用于接种目的的来自eb病毒的第二代病毒样颗粒(vlp)的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基本不含EB病毒(EBV)DNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)。本发明还涉及包含EBV基因组的多核苷酸，所述EBV基因组：a)缺乏选自BFLF1基因、BBRF1基因、BGRF1基因、BDRF1基因、BALF3基因、BFRF1A基因和BFRF1基因的至少一个可表达基因；和b)在适宜的宿主细胞中产生本发明的EB-VLP。本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸的载体和宿主细胞，以及制备所述EB-VLP的方法、制备其疫苗的方法、包含所述EB-VLP的疫苗和组合物。
【专利说明】用于接种目的的来自EB病毒的第二代病毒样颗粒(VLP)
[0001 ] 本发明涉及基本不含EB病毒(EBV) DNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)。本发明还涉及包含EBV基因组的多核苷酸，所述EBV基因组a)缺乏选自BFLFl基因、BBRFl基因、BGRFl基因、BDRFl基因、BALF3基因、BFRFlA基因和BFRFl基因的至少一个可表达基因，b)在适宜的宿主细胞中产生本发明的EB-VLP。本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸的载体和宿主细胞，以及制备所述EB-VLP的方法、制备其疫苗的方法、包含所述EB-VLP的疫苗和组合物。
[0002]致癌性EB病毒(EBV)隶属于可以潜伏性感染人B淋巴细胞的Y疱疹病毒家族。EBV在超过90%的人群中建立持续终生的B细胞感染(Kieff和B.Rickinson.(2006), Epstein-Barr virus and its replication,在 D.M.Knipe 和 P.Μ.Howley 编辑)，Fields virology,第 5 版 Lippincott-Raven, Philadelphia, PA.2603-2654 中；Kiippers, R.(2003).B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barrvirus, Nat.Rev.1mmunol.3:801-812)。在健康个体中，大多数EBV感染的B细胞显示有限的病毒基因表达和静息表型。潜伏性感染的细胞终端分化为浆细胞导致病毒再活化、产生，并再感染 B 细胞(Laichalk, L.L.和 D.A.Thorley-Lawson.(2005), Terminaldifferentiation into plasma cells initiates the replicative cycle of Epstein-Barrvirus in viv0.J.Virol.79:1296-1307)。所有病毒潜伏基因的表达导致生长转化和感染的B细胞的增殖，其在体外反映为EBV转化的类淋巴母细胞B细胞系的派生，在体内反映为EBV与包括不同类型的淋巴瘤的多种B细胞淋巴组织增生性疾病的相关。如EBV相关恶性肿瘤在先天性或医源诱发性T细胞机能障碍患者中提高的发病率(Rickinson，A.B.和 E.Kieff.(2006), Epstein-Barr virus,在 D.M.Knipe 和 P.M.Howley (编辑)，Fieldsvirology,第 5 版 Lippincott-Raven, Philadelphia, PA., 2655 - 2700 中)及通过多克隆EBV特异性T细胞 系的输注成功治疗了造血干细胞移植受体中的EBV相关移植后淋巴组织增生性疾病(Rooney, C.Μ.等，(1998), Infusion of cytotoxic T cells for the preventionand treatment of Epstein-Barr virus-1nduced lymphoma in allogeneic transplantrecipients.Blood92:1549 - 1555)所显示，EBV 感染受 T 细胞控制。
[0003]因此，本领域中存在发展疫苗来预防或清除EBV感染的需要。这种疫苗将适用于表观健康的个体，所以这种疫苗的安全性将是主要的顾虑。迄今为止，只有抗EBV gp350的肽疫苗可购得。但是，此疫苗的第一期临床试验显示，它未在EBV阴性移植受体中预防 EBV 感染(Rees L 等(2009)，A phase I trial of Epstein-Barr virusgp350vaccine for children with chronic kidney disease awaiting transplantation.Transplantation88(8):1025-9)。
[0004]病毒样颗粒(VLP)是与成熟病毒粒子相似或相同但缺乏病毒基因组的结构。通常，它们以比例如单体肽高的程度刺激宿主的免疫反应，这就是为什么优先用它们针对几种病毒(如乙型肝炎病毒和乳头瘤病毒)进行接种(Greenstone，H.L.等(1998), Chimeric papillomavirus virus-like particles elicit antitumor immunityagainst the E7oncoprotein in an HPV16tumor model.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:1800 -1805 ；Mandic, A.和 T.Vujkov.(2004).Human papillomavirus vaccine as a new way ofpreventing cervical cancer:a dream or the future ? Ann.0ncol.15:197 - 200)。VLP 疫苗方案的关键安全性方面是，所使用的VLP必须不含病毒基因组(DNA或RNA)，因为否则接种可诱发病毒复制和/或病毒的潜伏性感染。
[0005]EBV和其他疱疹病毒的病毒裂解性复制(即导致形成后代病毒颗粒的过程)是由不同蛋白质种类的连续激活引起的复杂过程。在裂解性复制过程中，病毒基因组从不同复制起点扩增几千倍，形成高度分支的结构。然后这些巨大的多联体分解为单位长度的线性病毒基因组，所述单位长度的线性病毒基因组将在感染的细胞核内包装入预先形成的前衣壳。包含病毒DNA的衣壳将经历进一步的构象和结构变化，并作为有包膜的病毒粒子颗粒从感染细胞排出(Roizman, B.和 D.Μ.Kni pe.(2001), Herpes simplex viruses and theirreplication,在 D.M.Knipe, P.M.Howley, D.E.Griffin, R.A.Lamb, M.A.Martin, B.Roizman和 S.E.Straus (编辑)，Fields virology,第 4 版，2 卷 Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia, 2399 - 2459页中)。导致EBV衣壳化的一种必需的顺式元件是位于线性基因组两端的末端重复序列(TR)，其涉及从病毒裂解性复制期间形成的多联体切出单个病毒基因组以及它们的包装。已产生了缺失这些末端重复序列的EBV突变株(delTR-EBV)。已显示，诱导裂解周期后，产生大量空的EB-VLP，基因组衣壳化的效率显著低，因为与使用对照EBV时的29%相比，少至0.001%用包含delTR-EBV的上清感染的细胞表达来自所述基因组的标记基因(Feederle R 等,(2005), Defective infectious particles and rare packagedgenomes produced by cells carrying terminal-repeat-negative Epstein-Barr virus.J.Virol.79 ；7641-7)。这表明，末端重复序列对基因组衣壳化很重要，但并非绝对必需。此外，已显示，从delTR-EBV产生的VLP仍然(虽然罕见)感染细胞，因此不保证delTR-EBVVLP用作疫苗的安全性。
[0006]总的来说，虽然存在需要，但迄今尚未发展出用于产生针对EBV的安全而有效的疫苗的方法。因此，基于本发明的技术问题可以视为提供允许有效产生EBV疫苗的手段和方法。通过权利要求和下文中表征的实施方案来解决该技术问题。
[0007]因此，本发明涉及基本不含EB病毒(EBV)DNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)。
[0008]本文所用的术语“EB病毒样颗粒”或“EB-VLP”指衍生自在适宜的宿主细胞中既不裂解性复制也不建立潜伏性感染的EBV的病毒颗粒。优选地，如通过电子显微镜分析，EB-VLP具有基本典型的疱疹病毒结构，即它们具有衣壳、内膜和外膜。但是，与正常的疱疹病毒颗粒不同，本发明的EB-VLP是空的，即它们不含EBV DNA,优选完全没有DNA。EB-VLP包含技术人员就已知EBV类型(例如，I型EBV:Genbank检索号:NC_007605.1G1:82503188 ；基因组:SEQ ID NO:1 ；de Jesus O 等(2003) J.Gen.Virol.84，1443-1450 ；及 2 型 EBV:Genbank 检索号:NC_009334.1G1: 139424470 ;Dolan A 等(2006) Virology350 卷，164-170 ；基因组现0 10吣:2，包括毒株厘81姊0 10吣:38))已知的EBV病毒蛋白质(例如衣壳、内膜、外壳、壳、表面或包膜蛋白质和糖蛋白)。
[0009]除EBV编码的蛋白质外，EB-VLP还可以包含一种或多种人工多肽。术语“人工多肽”指不包含在野生型EBV中的掺入EB-VLP的任意多肽。如果人工多肽掺入并因此包含在EB-VLP中，则可以通过以下来评估:按照本发明的方法获得EB-VLP，例如通过离心或通过下文实施例中所述的免疫沉淀来从产生细胞分离EB-VLP，然后测定该人工多肽在该EB-VLP中的存在，其可以例如通过实施例中所述的免疫印迹法或通过适于具体多肽且为技术人员已知的任意其他方法来实现。
[0010]优选地，该人工多肽是包含疱疹病毒糖蛋白的膜整合部分的融合多肽。更优选地，该人工多肽是包含单纯疱疹病毒gC蛋白质的跨膜结构域的融合多肽。在优选实施方案中，该人工多肽进一步包含可检测标签。术语“可检测标签”指加至或引入至本发明的融合多肽的一段氨基酸。优选地，该标签将在本发明的融合多肽的C端或N端加入。该一段氨基酸将允许通过特异性识别该标签的抗体来检测该融合多肽，或者它将允许形成功能性构象(如螯合剂)，或者它将允许通过突光标签显示。优选的标签是Myc标签、FLAG标签、6_His标签、HA标签、GST标签或GFP标签。这些标签为本领域公知。在另一优选实施方案中，该融合蛋白质包含含有免疫原性蛋白质的氨基酸序列的肽或多肽，该免疫原性蛋白质优选致病微生物的免疫原性蛋白质，更优选EBV蛋白质，最优选潜伏性EBV蛋白质。
[0011]但是，本发明还设想从EB-VLP缺失一种或多种非必需EB病毒多肽。在本说明书的背景中，“非必需EBV多肽”指掺入野生型EB病毒颗粒但并非形成VLP必需的多肽。如果在缺乏该多肽的情况下，在已按照本说明书的方法诱导或产生适宜的宿主细胞来产生VLP之后，通过电子显微镜或本说明书的实施例中所述的其他方法之一可检测到VLP，则该多肽是非必需的。例如，可以从EB-VLP缺失EBV BNRFl基因的产物，其显示在感染后EBV颗粒从内体的逃逸中发挥作用(Feederle, R 等(2006), Epstein-Barr virus BNRFlproteinallows efficient transfer from the endosomal compartment to the nucleus of primary Blymphocytes.J Virol.80(19): 9435-43)。在EBV的裂解性感染过程中从宿主细胞删去多肽的方法为技术人员公知。优选地，通过从病毒基因组删除编码该多肽的基因或通过利用遗传手段(例如通过将起始密码子突变为非起始密码子)致使该基因不可表达来删去多肽。
[0012]本文所用的 术语“基本不含EBV DNA”将为本领域技术人员所理解。该术语并非必然指所有EB-VLP都不含EBV DNA。但是，该术语要求，与对照EB-VLP相比，通过本发明的方法产生的不含EBV DNA的EB-VLP的数目增加了统计上显著的部分。对照VLP是上文所述的delTR-EBV VLP。部分是否在统计上显著可以由本领域技术人员用多种公知的统计评价工具(例如确定置信区间、p-值确定、Student’ s t检验、Mann-Whitney检验等)不费周折地确定。详情见于Dowdy 和 Wearden, Statistics for Research, John ffiley&Sons, New Yorkl983中。P-值优选0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。此外，与对照EB-VLP相比，通过本发明的方法产生的含有EBV DNA的EB-VLP的数目优选减少至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍。
[0013]优选地，基本不含EBV DNA的EB-VLP是包含少于10000EBV基因组/ml上清、更优选少于1000EBV基因组/ml上清、甚至更优选少于100EBV基因组/ml上清和最优选少于10EBV基因组/ml上清(按本说明书的实施例中所述产生并在PCR测定中测定时)的EB-VLP。优选地，EBV 基因组的数目小于 200/106EBV-VLP、小于 100/106EBV_VLP、小于 50/106EBV_VLP、小于 20/106EBV-VLP、小于 10/106EBV-VLP、小于 1/106EBV-VLP、小于 0.1/IO6EBV-VLP 或小于
0.0 I/IO6EBV-VLP。
[0014]优选地，基本不含EBV DNA的EB-VLP是在按照本说明书的实施例中所述产生并在感染测定中测定时，以小于10个感染细胞/ml上清、更优选小于I个感染细胞/ml上清、甚至更优选小于0.1个感染细胞/ml上清、最优选小于0.01个感染细胞/ml上清的比率在Raji细胞中建立潜伏性感染的EB-VLP。优选地，该比率小于10个感染Raji细胞/106EB-VLP、更优选小于I个感染细胞/106EB-VLP、甚至更优选小于0.1个感染细胞/106EB-VLP、最优选小于0.01个感染细胞/106EB-VLP。
[0015]优选地，本发明的EB-VLP用作药物。本文所用的术语“用作药物”涉及EB-VLP作为活性剂在诊断、治愈、治疗或预防疾病中的用途。
[0016]还优选地，本发明的EB-VLP用于接种。本文所用的“接种”涉及施用抗原性物质来刺激个体的免疫系统发展适应性免疫。接种是治疗性或预防性接种。
[0017]治疗性接种指为了以显著的程度改善或治愈本文中提到的疾病或障碍或与之相伴的症状而进行的接种。就本文提到的疾病或障碍而言，治疗性接种可以导致完全恢复健康。应理解，按照本发明使用的治疗性接种可以并非在所有个体中都有效。但是，该术语将要求可以成功治疗患有本文中提到的疾病或障碍的个体的统计上显著的部分。部分是否在统计上显著可以由本领域技术人员用多种公知的统计评价工具(例如确定置信区间、P-值确定、Student’ s t检验、Mann-Whitney检验等)不费周折地确定。优选的置信区间是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。p-值优选0.1、0.05,0.01,0.005或
0.0001。优选地，该治疗将对给定群组或群体的至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %的个体有效。
[0018]预防性接种涉及为了在个体中就本文提到的疾病或障碍而言在某个时期(优选终生)内保持健康而进行的接种。应理解，该时期取决于已施用的EB-VLP的量及本说明书其他地方讨论 的个体的个体因素。应理解，预防性接种可以并非在用本发明的EB-VLP治疗的所有个体中都有效。但是，该术语要求可以有效预防群组或群体的个体的统计上显著的部分免于患上本文提到的疾病或障碍或其伴随症状。优选地，在此背景中设想个体的群组或群体在正常情况(即没有本发明的预防性接种)下将发展本文提到的疾病或障碍。部分是否在统计上显著可以由本领域技术人员用本说明书其他地方所讨论的多种公知的统计评价工具不费周折地确定。
[0019]上文所作的定义作适当变动适用于以下:
[0020]在另一实施方案中，本发明涉及包含EBV基因组的多核苷酸，该EBV基因组a)缺乏选自BFLFl基因、BBRFl基因、BGRFl基因、BDRFl基因、BALF3基因、BFRFlA基因和BFRFl基因的至少一种可表达基因，b)能够在适宜的宿主细胞中产生本发明的EB-VLP。
[0021]本文所用的术语“多核苷酸”指线性或环状的核酸分子。本发明的多核苷酸将优选作为分离的多核苷酸(即分离自其天然环境)或以遗传修饰的形式提供。该术语涵盖单链以及双链多核苷酸。此外，还包含化学修饰的多核苷酸，包括天然存在的修饰多核苷酸，如糖基化或甲基化的多核苷酸，或人工修饰的衍生物，如生物素化的多核苷酸。
[0022]本发明的多核苷酸包含EBV基因组，该EBV基因组缺乏选自以下的至少一种可表达基因:BFLF1基因(I型EBV的基因:SEQ ID N0:3，蛋白质产物SEQ ID NO:4, Genbank检索号 YP_401648.1G1:82503206 ；2 型 EBV 的基因:SEQ ID NO: 5，蛋白质产物 SEQ ID NO: 6，Genbank 检索号 YP_001129444.1G1: 139424479)、BBRFl 基因(I 型 EBV 的基因:SEQ IDN0:7，蛋白质产物 SEQ ID NO:8，Genbank检索号 ΥΡ_401682.161:82503238 ;2 型EBV 的基因:SEQ ID Ν0:9，蛋白质产物 SEQ ID NO: 10，Genbank 检索号 ΥΡ_001129476.1G1: 123811640)、BGRFI/BDRFI 基因(I 型 EBV 的基因:SEQ ID NO: 11，蛋白质产物 SEQ ID NO: 12，Genbank检索号 YP_401690.1G1:82503246 ；2 型 EBV 的基因:SEQ ID NO: 13,蛋白质产物 SEQ IDNO: 14，Genbank 检索号 YP_001129485.1G1: 139424519)、BALF3 基因(I 型 EBV 的基因:SEQ ID NO: 15，蛋白质产物 SEQ ID NO: 16，Genbank 检索号 YP_401715.1G1:82503271 ；
2型EBV的基因:SEQ ID NO: 17,蛋白质产物SEQ ID NO: 18, Genbank检索号YP_001129509.1G1: 139424543)、BFRFlA 基因(I 型 EBV 的基因:SEQ ID NO: 19，蛋白质产物 SEQ ID NO: 20，Genbank 检索号 YP_401728.1G1:82503279 ；2 型 EBV 的基因:SEQ IDNO: 21，蛋白质产物 SEQ ID NO: 22，Genbank 检索号 ΥΡ_001129445.1G1: 139424480)和BFRFl 基因(I 型 EBV 的基因:SEQ ID NO:23，蛋白质产物 SEQ ID NO:24, Genbank 检索号 YP_401649.161:82503207 ；2 型 EBV 的基因:SEQ ID NO:25,蛋白质产物 SEQ ID NO:26,Genbank检索号YP_001129446G1:139424481)。该基因的产物是具有将病毒DNA包装入EBV的前衣壳所必需的活性的蛋白质，因此，其功能的去除导致产生本发明的EB-VLP。术语“缺乏可表达基因”涉及EBV基因组，其中已这样修饰选自上文所定义的组的至少一种基因，使得不能表达功能性蛋白质产物。这可以以技术人员已知并详细描述于下文实施例中的多种方式实现。
[0023]优选地，通过引入至少一个核苷酸的缺失、添加和/或取代来修饰上文的基因中的至少一个，导致从该基因产生的蛋白质的截短、破坏或突变。这类修饰涵盖基因中导致产生终止密码子的点突变，以及导致可读框的移码的修饰。所产生的这类多肽异常地短或异常地长，且无生物学功能。还涵盖基因中导致多肽无生物学功能或具有减少的生物学功能的点突变。还优选地，可以优选引入至少一个核苷酸的缺失、添加和/或取代，其导致控制该基因的表达的转录控制序列(即启动子)的失活。此外，可以优选引入这样的序列，该序列在转录的RNA中导致增加的RNA降解。更优选地，缺失或用无功能或不可表达的核酸取代该上文的基因中的至少一个的整个基因座。最优选地，用选择标记基因(如下文的附图和实施例中所示的卡那霉素抗性基因)取代可读框。 [0024]上文的基因之一的给定的修饰是否导致不可表达的基因的测试将取决于将为技术人员已知的所引入的修饰的性质。例如，如果基因的大部分编码区已缺失，则在EBV蛋白质的电泳分开后用对该基因的蛋白质产物特异的抗体进行免疫印迹将是适当的，因为包含缺失的基因的产物将具有更低的表观分子量。另一方面，如果上文的基因之一完全缺失，则所得到的EBV基因组的限制分析可以是足够的。在每种情况下，可以通过按下文详述的方法检测本发明的EB-VLP (即基本不含EBV DNA的EB-VLP)来测定上文的基因之一的功能丧失。
[0025]本发明的多核苷酸是包含EBV基因组的多核苷酸，该EBV基因组具有在适宜的宿主细胞中指导产生本发明的EB-VLP的生物学活性。适合用于测量该活性的测定描述于所附实施例中。优选地，该多核苷酸包含SEQ ID N0:27(包含BFLFl敲除(即缺乏可表达的BFLFl基因)的I型EBV基因组)中或SEQ ID NO:28(包含BBRFl敲除(即缺乏可表达的BBRFl基因)的I型EBV基因组)中所示的核酸序列之一。
[0026]此外，本发明所用的术语“多核苷酸”进一步涵盖前述特定多核苷酸的变体。这类变体可以代表本发明的多核苷酸的菌株或克隆变体。该多核苷酸变体优选包含这样的核酸序列，该核酸序列的特征在于，该序列可以通过至少一个核苷酸取代、添加和/或缺失衍生自前述特定核酸序列，由此该变体核酸序列将仍编码具有上文指定的活性的EBV基因组。包含任意前述核酸序列的片段的多核苷酸也作为本发明的多核苷酸涵盖。该片段将编码仍具有上文所述的活性的EBV基因组。
[0027]本发明的多核苷酸基本由前述核酸序列组成或包含前述核酸序列。因此，它们也可以包含其他核酸序列。具体而言，本发明的多核苷酸可以编码融合蛋白质，其中该融合蛋白质的一个配偶体是由上文所述的核酸序列编码的多肽。这类融合蛋白质可以包含用于监测表达的多肽(例如绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白、碱性磷酸酶等)或所谓的“标签”(其可以用作可检测标记或作为用于纯化目的的辅助措施)作为附加部分。用于不同目的的标签为本领域公知，且包括FLAG标签、六组氨酸标签、MYC标签等。
[0028]优选地，本发明的多肽包含除上文详述的修饰之外的改变。尤其是，由于已知或怀疑EBV的一些潜伏基因产物对细胞具有转化作用(EBNA2、LMPl、EBNA3A、-B和-C(Hammerschmidt ff, Sudgen B(1989)Genetic analysis of immortalizing functionsof Epstein-Barr virus in human B-lymphocytes.Nature340:393-397 ；Cohen JI 等(1989)Epstein-Barr virus nuclear protein2is a key determinant of lymphocytetransformat ion.PNAS86:9558 - 9562; Kaye KM 等(1993)Epstein_Barr viruslatent membrane proteinlis essential for B-1ymphocyte growth transformation.PNAS, 90, 9150 - 9154 ；Tomkinson B 等(1993)Epstein-Barr virus nuclear proteinsEBNA3A and EBNA3C are essential for B-1ymphocyte growth transformation.J.Virol.62:6762 - 6771))，希望从本发明的多核苷酸去除编码这些转化蛋白质的基因。另外，已知BZLFl基因产物是介导EBV进入其裂解周期(即其生活周期的产病毒部分)的主要激活蛋白质。因此优选从本发明的多核苷酸去除此功能性，以避免来自应用于个体(例如在接种期间)的残留基因组的病毒产生。在功能上缺失所述基因的方法与上文所述相同。更优选地，完全缺失所述基因中的至少一个，最优选地，完全缺失所述所述基因。
[0029]本文所用的术语“适宜的宿主细胞”涉及能够便于EBV的裂解性复制、导致产生EB-VLP的细胞。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，更优选灵长类细胞甚至更优选人细胞。最优选地，所述宿主细胞是293细胞。本发明还设想该宿主细胞可以提供EBV的裂解性复制所必需的某些因子。例如，在使用缺乏功能性BZLFl基因(其导致病毒不能进入裂解周期)的EBV基因组时，可以在将该BZLFl基因的表达构建体转染入细胞后通过该宿主细胞来提供这种功能。
[0030]用于产生所述修饰的方法为本领域技术人员公知，且包括基于同源重组的基因打靶法、基于PCR的诱变、使用诸如ENU或EMS的物质的化学诱变、辐射诱变等。尤其是，可以通过下文所附实施例中所述的同源重组来缺失整个基因座。
[0031]在另一优选实施方案中，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的载体。优选地，所述载体是能够在细胞中稳定维持EBV基因组的质粒或病毒载体。更优选地，所述载体衍生自大肠杆菌(E.coli)F质粒；这些载体作为基于F因子的复制子或细菌人工染色体(BAC)为技术人员所知，其允许在大肠杆菌细菌细胞中稳定维持完整的EBV基因组。此外，该术语还涉及允许将打靶构建体随机或位点-定向整合入基因组DNA的打靶构建体。这类靶构建体优选包含足够长度的DNA用于同源重组或异源插入。
[0032] 包含本发明的多核苷酸的载体优选进一步包含用于在宿主细胞中繁殖和/或选择的选择标记。所述载体可以通过本领域公知的多种技术掺入宿主细胞。如果引入宿主细胞，则载体可以驻留在细胞质中或可以掺入基因组中。在后一种情况下，应理解，载体可以进一步包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。载体可以经常规转化或转染技术被引入原核或真核细胞。载体和转化或转染技术为本领域公知，且可以由本领域技术人员不费周折地应用。例如，BAC质粒载体可以通过电穿孔引入大肠杆菌细胞，或在与带电荷的脂质的复合物中被引入哺乳动物细胞。
[0033]在另一优选实施方案中，本发明涉及包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。
[0034]本文提到的宿主细胞涵盖真核细胞以及原核细胞。具体而言，本发明提到的原核细胞可以是可以用来增殖例如本发明的多核苷酸或载体的细菌细胞。用于此目的的优选细菌是大肠杆菌，更优选菌株DH10B。真核细胞优选是能够表达包含在本发明的多核苷酸或载体中的EBV基因组的基因的细胞。表达EBV生活周期的潜伏周期的基因的优选细胞是例如Raji细胞。更优选地，所述细胞能够组装EB病毒样颗粒(EBV-VLP)，即是上文所述的适宜的宿主细胞。
[0035]在另一优选实施方案中，本发明涉及用于制备基本不含EBV DNA的EB-VLP的方法，其包括步骤:a)培养包含本发明的多核苷酸或载体的适宜的宿主细胞jPb)从所述细胞获得基本不含EBV DNA的EB-VLP。
[0036]本发明的方法优选是体外方法。此外，它可以包括除上文明确提到的那些步骤之外的步骤。例如，进一步的步骤可以涉及适宜的宿主细胞的预处理或所收获的包含EB-VLP的上清的后处理。
[0037]术语“培养”为本领域技术人员已知。尤其是，该术语涉及在细胞培养基中生长在生物体之外的细胞。该术语还涉及在生物体之外的培养物中培养细胞的方法。适宜的细胞培养基为本领域技术人 员已知且可购得。它们可以包含营养物、盐、生长因子、抗生素、血清(例如胎牛血清)和PH指示剂(例如酚红)。优选地，所述方法进一步包括在适宜的宿主细胞中表达至少一个编码上文所述的人工多肽的基因、导致所述人工多肽掺入EB-VLP的步骤。
[0038]术语“获得”指本领域技术人员已知的分离和/或纯化步骤。优选地，在所述分离和/或纯化之后，所述EB-VLP显示至少80%、优选80% -90%、更优选90% -97%、最优选超过97%的纯度，至多为无任何污染的绝对纯的形式。术语“纯化”涵盖诸如层析设备的工具和方法。优选使用的方法可以包括密度梯度离心、大小排阻层析、亲和层析及沉淀和柱。优选地，获得EB-VLP包括通过按下文实施例中所述经抗_gp350抗体使它们与磁珠结合来纯化EB-VLP。优选地，从适宜的宿主细胞的上清获得EB-VLP，即EB-VLP在本发明的方法中释放入培养基。
[0039]在优选实施方案中，本发明涉及用于制备疫苗的方法，其包括本发明的方法的步骤和将EB-VLP配制为疫苗的其他步骤。在另一优选实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的包含基本不含EBV DNA的EB-VLP的疫苗。
[0040]本文所用的术语“疫苗”优选涉及包含本发明的基本不含DNA的EB-VLP的组合物，在对动物、优选人施用时，其引发针对EBV的免疫反应。因此，施用所述疫苗刺激免疫系统，并建立或改善对EBV感染的免疫力。优选地，本发明的疫苗允许建立或改善对EBV感染的免疫力。优选地，免疫导致特异性识别结构EBV抗原的T细胞和/或B细胞的激活和扩大。更优选地，免疫导致产生防止EBV感染体细胞的抗体。[0041]本发明的疫苗优选进一步包含下文详述的一种或多种可药用载体。本发明的疫苗可以配制为可要用盐。所述疫苗优选局部或全身施用。常规用于药物施用的适宜的给药途径是口服、静脉内或肠胃外施用以及吸入。但是，取决于化合物的性质和作用方式，也可以通过其他途径施用所述疫苗。此外，所述化合物可以与其他疫苗组合在同一疫苗中或作为分开的疫苗施用，其中所述分开的疫苗可以以试剂盒的部分的形式提供。
[0042]化合物优选以通过按照常规方法将EB-VLP与标准药用载体组合制备的常规剂型施用。这些方法可以涉及混合、制粒和压制或根据需要将成分溶解至希望的制剂。应理解，可药用载体或稀释剂的形式和性状受将要与其组合的活性成分的量、给药途径和其他公知的变量支配。
[0043]治疗有效剂量指将要用于本发明的疫苗中的化合物的量，其诱导本发明的免疫。剂量方案将优选按照上文所述方法中的任一种由主治医师和其他临床因素确定。如医疗领域公知，用于任意一名患者的剂量可以取决于几个因素，包括患者的年龄、将要施用的具体组合物、性别、时间和给药途径、一般健康及同时施用的其他药物。免疫可以通过定期评估来监测。典型的剂量可以例如在I至1000yg的范围内；但是，尤其是考虑到上述因素，也设想低于或高于此示例性范围的剂量。
[0044]施用本文提到的疫苗和制剂至少一次，以治疗或改善或预防本说明书所述的疾病或病症。但是，所述疫苗可以施用一次以上，例如多至四次。
[0045]特定疫苗以制药领域公知的方式制备，且至少包含与可药用载体或稀释剂混合或以其他方式结合的EB-VLP。为了制备那些特定疫苗，通常将EB-VLP与载体或稀释剂混合，或密封或包封在胶囊、小药囊、扁囊剂、纸或其他适宜的容器或溶媒中。得到的制剂将被采用为施用的方式，即 处于片剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、混悬剂等的形式。剂量建议将显示在开处方者或使用者说明中，以预期取决于所考虑的受体的剂量调整。
[0046]在另一优选实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种可药用载体和/或至少一种赋形剂。应理解，从与所述制剂的其他成分相容和对其受体无害的意义上说，所述一种或多种载体必须是可接受的。所利用的药用载体可以是例如固体、凝胶或液体。示例性固体载体是乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性液体载体是磷酸缓冲盐溶液、糖浆、油(如花生油和橄榄油)、水、乳剂、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。
[0047]选择一种或多种稀释剂，以免影响所述组合的生物学活性。这类稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格液、葡萄糖溶液和Hanks液。此外，所述疫苗或制剂还可以包含载体、赋形剂或非毒性、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。所述非毒性、非治疗性、非免疫源性稳定剂为本领域公知，如单独或含蜡的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。所述适宜的载体包括上文提到的那些及本领域公知的其他载体，见例如Remington' s PharmaceuticalSciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania。
[0048]组合物的优选的其他成分是赋形剂。赋形剂是在单独对宿主施用时不引发免疫反应但在与免疫原性多肽一起施用时可以进一步增强宿主的免疫反应的化合物。本领域已知，赋形剂可以用作促进免疫原性多肽在大的表面积上的集中的表面活性剂，或者可以具有免疫刺激特性。
[0049]在另一优选实施方案中，本发明涉及包含可通过本发明的方法获得的基本不含EBV DNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)的组合物，其用作用于治疗和/或预防疾病的疫苗。
[0050]术语“用作用于治疗的疫苗”涉及本发明的疫苗作为上文所述的治疗性疫苗的用途。同样，术语“用作用于预防的疫苗”涉及作为预防性疫苗的用途。
[0051]术语“个体”涉及具有对所述生物的外来分子产生免疫反应的能力的后生动物生物。优选地，所述个体是动物，更优选哺乳动物，最优选人类。
[0052]本文所用的术语“EBV相关疾病”涉及由EBV感染个体引起的所有障碍。在优选实施方案中，所述EBV相关疾病是传染性单核细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、胃癌或移植后淋巴细胞增生性疾病。表征这些疾病的症状为本领域公知，并描述于标准医学教科书中。
[0053]本说明书通篇中引用的所有参考文献在此以其上文提到的具体公开内容以及其整体引入作为参考。
[0054]附图
[0055]图1.EBV Δ BFLFl和Λ BBRFl重组病毒的构建。
[0056]左图代表包含BFLFl或BBRFl基因的EBV基因组区域在引入突变之前和之后的示意性限制图谱。显示BamHI和HindIII限制位点的位置。卡那霉素抗性基因取代了大部分BFLFl或BBRFl可读框。在BFLFl缺失的情况下，这导致7.5kb BamHI片段交换7.4kb BamHI片段，或9.1kb和20.2kb HindIII片段的组合取代29.3kb HindIII片段。10.3kb片段取代了 BBRFl基因的基因座 中的9.7kb BamHI片段，大小分别为23kb和3.6k的两个片段取代了 25.9kb HindIII片段。右图显示野生型和ABFLFl或ABBRFl突变体病毒的限制片段分析。病毒DNA分离自大肠杆菌和生产293细胞系，并用两种不同的酶消化。显示通过缺失相应的基因修饰的限制片段。
[0057]图2.来自诱导的生产细胞的上清中的VLP和病毒粒子的免疫染色。
[0058]来自生产细胞系的包含野生型病毒或缺乏BFLFl、BBRFl或末端重复序列的突变体的上清在4°C与EBV阴性B细胞系混合I小时。用gp350特异性抗体，然后用Cy3偶联的第二抗小鼠抗体免疫染色结合于B细胞的病毒。
[0059]图3.包含Λ BFLFl、Λ BBRFl、Λ TR或EBV野生型基因组的293细胞的电子显微照片。
[0060]包含Λ BFLFl、Λ BBRFl、Λ TR或EBV野生型基因组的293细胞在诱导病毒裂解性复制后的电子显微照片，显示沉淀的来自ABFLFl或ABBRFl突变体的上清中的VLP的电子显微照片。检查显示来自Λ BFLFl、ABBRFl和Λ TR病毒的制品中A-和B-衣壳的丰度。在包含野生型病毒的细胞中而不是在包含突变体的那些细胞中观察到了感染性的装满DNA的成熟C-衣壳。内嵌条，200nm。
[0061]图4.用Λ BFLFl、Λ BBRFl、Λ TR或野生型病毒感染Raji B细胞。
[0062]显示突变体和野生型病毒感染Raji B细胞系的能力。所观察到的效价作为每毫升上清的EBV感染的Raji细胞或绿色Raji单位的数目给出。
[0063]图5.使用免疫纯化的VLP的Western印迹分析。
[0064]gp350是存在于成熟颗粒的病毒包膜中的病毒糖蛋白。我们用偶联至磁珠Dynabead的对gp350特异的单克隆抗体从感染性上清中纯化了 EBV病毒粒子。将来自诱导的野生型或不同突变体生产细胞系的上清与偶联的磁珠在室温下孵育I小时。用磁铁收集结合的病毒颗粒，用RPMI洗涤3次，并用于检测病毒蛋白质或病毒DNA。用对EBV内膜蛋白质BNRFl (HOkDa)特异的抗体对免疫纯化的VLP/病毒粒子进行了 Western印迹分析。在野生型病毒粒子中以及来自诱导的包含ABFLF1、ABBRFl或Λ TR突变体的生产细胞系的上清中检测到了 BNRF1。用缺乏gp350(Agp350)的突变体病毒作为纯化实验中的阴性对照。
[0065]图6.使用免疫纯化的VLP的定量PCR (qPCR)分析。
[0066]用具有对病毒聚合酶基因特异的引物和探针的qPCR针对病毒DNA的存在评估了用gp350特异性抗体纯化的VLP或病毒粒子。用野生型病毒作为阳性对照。病毒效价作为每毫升上清的基因组当量给出。
[0067]图7.EBV特异性T细胞识别用Λ BFLFl和Λ BBRF1VLP脉冲的B细胞。
[0068]用偶联至磁珠的gp350抗体纯化存在于Iml所示病毒上清中的病毒颗粒，并重悬在新鲜培养基中。用所示量的BNRFl肽或所示体积的纯化病毒颗粒预处理LCL细胞。将脉冲的LCL与BNRF1CD4+T细胞孵育，并通过ELISA测量GM-CSF的产生。
[0069]图8.VLP可以掺入外来蛋白质。
[0070]在起始EBV的裂解性复制时，将编码与6个连续的组氨酸符合读框地融合的来自单纯疱疫病毒的糖蛋白gC的胞质内结构域和跨膜结构域(gC-6xhis)的质粒转染入ABFLFl生产细胞系。用偶联至磁珠Dynabead的gp350抗体纯化所产生的病毒颗粒,并在Western印迹中分析。只有获自gC_6xhis转染的293/ABFLF1细胞的病毒已掺入此蛋白质。
[0071]图9.gC融合蛋白质插入LP/VLP包膜和颗粒免疫效力的评价。(A)所提出的HSVl-gC-EBV融合蛋白质构建体的示意图。(SP，gC信号肽；His，His标签；表位，EBV T细胞表位；TMD，gC跨膜结构域；CT，gC胞质尾区)。(B)显示带His标签的gC融合蛋白质在LP/VLP中的表达的Western印迹。从在编码gC融合蛋白质的质粒或作为阴性对照的pRK5的存在下诱导的EBV突变体生产细胞系产生LP/VLP。使用了 His特异性抗体。(C)LCL与来自在gC-His-5Hll融合蛋白质表达质粒或pRK5空质粒的存在下裂解性诱导的突变体生产细胞系的上清孵育后的EBNA3C5H11表位特异性T细胞激活。用ELISA来测定IFN-Y分泌。
[0072]以下实施例仅是说明本发明。无论如何不应将它们解释为限制本发明的范围。实施例
[0073]实施例1:EBVABFLF1和ABBRFl重组病毒的构建
[0074] 通过在大肠杆菌中用RecA介导的同源重组将存在于EBV B95.8-BAC重组质粒上的大部分相应的可读框(Proc Natl Acad Sci USA.1998 年 7 月 7 日；95(14):8245-50.Propagation and recovery of intact, infectious Epstein-Barr virus from prokaryoticto human cells.Delecluse HJ, Hilsendegen T, Pich D, Zeidler R, Hammerschmidt ff.)(BFLF1 的 EBV B95.8 毒株坐标 #57131-58568 和 BBRFl 的坐标 #114204-116042 (检索号V01555))换为侧翼为frt位点的卡那霉素/新霉素盒(Λ BFLFl中的坐标#57131-58673，ABBRFl中的坐标114501-116042)来获得EBVABFLF1和ABBRFl病毒。用卡那霉素选择适当地消除了 BFLFl或BBRFl的病毒基因组。通过质粒小量制备偶联用HindIII和BamHI限制酶来确认其结构的限制分析来分析候选克隆(图1)。测序确认了目标可读框已缺失，重组如所预期地发生。
[0075]实施例2:293/ Δ BFL Fl 和 293/ Δ BBRFl 细胞的产生
[0076]然后分别将EBV Δ BFLFl和Λ BBRF1DNA转染入293细胞，并针对潮霉素抗性进行选择；EBV-BAC重组体携带潮霉素抗性基因，因此允许选择用重组DNA稳定转染的细胞。纯化存在于293潮霉素抗性克隆中的EBV Λ BFLFl或Λ BBRFl基因组，并转回大肠杆菌细胞。从这些细菌细胞制备EBV Δ BFLFl或Λ BBRFl质粒来确认其同一性及其完整性。每种克隆选择一个(分别称为293/Λ BFLFl或293/Λ BBRF1)用于进一步实验。编码BZLFl反式激活蛋白的表达质粒的瞬时转染允许起始裂解性复制，从而产生感染性病毒或非感染性VLP。对照包括含有野生型病毒的293细胞。转染后3天，将来自293/Λ BFLFl和293/Λ BBRFl细胞的病毒上清与来自EBV阴性Elijah B细胞系的细胞孵育(图2)。由于EBV病毒粒子结合B细胞，可以通过使用抗gp350 (病毒包膜的成分)的抗体的免疫染色来显示结合在B细胞表面的病毒。此实验确认，来自诱导的293/ Δ BFLFl或293/ Δ BBRFl细胞的上清包含结合B细胞且可以代表VLP或成熟病毒粒子的gp350阳性病毒结构。用含有野生型病毒的293克隆获得了相似的结果。还研究了包含缺乏末端重复序列(用作包装信号的病毒序列)的重组病毒的 293 细胞(293/ Δ TR) (Proc Natl Acad Sci USA.1999 年 4 月 27 日；96 (9): 5188-93.A first-generation packaging cell line for Epstein-Barr virus-derived vectors.Delecluse HJ, Pich D, Hilsendegen T, Baum C, Hammerschmidt ff.)。我们之前显不，293/ Δ TR产生VLP (第一代VLP)，因此用此细胞系作为阳性对照来检测这些病毒结构(J Virol.2005年 6 月；79(12):7641-7.Defective infectious particles and rare packaged genomesproduced by cells carrying terminal-repeat-negative epstein—barr virus.FeederleR, Shannon-Lowe C, Baldwin G, Delecluse HJ.)。我们可以确认，来自诱导的 293/ Δ TR 的上清包含结合Raji细胞表面的病毒结构。
[0077]实施例3:包含Λ BFLFl、BBRF1、Λ TR或EBV野生型基因组的293细胞的电子显微镜分析。
[0078]通过用电子显微镜直接观察BZLFl诱导的突变体生产细胞及其沉淀的上清二者来提供关于存在于来自诱导的293/ Δ BFLFl和293/ Δ BBRFl的上清中的病毒颗粒的结构的进一步信息(图3)。来自诱导的293/Λ BFLFl或来自293/Λ BBRFl细胞的电子显微照片显示，它们包含缺乏病毒DNA的未成熟EBV病毒粒子。类似地，沉淀的293/Λ BFLFl和293/ABBRFl上清包含缺乏病毒DNA的成熟EBV病毒粒子，即它们代表VLP。相反，包含野生型EBV基因组的293细胞显示处于多种成熟阶段的EBV颗粒，其中一些包含对应于包装的EBVDNA的电子致密核心。还发现从上清分离的野生型EBV病毒粒子也包含病毒DNA。293/ Δ TR及其上清的分析确认，这些细胞如所预期地大量产生VLP。
[0079]实施例4:用Λ BFLFl和Λ BBRFl病毒感染Raji B细胞
[0080]在表征通过诱导的293/ Δ BFLFl和293/ Δ BBRFl细胞产生的病毒结构的感染特性的进一步尝试中，我们将Raji细胞与来自细胞系的上清的递增的5倍稀释液(包括未稀释的上清)在96孔板中孵育。感染3天后，用荧光显微镜计数GFP阳性Raji细胞。Raji B细胞系高度易受EBV感染，并在用重组EBV DNA感染时表达绿色荧光蛋白(GFP)。事实上，GFP基因克隆在重组EBV DNA上，并在感染真核细胞时表达。用Iml来自诱导的293/ Δ BFLFl和293/ Δ BBRFl的上清孵育Raji细胞后，未检测到Raji感染(图4)。相反，相同体积的来自诱导的野生型293/EBV细胞的上清包含足以产生约2xl04gfp阳性Raji细胞的感染性病毒。来自诱导的293/ Δ TR细胞的上清感染性比野生型病毒低两个数量级，但每毫升上清也产生了 120个EBV阳性细胞，因此每毫升包含120个感染性颗粒。
[0081]实施例5:EBV ABFLFl和ABBRF1VLP中病毒蛋白质的检测和病毒DNA的定量
[0082]gp350是成熟EBV颗粒的主要成分。将存在于来自诱导的293/Λ BFLF1、293/八881^1、293/八了1?、293/11'的上清中的病毒结构与偶联至磁珠071^13册(1的对8?350特异的抗体孵育。然后用磁铁收集病毒结构，对同一样品进行Western印迹和qPCR分析。
[0083]对于Western印迹分析(图5)，将从Iml上清纯化的病毒结构重悬在PBS中，并在Laemmli缓冲液中95°C变性5分钟。将全部样品在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分开，电印迹至Hybond ECL膜(Amersham)上。在含5%奶粉的PBS中预孵育30分钟后，用兔多克隆抗 BNRFl 血清(Feederle 等(2006)，Epstein-Barr virus BNRFlprotein allows efficienttransfer from the endosomal compartment to the nucleus of primary B lymphocytes, JVirol ；80(19):9435-43)室温孵育印迹I小时。BNRFl是以高浓度存在于EBV病毒结构中的内膜蛋白质。在含0.1% Tween的PBS中洗涤几次后，用与辣根过氧化物酶偶联的蛋白A孵育印迹I小时。用ECL检测试剂(PerkinElmer)显示抗体结合。此实验确认了 BNRFl阳性病毒结构在测试的全部三种上清中的存在(图5)。
[0084]为了评估病毒DNA的存在(图6)，首先用0似％1(5~5(^1上清)371:消化重悬在PBS中的相同量的gp350纯化的病毒结构I小时，以去除任何痕量的污染游离病毒DNA。DNaseI热失活(70°C 10分钟)后，将纯化的病毒结构与裂解缓冲液(含0.lmg/ml蛋白酶K的水)混合(1:1 体积/体积)，并在50°C孵育60分钟，然后热失活酶(75°C 20分钟)。此步骤释放包装入病毒颗粒的任意病毒DNA。对水稀释的样品(1:10)进行使用对BALFOTNA聚合酶(pol)基因特异的引物和探针的qPCR。在包含12.5 μ I Taqman Universalmaster mix (Applied Biosystems)、2.5μ1 正向和反向 pol 引物(2 μ Μ)、I μ 15 μ M FAM标记的pol探针、1.5 μ I水和5 μ I纯化并重悬的病毒颗粒的25 μ I体积中进行扩增反应。激活 AmpliTaq Gold DNA 聚合酶(95°C 10 分钟)后，用 ABI7300Sequence DetectionSystem (Applied Biosystems)扩增反应混合物40个循环(95。。15秒，6CTC60秒)并检测荧光信号。引物和探针序列如下:反向pol引物5’ -AGTCCTTCTTGGCTAGTCTGTTGAC-3’ (SEQID NO: 29)、正向 pol 引物 5’ -CTTTGGCGCGGATCCTC-3’ (SEQ ID NO: 30)、EBV pol 探针 5，-FAM-CATCAAGAAGCTGCTGGCGGCC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 31)。用 Namalwa(每个细胞包含两个 EBV基因组拷贝的人伯基特淋巴瘤细胞系)DNA的系列稀释作为标准曲线的参照来计算DNA含量。此测定的结果显示在图6中；我们发现，从Iml野生型上清gp350纯化的病毒结构包含约1χ10Ε6个病毒基因组。在培养基和水对照中，所述qPCR方法产生1χ10Ε3至1χ10Ε4个基因组范围内的信号，因此我们在1χ10Ε4基因组/ml处绘制基线。与野生型EBV完全不同，来自诱导的293/ Δ BFLFl和293/ Δ BBRFl的上清不包含基线以上的任何可检测到的EBVDNA。293/Λ TR上清给出中间的结果，因为Iml上清包含略高于1χ10Ε4病毒基因组/ml上清。总之，我们得出结论，gp350纯化的来自诱导的293/Λ BFLFl和293/Λ BBRFl的病毒结构包含携带BNRFl蛋白质但不含任何病毒DNA的病毒结构，即代表真正的VLP。
[0085]实施例6 =EBV特异性T细胞识别用Λ BFLFl和Λ BBRF1VLP脉冲的B细胞[0086]我们评估了 VLP诱导T细胞特异性反应的能力(图7)。为此，我们将用gp350抗体纯化的存在于Iml所示病毒上清中的病毒颗粒或VLP与作为抗原呈递细胞的LCL细胞孵育。平行地，用所示量的BNRFl肽(用作阳性对照)预处理LCL。然后将脉冲的LCL与BNRFl特异性⑶4+T细胞孵育。BNRFl特异性⑶4+T细胞对呈递在LCL表面的抗原的特异性识别引发可以通过ELISA来评估的IFN- Y在上清中的产生和释放。我们发现，BNRFl特异性T细胞同样好地识别野生型EBV病毒粒子及ABFLFl和ABBRF1VLP。
[0087]实施例7:VLP可以掺入外来蛋白质
[0088]我们在此显示，可以用来自单纯疱疹病毒的糖蛋白gC的胞质内结构域和跨膜结构域来将外来抗原引入VLP。例如，我们将来自gC的这些亚结构域与6个连续的组氨酸(gC-6xhis)符合读框地融合，并在起始EBV裂解性复制时将编码此融合蛋白质的质粒转染入ABFLFl生产细胞系。用偶联至Dynabead的gp350抗体纯化了所产生的病毒颗粒。通过使用组氨酸特异性抗体的Western印迹分析了从这些VLP制备的蛋白质。我们发现，只有在用gC-6xhis转染的293/ Δ BFLFl细胞中产生的病毒产生特异性信号，因此已掺入了此蛋白质(图8)。
[0089]实施例8:携带外来抗原的VLP诱导免疫反应
[0090]由于我们已显示，我们已产生的LP/VLP具有免疫原性，且符合安全疫苗制品的要求，我们意图扩大其抗原谱。EBV感染诱导强烈的T细胞反应，且已鉴定了来自EBV潜伏蛋白质和裂解蛋白质二者的T细胞表位。我们选择了来自EBV潜伏蛋白质EBNA3C的免疫显性表位5H11 (SEQ ID NO: 33 ;编码序列SEQ ID NO: 32)来掺入病毒包膜。我们产生了包含5H11表位和单纯疱疹病毒I (HSV-1)的糖蛋白C(gC)的部分(包括信号肽、跨膜结构域和胞质尾区)的融合蛋白质(SEQ ID NO: 35，编码序列SEQ ID NO: 34 ;构建体包含在质粒B599 (SEQ IDNO:37)上；质粒B557(SEQ ID NO:36)是缺乏编码5H11表位的序列的对照质粒)。此外，所述构建体包含His标签及便于表位插入的唯一限制位点(图9A)。如Dynabead纯化的LP/VLP的Western印迹所证明，在此构建体的存在下诱导突变体生产细胞系导致此融合蛋白质有效掺入EBV LP/VLP(图9B)。此外，掺入gC-His_5Hll融合蛋白质的ΛBFLF1/BFRF1AVLP 二者都能在从LCL呈递后诱导特异性T细胞激活(图9C)。
【权利要求】
1.EB病毒样颗粒(EB-VLP)，其基本不含EB病毒(EBV) DNA。
2.权利要求1的EB-VLP，其进一步包含至少一种人工多肽。
3.权利要求1或2的EB-VLP，其缺乏至少一种非必需EBV多肽。
4.权利要求1至3的EB-VLP颗粒，其用作药物。
5.权利要求1至3的EB-VLP颗粒，其用于接种。
6.包含EB病毒(EBV)基因组的多核苷酸，所述EB病毒基因组: a)缺乏选自BFLFl基因、BBRFl基因、BGRFl基因、BDRFl基因、BALF3基因、BFRFlA基因和BFRFl基因的至少一种可表达基因；和 b)能够在适宜的宿主细胞中产生权利要求1至6中任一项的EB-VLP。
7.权利要求6的多核苷酸，其还缺乏至少一种可表达的潜伏基因。
8.载体，其包含权利要求6或7的多核苷酸。
9.宿主细胞，其包含权利要求6或7的多核苷酸或权利要求8的载体。
10.用于制备基本不含EBVDNA的EB-VLP的方法，其包括步骤: a)培养包含权利要求 6或7的多核苷酸或权利要求8的载体的适宜的宿主细胞；和 b)从所述细胞获得基本不含EBVDNA的EB-VLP。
11.权利要求10的方法，其中所述EB-VLP获自培养细胞的上清。
12.权利要求10或11的方法，其进一步包括在步骤a)中在所述宿主细胞中表达至少一种编码人工多肽的基因的步骤。
13.用于制备疫苗的方法，其包括权利要求10至12中任一项的方法的步骤及将所述EB-VLP配制为疫苗的其它步骤。
14.疫苗，其包含能通过权利要求10至12中任一项的方法获得的基本不含EBVDNA的EB-VLP。
15.组合物，其包含能通过权利要求10至12中任一项的方法获得的基本不含EBVDNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)，所述组合物用作用于治疗和/或预防疾病的疫苗。
【文档编号】C12N7/00GK104023745SQ201280065463
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2011年12月30日
【发明者】R·菲德勒, S·洪特, H-J·德勒克鲁斯 申请人:德国癌症研究中心