ；
[0058]-序列长度 (wordsize) = 11 ；
[0059]-最大匹配(max match in a query range) = 0。
[0060]关于结果记录参数(scoring parameters),将参数固定为缺省值(匹配/错配得分(match/mismatch scores) = 2-3 ;缺口成本(gap costs)=存在(existence):5,延伸(extension): 2) 0最后，不应用任何过滤器。由于在该网站上所述参数是英文的，因而在括号内指出这些参数的准确名称。
[0061]根据另一个有利的实施方案，所述病理学状态为改变排泄到尿中的细胞和/或微颗粒的量的病理学状态。
[0062]优选地，所述改变排泄到尿中的细胞和/或微颗粒的量的病理学状态选自:肾小球疾病，例如节段性和局灶性透明变性；肾小管疾病，例如急性肾小管坏死；上皮表型变化；细胞排斥和间质疾病，例如急性移植物排斥、斯耶格伦病和结节病。
[0063]因此，根据本发明的方法使得能够通过收集患者的尿样品来以可靠、快速且非侵入性的方式检测非肾疾病的发展，如果这些病理学状态改变基因表达谱和/或排泄到尿中的细胞的量。
[0064]肾小管坏死表现为在尿中肾小管细胞数目的增加，这归因于肾小管上皮壁的大量脱落。节段性或局灶性透明变性伴随有在尿中的大量的足细胞。白细胞数目的增加是急性移植物排斥的征候。
[0065]有利地，所述至少一种对于尿道上皮细胞而言特异的标志物选自:人的尿空斑蛋白IA (SEQ ID4)、尿空斑蛋白IB (SEQ ID5)、尿空斑蛋白2 (SEQ ID6)、尿空斑蛋白3A (SEQID7)、尿空斑蛋白 3B(SEQ ID8)、尿空斑蛋白 3BL(SEQ ID9)、Bcasl (SEQ ID10)、CEP152 (SEQIDl I)、CRABP2 (SEQ ID12)、DNASEl (SEQ ID13)、KRT20 (SEQ ID14)、PLEKHFI (SEQ ID15)、PLEKHG4B(SEQ ID16)、RCNl(SEQ ID17)、SEMA5B(SEQ ID18)、SULT2A1(SEQ ID19)、TFFl(SEQID20)、VILL(SEQ ID21)、ZNF720 (SEQ ID22)基因，以及与这些基因具有至少80%，优选地至少85 %，优选地至少90 %，优选地至少95 %，优选地至少99 %的序列同源性的基因。
[0066]在存在于尿中的细胞之中，仅尿道上皮细胞表达这些基因。这些基因由尿道上皮细胞和/或微颗粒特异地和恒定地表达，而不依赖于肾病理学状态。当然，这些基因存在于包含在生物体的每个细胞的细胞核中的遗传物质之中。然而，不是所有基因都由生物体的所有细胞以相同的方式表达。换言之，不是所有基因都在构成人体的所有细胞中被从DNA转录为mRNA，然后从mRNA翻译为蛋白质。但是，发明人已经发现，在包含在尿中的细胞和微颗粒之中，这些基因由尿道上皮细胞特异地表达，并且这以恒定的方式。因此，它们构成了选择参照系，用于使与特异地影响肾细胞或改变其在尿中的量的病理学状态相关的基因标准化。发明人想要强调，上述基因事实上可以在其他细胞类型中检测到，例如当该检测基于在总DNA中基因存在的简单探究而不是基于由一种细胞类型所表达的基因时。这些基因还可以由其他细胞类型表达。然而，其在本发明中的利益与下述事实相关:在可以在患者尿样品中发现的所有细胞类型之中，仅尿道上皮细胞表达这些基因，而不依赖于病理学状况。因此，在本发明的范围内，对于尿道上皮细胞或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物的概念不同于持家基因的概念。这是因为，持家基因是由所有细胞表达的基因，无论其细胞类型或其功能为何。相反地，“对于尿道上皮细胞而言特异的标志物”相应于仅由在能够重新出现在尿样品中的全部细胞之中的尿道上皮细胞所表达的基因。
[0067]此外，这些细胞已被发明人鉴定为使得能够获得相对于通过持家基因(18S RNA、GAPDH等)的标准化方法而言优异的统计学相关性(P值〈0.01)。将对于每个基因所获得的P值显示在下面的表1中。
[0068]表1 一对于尿道上皮细胞而言特异的标志物
[0069]
【权利要求】
1.患者中的病理学状态的体外诊断方法，其包括下列步骤: a)获得来自所述患者的尿样品； b)在所述样品中检测至少一种关于所述病理学状态的标志物和至少一种对于尿道上皮细胞和/或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物；和 c)通过用所述至少一种对于尿道上皮细胞和/或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物对所述至少一种关于所述病理学状态的标志物进行标准化，来测定所述至少一种关于所述病理学状态的标志物的表达阈值。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤b)包括检测所述至少一种对于尿道上皮细胞和/或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物的转录产物以及所述至少一种关于所述病理学状态的标志物的转录产物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤b)借助于核酸扩增技术来实施，所述核酸扩增技术选自RT-PCR、定量PCR、终点PCR、半定量PCR或其组合。
4.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述病理学状态为肾病理学状态，所述肾病理学状态选自肾纤维化、肾上皮细胞的表型变化、移植物排斥、癌症、肾小球疾病、肾小管疾病、肾间质疾病和肾血管疾病。
5.根据权利要求4的方法，其中所述至少一种对于所述肾病理学状态而言特异的标志物选自:人的⑶45、⑶68和VM基因，以及与这些基因具有至少80%，优选地至少85%，优选地至少90 %，优选地至少95 %，优选地至少99 %的序列同源性的基因。
6.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述病理学状态为改变排泄到尿中的细胞或微颗粒的量的病理学状态。
7.根据权利要求6的方法，其中所述改变排泄到尿中的尿道上皮细胞或尿道上皮微颗粒的量的病理学状态选自:节段性和局灶性透明变性、急性肾小管坏死、上皮表型变化、急性移植物排斥、斯耶格伦病、结节病。
8.根据权利要求1至7之一的方法，其中所述至少一种对于尿道上皮细胞和/或尿道上皮微颗粒而言特异的标志物选自:人的尿空斑蛋白1A、尿空斑蛋白1B、尿空斑蛋白2、尿空斑蛋白3A、尿空斑蛋白3B、尿空斑蛋白3BL、BcasU CEP152, CRABP2、DNASEU KRT20、PLEKHF1、PLEKHG4B、RCNl、SEMA5B、SULT2A1、TFFl、VILL、ZNF720 基因，以及与这些基因具有至少80 %，优选地至少85 %，优选地至少90 %，优选地至少95 %，优选地至少99 %的序列同源性的基因。
9.根据权利要求1至8之一的方法，其还包括将经标准化的病理学状态的所述标志物的所述表达阈值与其表达不被该疾病所改变的基因的表达阈值进行比较的步骤。
10.用于从来自患者的尿样品开始检测肾上皮细胞的表型变化的体外诊断试剂盒，所述试剂盒包含至少一对用于在所述样品中检测至少一种对于病理学状态而言特异的标志物的引物，和至少一对用于检测尿空斑蛋白IA的引物，其中所述至少一种对于病理学状态而言特异的标志物选自人的⑶45、⑶68和VIM基因。
11.根据权利要求10的体外诊断试剂盒用于检测肾病理学状态的用途，其中所述肾病理学状态为肾上皮表型变化。
【文档编号】C12Q1/68GK103958698SQ201280058135
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年10月19日 优先权日:2011年10月20日
【发明者】P·加利雄, E·龙多, I·布罗舍里乌, Y-C·克叙-迪布瓦, A·埃尔蒂格 申请人:公共救济事业局-巴黎医院