检测沙门氏菌属微生物的方法

检测沙门氏菌属微生物的方法
【专利摘要】本发明提供了用于检测样品中的沙门氏菌属微生物的组合物。所述组合物包含抑制革兰氏阳性微生物的生长的至少一种第一选择剂、包含被沙门氏菌属微生物转化为第一可检测产物的至少一种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系统和包含被脲酶活性转化为第二可检测产物的第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示剂系统。任选地，所述组合物可包括第三区别性指示剂系统，所述第三区别性指示剂系统包含被β-半乳糖苷酶活性转化为第三可检测产物的第三区别性指示剂化合物。还提供了使用所述化合物来检测沙门氏菌属微生物的方法。
【专利说明】检测沙门氏菌属微生物的方法
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本专利申请要求提交于2011年12月28日的美国临时专利申请No. 61/580,849 的权益，该专利申请以引用的方式全文并入本文。

【背景技术】
[0003] 肠杆菌科（Enterobacteriaceae)包括能够将糖类（例如，葡萄糖）发酵为乳酸 和/或其他酸性终产物的很多种代谢上不同的、兼性厌氧的细菌。该科包括多种熟知的 人类致病菌，诸如大肠杆菌（Escherichia coli)、沙门氏菌属的若干亚种、鼠疫耶尔森菌 (Yersinia pestis)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)的若干菌种和志贺氏菌属（Shigella)的 若干菌种。
[0004] 沙门氏菌属包括两个物种，肠道沙门氏菌（S. enterica)和邦戈尔沙门氏菌 (S. bongori)，其包括能够导致人类疾病的亚种。一些病原性沙门氏菌能够通过受污染的食 物或饮料的摄取而传染至人类。由于样品中相对低数量的沙门氏菌属微生物的存在、样品 中相对高数量的近缘的非沙门氏菌属肠道微生物的存在和/或样品中能够干扰沙门氏菌 属微生物的生长或检测的非微生物的物质（例如，食物颗粒或可溶性化学物质）的存在，食 品样品中沙门氏菌属微生物的检测能够是困难的。
[0005] 已开发了多种选择性的和/或区别性的微生物培养基，以检测样品中的沙门氏菌 属微生物并且将它们与一种或多种非沙门氏菌属微生物加以区分。通常，这些培养基包含 抑制非肠道微生物的生长的选择剂。此外，许多这些培养基依靠一种或多种区别性指示剂 系统来区分沙门氏菌属和非沙门氏菌属的微生物。
[0006] 尽管有多种用于检测样品中沙门氏菌属微生物的微生物培养基，仍然存在对检测 样品中沙门氏菌属微生物的改进的方法的需求。


【发明内容】

[0007] -般来讲，本公开涉及用于检测沙门氏菌属微生物在试验样品中的存在或不存在 的组合物和方法。具体地，所述组合物有利于沙门氏菌属微生物的生长并且包含至少一种 抑制革兰氏阳性微生物的生长的选择剂。此外，所述组合物包括至少两种区别性指示剂系 统。区别性指示剂系统中的至少一种阳性地区分沙门氏菌属微生物与非沙门氏菌属微生 物，并且区别性指示剂系统中的至少一种阴性地区分沙门氏菌属微生物与非沙门氏菌属微 生物。
[0008] 在一个方面，本公开提供了组合物。所述组合物能够包含半固体培养基，所述半固 体培养基包含胶凝剂、抑制革兰氏阳性微生物的生长的至少一种第一选择剂、包含至少一 种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系统和包含被脲酶活性转化为第二可检 测产物的第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示剂系统。第一区别性指示剂化合物能 够被沙门氏菌属的多个成员转化为第一可检测产物。第一区别性指示剂化合物不能够被在 所述培养基之内和/或之上形成可检测的菌落的非沙门氏菌属的、革兰氏阴性的肠道微生 物的多个属转化为第一可检测产物。
[0009] 在所述组合物的任何实施例中，第一区别性指示剂化合物能够包含选自蜜二糖、 2_脱氧-D-核糖、甘露糖醇、L-阿拉伯糖、半乳糖醇、麦芽糖、L-鼠李糖、海藻糖、D-木糖、 山梨糖醇以及上述化合物中的任何两种或更多种的组合的化合物。在任何上述实施例中， 所述组合物还能够包含缓冲剂。所述缓冲剂能够选自MOPS、磷酸盐、TES、HEPES以及它们的 组合。
[0010] 在任何上述实施例中，所述组合物还能够包括第三区别性指示剂系统，所述第三 区别性指示剂系统包含被β-半乳糖苷酶活性转化为第三可检测产物的第三区别性指示 剂化合物。在任何实施例中，第三区别性指示剂化合物能够包含显色酶底物。在任何实 施例中，第三区别性指示剂化合物能够选自5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、 5-溴_6_氯_3_ Π 引哚基-β -D-半乳糖苷、邻-硝基苯基-β -D-半乳糖苷、对-硝基苯 基-β -D-半乳糖苷、3, 4-环己酮七叶苷-β -D-半乳糖苷和6-氯-3-吲哚基-β -D-半乳 糖苷。
[0011] 在任何上述实施例中，所述至少一种第一选择剂能够选自胆汁盐、胆酸、脱氧胆 酸、结晶紫或上述化合物中任何两种或更多种的组合。在任何上述实施例中，所述pH指示 剂能够选自酚红、氯酚红、中性红、溴百里酚蓝和溴百里酚紫。
[0012] 在任何上述实施例中，所述组合物还能够包含至少一种第二选择剂，所述第二选 择剂抑制至少一种不是沙门氏菌属成员的革兰氏阴性肠道微生物的生长。所述至少一种第 二选择剂能够选自内酰胺类抗生素、氨基糖甙类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生 素、多粘菌素抗生素以及上述抗生素中的任何两种或更多种的组合；其中所述至少一种第 二选择剂的浓度被选择为允许沙门氏菌属微生物的生长。在任何上述实施例中，所述胶凝 剂选自琼脂、琼脂糖、果胶、明胶、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、 聚乙烯醇、褐藻胶以及上述胶凝剂中的任何两种或更多种的组合。
[0013] 在另一个方面，本公开提供了检测沙门氏菌属微生物的方法。所述方法能够包括 提供试验样品、培养装置和上述实施例中任何一个的组合物；在所述培养装置中使所述组 合物与试验样品接触，以形成经接种的培养装置；孵育经接种的培养装置第一时间长度； 以及观察所述培养装置以检测第一可检测产物，其中所述第一可检测产物是沙门氏菌属微 生物的存在的第一指示。
[0014] 在所述方法的任何实施例中，检测第一可检测产物能够包括观察pH指示剂与由 细菌产生的酸性化合物的反应。在任何实施例中，所述方法还能够包括观察所述营养物质 培养基以检测第二可检测产物，其中所述第二可检测产物指示非沙门氏菌属的微生物的存 在。检测第二可检测产物能够包括观察pH指示剂与由细菌产生的碱性化合物的反应。在 任何实施例中，所述方法还能够包括观察所述营养物质培养基以检测第三可检测产物，其 中所述第三可检测产物指示非沙门氏菌属的微生物的存在。检测第三可检测产物能够包括 检测由β-半乳糖苷酶活性产生的有色产物。
[0015] 在任何上述实施例中，所述方法还能够包括提供具有能够被沙门氏菌属微生物代 谢为第四可检测产物的验证性指示剂化合物的制品，其中所述第四可检测产物能够与第一 可检测产物、第二可检测产物和第三可检测产物（当存在时）相区分；使所述制品与所述培 养基接触；孵育所述装置第二时间长度；以及观察所述培养装置以检测第四可检测产物； 其中检测到所述第四可检测产物与所述第一可检测产物一起存在是沙门氏菌属微生物在 样品中存在的第二指示。
[0016] 在任何上述实施例中，所述方法还能够包括对第一类型的微生物的多个菌落进行 计数。在任何实施例中，所述方法还能够包括对第二类型的微生物的多个菌落进行计数。 在本发明的方法的任何实施例中，观察培养装置能够包括视觉上观察所述培养装置。在本 发明的方法的任何实施例中，观察培养装置能够包括使用成像装置生成所述培养装置的图 像。在任何实施例中，所述方法还能够包括使用处理器分析所述图像。
[0017] 词语"优选的"和"优选地"是指在某些情况下可以提供某些有益效果的本发明实 施例。然而，在相同的情况或其它情况下，其它实施例也可以是优选的。此外，对一个或多 个优选实施例的表述并不暗示其它实施例不是可用的，并且并非意图从本发明的范围中排 除其它实施例。
[0018] 如本文所用，"沙门氏菌属微生物"是指属于沙门氏菌属的任何微生物。
[0019] 如本文所用，"区别性指示剂系统"是指基于微生物各自将至少一种化合物（本 文称为"区别性指示剂化合物"）转化为可检测产物的能力，被用于区分两种类型的微生 物的一种或多种化合物。在一些情况下，例如，区别性指示剂化合物（例如，2-硝基苯 基-β -D-半乳糖苷）可被一种类型的微生物直接转化为可检测产物（例如，2-硝基苯酚）。 在一些情况下，例如，区别性指示剂化合物（例如，5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-a -D-半乳糖 苷）可以被一种类型的微生物转化为中间产物，中间产物在空气的存在下能够反应生成可 检测产物（一种类型的靛蓝染料）。在一些情况下，例如，区别性指示剂化合物（例如，可发 酵的碳水化合物诸如蜜二糖）能够被一种类型的微生物转化为可检测产物（例如，乳酸）， 其能够与区别性指示剂系统的另一组分（例如，pH指示剂如氯酚红）反应，导致另一组分 中可检测的颜色变化。
[0020] 当术语"包括"及其变型形式出现在说明书和权利要求书中时，这些术语并不具有 限制性含义。
[0021] 本文所用的"一种（个）"、"所述（该）"、"至少一种（个）"以及"一种或多种（一 个或多个）"可互换使用。因此，例如，微生物可以解释为意指"一种或多种"微生物。
[0022] 术语"和/或"意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或多个的组 合。
[0023] 另外，本文通过端点表述的数值范围包括范围内包含的所有数值（如，1至5包括 1、1·5、2、2·75、3、3· 80、4、5 等）。
[0024] 本发明的上述
【发明内容】
并不意在描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方 式。以下描述更具体地例示了示例性实施例。在本专利申请全文的若干地方，通过例子列表 提供指导，例子可用于多种组合中。在每一种情形下，所列举的列表仅仅作为代表性群组， 而不应被理解为排他性列表。
[0025] 下面将结合附图和【具体实施方式】介绍上述及其他实施例的更多细节。通过具体实 施方式、附图和权利要求书，其他特征、目标和优点将变得明显。

【专利附图】

【附图说明】
[0026] 图1示出根据本公开的检测沙门氏菌属微生物的方法的一个实施例的框图。
[0027] 图2示出用于解释通过使用图1中显示的方法获得的结果的流程图的一个实施例 的框图。

【具体实施方式】
[0028] 沙门氏菌属包括两个物种，肠道沙门氏菌（Salmonella enterica)和邦戈尔沙门 氏菌（Salmonella bongori) QFookes等人已研究了这两个物种的遗传相关性（"Salmonella bongori Provides Insights into the Evolution of the Salmonellae，'（邦戈尔沙门氏 菌提供了对沙门氏菌的进化的深入了解），PL0s Pathogens, www. plospathogens. org，2011 年，第7卷，文章编号el002191，第1-16页，该文献全文以引用方式并入本文）。尽管肠道 沙门氏菌的亚种由于它们感染和导致人类疾病的能力而比邦戈尔沙门氏菌更加有名，邦戈 尔沙门氏菌（S. bongori)也已被显示导致人类的感染。因此，被设计为检测潜在的病原性 沙门氏菌属微生物的测试应当能够同时检测两种物种。
[0029] 本公开一般涉及用于检测样品中沙门氏菌属微生物的方法。具体地，本公开涉及 能够区分沙门氏菌属微生物与非沙门氏菌属微生物（例如，大肠杆菌以及肠杆菌科的其他 成员）的组合物和基于生长的检测方法。本发明的方法结合了包含多种区别性指示剂的选 择性生长培养基。任选地，所述方法能够使用升高的孵育温度来区分邦戈尔沙门氏菌微生 物与非沙门氏菌属的产β -D-半乳糖苷酶的微生物。
[0030] 沙门氏菌属的基于生长的检测和鉴定一般要求使用在非沙门氏菌属微生物的存 在下特异性地检测沙门氏菌属菌株的生物化学反应。遗憾的是，大多数常规的检测系统不 能提供足够区分沙门氏菌属微生物与可能存在于样品中的非沙门氏菌属的肠杆菌科微生 物的特异性。这些测试经常需要附加的试剂和流程（例如免疫学或基因检测）来区分样品 中存在的非沙门氏菌属微生物与沙门氏菌属微生物。
[0031] 遗憾的是，一些常用于检测非沙门氏菌属的肠道微生物（例如，大肠杆菌）的组的 反应并不阴性地区分全部的沙门氏菌属菌株。例如，有一些沙门氏菌属微生物具有利用某 些化合物（例如，蜜二糖、2-脱氧-D-核糖、半乳糖醇、海藻糖）作为碳和/或能量源的代 谢能力。在利用这些化合物的过程中，沙门氏菌属微生物可产生可检测的终产物（即，有机 酸）。因此，用于检测这些化合物的利用的指示剂系统能够被用于检测沙门氏菌属微生物在 试验样品中的存在。大多数其他微生物不具有相同的代谢能力。然而，一些非沙门氏菌属 的革兰氏阴性肠道微生物可能具有利用这些化合物的能力。因此，希望包括至少一种其他 指示剂系统来区分非沙门氏菌微生物与沙门氏菌属微生物。其他一种或多种指示剂系统可 用于阳性地区分沙门氏菌属微生物与非沙门氏菌属微生物（即，沙门氏菌属微生物一般与 所述指示剂系统反应而非沙门氏菌属微生物一般不与所述指示剂系统反应），或者可用于 阴性地区分沙门氏菌属微生物与非沙门氏菌属微生物（即，沙门氏菌属微生物一般不与所 述指示剂系统反应而非沙门氏菌属微生物一般与所述指示剂系统反应）。
[0032] 本公开的发明性组合物包括至少两种区别性指示剂系统，其允许操作者执行辨别 (即，区分）沙门氏菌属微生物与至少两种类型的非沙门氏菌属的革兰氏阴性肠道微生物 的方法。即，本公开的组合物阳性地辨别沙门氏菌属微生物与不代谢第一指示剂化合物的 非沙门氏菌属微生物，并且同时，所述组合物阴性地辨别不能代谢第二区别性指示剂化合 物的沙门氏菌属微生物与能够代谢第二区别性指示剂化合物的非沙门氏菌属微生物。本发 明的方法和组合物提供了沙门氏菌属微生物在试验样品中的存在或不存在的推定性证据。 此外，所述组合物任选地能够包括第三区别性指示剂系统和/或能够被用于具有第四区别 性指示剂系统的方法中，以提供沙门氏菌属微生物在试验样品中的存在的验证性证据。
[0033] 本公开提供了检测沙门氏菌属微生物的组合物。所述组合物包含半固体培养基， 所述半固体培养基包含胶凝剂、抑制革兰氏阳性微生物的生长的至少一种第一选择剂、包 含至少一种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系统和包含被脲酶活性转化为 第二可检测产物的第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示剂系统。所述至少一种第一 区别性指示剂化合物能够被沙门氏菌属的多个成员转化为第一可检测产物。此外，所述至 少一种第一区别性指示剂化合物不能够被在所述培养基之内和/或之上形成可检测的菌 落的非沙门氏菌属的、革兰氏阴性的肠道微生物的多个属转化。
[0034] 本公开的培养基包含胶凝剂。胶凝剂可包括适合在用于培养革兰氏阴性肠道微生 物的半固体微生物培养基中使用的任何胶凝剂。适合的胶凝剂的非限制性例子包括琼脂、 琼脂糖、果胶、明胶、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、褐 藻胶以及上述中的任何两种或更多种的组合。
[0035] 本公开的培养基还可包含营养物质，以有利于革兰氏阴性肠道微生物的生长。此 类营养物质是本领域中为人们所熟知的，并且可包括，例如，一种或多种蛋白胨（例如，酪 蛋白胰酶消化物、动物组织胃蛋白酶消化物、蛋白胨、明胶胰酶消化物、示蛋白胨等等）和/ 或一种或多种生长补充剂（例如，酵母提取物；肉膏（牛肉/猪肉等）；镁、锰和/或钙盐； 糖）。培养基可包含其他营养物质（例如，矿物质或其他组分），只要它们基本上不妨碍第 一区别性指示剂系统、第二区别性指示剂系统和/或第三区别性指示剂系统（当存在时） 的功能。
[0036] 本公开的培养基包括第一区别性指示剂系统，该系统包含至少一种第一区别性指 示剂化合物。第一区别性指示剂系统是阳性地区分沙门氏菌属微生物与多种非沙门氏菌属 的革兰氏阴性肠道微生物的区别性指示剂系统。因此，第一区别性指示剂化合物能够被沙 门氏菌属的多个成员转化为第一可检测产物。此外，第一区别性指示剂化合物不被非沙门 氏菌属的革兰氏阴性肠道微生物的多个属转化为第一可检测产物。
[0037] 优选地，第一区别性指示剂化合物能够被属于邦戈尔沙门氏菌种的微生物转化为 第一可检测产物。更优选地，第一区别性指示剂化合物还被属于邦戈尔沙门氏菌之外的菌 种（例如，肠道沙门氏菌）的沙门氏菌属微生物转化为第一可检测产物。在一些实施例中， 所述第一区别性指示剂系统可包含能够被至少一种非沙门氏菌属肠道微生物转化为第一 可检测产物的第一区别性指示剂化合物。有利地，第二区别性指示剂系统和/或第三区别 性指示剂系统（当存在时）能够被用于阴性地区分在所述组合物中或在其上生长的非沙门 氏菌属微生物与沙门氏菌属的成员。
[0038] 在一些实施例中，第一区别性指示剂化合物是能够被微生物（例如，属于沙门氏 菌属的微生物）转化（例如，通过发酵）为第一可检测产物（例如，一种或多种酸性化合物 诸如乳酸，和/或例如气体诸如二氧化碳和/或氢气）的营养物质（例如，碳水化合物）。 本领域的普通技术人员将认识到，当第一可检测产物是通过第一区别性指示剂化合物的发 酵产生的酸性化合物时，由两种不同的微生物产生的酸性化合物可以是相同的酸性化合物 或者它们可以是不同的酸性化合物。
[0039] 在一个实施例中，其中酸性化合物是第一可检测产物，所述第一区别性指示剂系 统还能够包含pH指示剂。用于检测由细菌产生的酸性化合物的多种pH指示剂是本领域 已知的。适合的pH指示剂的非限制性例子包括酚红、氯酚红、中性红、溴百里酚蓝和溴百 里酚紫。在一些实施例中，其中所述第一可检测产物包括气体，所述气体可通过，例如，捕 集所述气体而被检测（例如，通过在薄膜培养装置中在水凝胶中捕集气体，如PETRIFILM Enterobacteriaceae Count Plate (PETRIFILM肠杆菌计数平板）的解释指南中所述，该文 献全文以引用方式并入本文）。
[0040] 优选地，在一个实施例中，其中所述第一区别性指示剂化合物包含营养物质，第一 区别性指示剂化合物被多种沙门氏菌属物种和/或亚种转化为第一可检测产物。更优选 地，第一区别性指示剂包含不被许多不属于沙门氏菌属的革兰氏阴性肠道微生物物种转化 为第一可检测产物的营养物质。甚至更优选地，营养物质第一区别性指示剂包括不被非沙 门氏菌属的微生物转化为第一可检测产物的营养物质。适合的第一区别性指示剂化合物的 非限制性例子包括选自蜜二糖、2-脱氧-D-核糖、甘露糖醇、L-阿拉伯糖、半乳糖醇、麦芽 糖、L-鼠李糖、海藻糖、D-木糖、山梨糖醇以及上述化合物中的任何两种或更多种的组合的 化合物。
[0041] 在一些实施例中，所述第一指示剂化合物可包含酶底物。适合的酶底物包括被属 于沙门氏菌属的微生物转化（例如，通过酶水解）为第一可检测产物（例如，有色的产物 或荧光产物）的显色酶底物或荧光酶底物。优选地，酶底物被属于邦戈尔沙门氏菌种的微 生物和属于肠道沙门氏菌种的微生物转化为第一可检测产物。适合的酶底物的非限制性 例子包括用于检测辛酸盐酯酶活性或用于检测α-半乳糖苷酶活性的酶底物。适合的显 色酶底物包括，例如，选自5-溴-6-氯-3-吲哚基辛酸酯、4-硝基苯基辛酸酯、2-萘基辛 酸酯、4-甲基伞形酮辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-a -D-半乳糖苷、6-氯-3-吲哚氧 基-a -D-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-a -D-半乳糖苷、1-萘基-a -D-半乳糖苷、 2-萘基-a -D-半乳糖苷、试齒灵-a -D-半乳糖苷、4_硝基苯基-a -D-半乳糖苷和4_甲 基伞形酮-a -D-半乳糖苷、它们的组合的酶底物。
[0042] 本公开的培养基包括第二区别性指示剂系统，其包含脲酶活性的指示剂。第二区 别性指示剂系统是阴性地区分沙门氏菌属微生物与多种非沙门氏菌属的革兰氏阴性肠道 微生物的区别性指示剂系统。因此，第二区别性指示剂化合物能够被非沙门氏菌属的革兰 氏阴性肠道微生物的多个属转化为第二可检测产物。此外，第二区别性指示剂化合物不被 沙门氏菌属的多个成员转化为第二可检测产物。
[0043] 脲酶是存在于某些非沙门氏菌属的革兰氏阴性肠道微生物（例如，属于变形杆菌 属（Proteus)、克雷伯氏菌属、摩根氏菌属（Morganella)、普罗维登斯菌属（Providencia) 和沙雷氏菌属（Serratia)的某些种）的酶。这些微生物中的一些（例如，奇异变形杆菌 (Proteus mirabilis);参见，例如，JM Matsen 等人，1972，Appl.Microbiol·，第 23 卷，第 592-594页，该文献全文以引用方式并入本文）能够将一种或多种第一区别性指示剂化合 物（例如，海藻糖、木糖）转化为第一可检测产物。因此，在仅包括本文所述的第一区别性 指示剂系统的区别性培养基中，或许不可能区分沙门氏菌属微生物与这些非沙门氏菌属的 革兰氏阴性肠道微生物之一。有利地，通过将第二区别性指示剂系统添加至培养基，能够将 沙门氏菌属微生物与非沙门氏菌属微生物相区分，因为沙门氏菌属微生物通常不具有脲酶 活性。
[0044] 本公开的第二区别性指示剂系统可包含脲和适当的pH指示剂（例如，酚红、氯酚 红、中性红、溴百里酚蓝和溴百里酚紫或乙酰丙酮偶氮苯二甲酰肼（phthalhydrazidylazoa cetylacetone)。脲酶活性使脲水解为二氧化碳和氨，其在水的存在下形成氢氧化铵。因此， 在一些实施例中，第二可检测产物包括铵化合物。具有脲酶活性并在脲的存在下生长的微 生物菌落产生铵化合物，其导致菌落周围的培养基的pH升高。存在于培养基中的适当的pH 指示剂能够通常以细菌菌落周围的区域或晕环显示所导致的pH变化（例如，在以酚红作为 pH指示剂的情况下，菌落可以是染上紫色的和/或菌落可在其周围具有紫色区域）。脲酶活 性的其他指示剂可以是适合的，包括，例如，荧光的脲酶底物（例如，3-(1-乙酰丙酮偶氮） 苯二甲酰肼）。
[0045] 本公开的组合物还包含至少一种第一选择剂来抑制革兰氏阳性的微生物的生长， 从而减少对营养物质的竞争和有利于诸如沙门氏菌属成员的革兰氏阴性的微生物的生长。 适合的第一选择剂的非限制性例子包括选自抗生素、胆汁盐、胆汁盐3号、胆酸、脱氧胆酸、 结晶紫、氯化钠、新生霉素、萘啶酸、链霉素、多粘菌素 B和上述选择剂中的任何两种或更多 种的组合的选择剂。
[0046] 本公开的组合物任选地可包含至少一种第二选择剂来抑制至少一种不是沙门氏 菌属成员的革兰氏阴性的肠道微生物的生长。在一些实施例中，所述第二选择剂还可抑制 至少一种革兰氏阳性的微生物的生长。有利地，第二选择剂与第一选择剂结合，进一步抑制 微生物（革兰氏阴性的和/或革兰氏阳性的微生物），从而减少对营养物质的竞争和有利 于沙门氏菌属微生物的生长。此外，所述至少一种第二选择剂还可基本上阻止否则将使第 一区别性化合物和/或第三区别性化合物转化为其相应的可检测产物的非沙门氏菌属革 兰氏阴性微生物的生长。因此，第二选择剂可降低非沙门氏菌属微生物在所述组合物中或 在其上生长并被解释为可能的沙门氏菌属微生物的概率。适合的第二选择剂的非限制性例 子包括选自β_内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素、多 粘菌素抗生素和上述抗生素中的任何两种或更多种的组合的选择剂。在一个实施例中，所 述至少一种第二选择剂包括萘啶酸、链霉素和多粘菌素 Β的组合。优选地，所述至少一种第 二选择剂各自在营养物质培养基中的浓度被选择为允许沙门氏菌属微生物的生长。更优选 地，所述至少一种第二选择剂各自在营养物质培养基中的浓度被选择为允许所有沙门氏菌 属微生物的生长。
[0047] 任选地，本公开的组合物还可包括第三区别性指示剂系统，所述第三区别性指 示剂系统包含被β-半乳糖苷酶活性转化为第三可检测产物的第三区别性指示剂化合 物。本公开的第三区别性指示剂系统包含能够被半乳糖苷酶活性转化为第三可检 测产物的第三区别性指示剂化合物。因此，第三区别性指示剂系统区分了产生半 乳糖苷酶活性的微生物和不产生β_半乳糖苷酶活性的微生物。例如，许多沙门氏菌 属不产生β_半乳糖苷酶活性，并且能够通过使用β_半乳糖苷酶活性的指示剂而与 肠杆菌科的利用乳糖的成员相区分，如A.Rambach所公开的（"New plate medium for facilitated differentiation of Salmonella spp. From Proteus spp. And other enteric bacteria"，1990, Appl. Environ. Microbiol.，vol. 56, pp. 301-303 ( "用于帮助 区分沙门氏菌属物种与变形杆菌属物种以及其他肠道细菌的新的平板培养基"，1990年， Appl. Environ. Microbiol.，第56卷，第301-303页）；该文献全文以引用方式并入本文）。
[0048] 然而，一些报道表明，超过90%的来自一些沙门氏菌属物种（例如，邦戈尔 沙门氏菌）和亚种（例如，肠道沙门氏菌亚利桑那亚种（S. enterica arizonae)和 肠道沙门氏菌双相亚利桑那亚种（S. enterica diarizonae))的分离的微生物已被 发现产生β _半乳糖苷酶活性（例如，参见A. M. Littell, "Plating medium for differentiating Salmonella arizonae from other Salmonellae，'，1977, Appl. Environ. Microbiol.，vol. 33, pp. 485-487( "用于区分亚利桑那沙门氏菌与其他沙门氏菌属的平板 培养基"1997, Appl. Environ. Microbiol.，第33卷，第485-487页）；该文献全文以引用方式 并入本文）。因此，如果样品中存在产β-半乳糖苷酶的沙门氏菌属，被设计为基于β-半 乳糖苷酶活性区分沙门氏菌属微生物和非沙门氏菌属的微生物的培养基和/或相应的方 法可能错误地低估样品中沙门氏菌属微生物的数量。研究人员已发现了即使在该方法中使 用的培养基依靠 β-半乳糖苷酶活性的指示剂来区分沙门氏菌属微生物和非沙门氏菌属 的微生物时，也出人意料地能够区分一些产β-半乳糖苷酶的沙门氏菌属微生物的方法。 [0049] 根据本公开的适合的第三区别性指示剂化合物的非限制性例子包括 5_溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、5-溴-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、 5_溴-6-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、2-硝基苯基-β -D-半乳糖苷、3, 4-环己酮七叶 苷-β -D-半乳糖苷和4-硝基苯基-β -D-半乳糖苷。在一些实施例中，第三区别性指示剂 系统包含第三区别性指示剂化合物（例如，乳糖）和pH指示剂。在任何实施例中，任选地， 所述组合物还能够包含，例如，β_半乳糖苷酶活性的诱导剂诸如异丙基β-D-l-硫代半乳 糖苷（IPTG)。
[0050] 本发明的组合物的任何实施例能够被用于培养装置中，以检测试验样品中的微生 物。适合的培养装置包括，例如，在用以检测样品中存在的微生物的方法中被用于容纳营养 物质培养基的任何培养装置。适合的培养装置的非限制性例子包括皮氏培养皿、多孔板、 管、烧瓶、薄膜培养装置等等。
[0051] 本公开的组合物可以以脱水的形式被配置在薄膜培养装置中，如美国专利 No. 4, 565, 783 ;5, 601，998 ;5, 681，712 ;6, 265, 203 ;和 6, 638, 755 中所公开的；上述每一专 利中的每个全文以引用方式并入本文。在这些实施例中，例如，样品（例如，含水液体样品 或悬浮在含水的悬浮培养基中的固体样品）能够通过将该样品吸移进培养装置而与脱水 的组分接触。在该实施例中，所述组合物的一种或多种组分可以在样品被置入培养装置中 之前或之后被溶解或悬浮在样品中。
[0052] 任选地，包含本公开的组合物的培养装置（例如，薄膜培养装置）还可包括非区别 性的指示剂系统。适合的非区别性的指示剂化合物包括被生长的微生物代谢或换句话讲 与它们反应，并且在这种情况下产生第四可检测产物的指示剂化合物，所述第四可检测产 物可导致微生物菌落或邻近菌落的营养物质培养基显色或发荧光，以便于可视化、成像和/ 或定量。当存在于经接种的培养基中时，非区别性的指示剂以及从其来源的第四可检测产 物，应当基本上不妨碍第一可检测产物或第二可检测产物和/或第三可检测产物的检测。 适合的非区别性的指示剂化合物的非限制性例子包括显色的氧化还原指示剂，诸如三苯基 四唑偷氯化物、对-甲苯基四唑红、四唑紫、藜芦基四唑蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸 二钠盐。非区别性的指示剂系统任选地可以在薄膜培养装置中的粘合剂层中被提供，如美 国专利No. 4, 565, 783中所述。
[0053] 在一个实施例中，所述组合物基本上由胶凝剂（例如，如本文所述的任何适合的 胶凝剂）、有利于沙门氏菌属微生物的生长的营养物质（例如，如本文所述的任何适合的 营养物质）、抑制革兰氏阳性微生物的生长的至少一种第一选择剂（例如，如本文所述的 任何适合的第一选择剂）、包含至少一种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系 统（例如，如本文所属的任何适合的第一区别性指示剂系统和第一区别性指示剂化合物） 和包含被脲酶活性转化为第二可检测产物的第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示 剂系统（例如，如本文所述的任何适合的第二区别性指示剂系统和第二区别性指示剂化合 物）组成。在该实施例中，所述第一区别性指示剂化合物能够被沙门氏菌属的多个成员转 化为第一可检测产物。在该实施例中，所述种第一区别性指示剂化合物不能够被在所述培 养基之内和/或之上形成可检测的菌落的非沙门氏菌属的、革兰氏阴性的肠道微生物的多 个属转化。
[0054] 在一个实施例中，所述组合物基本上由胶凝剂（例如，如本文所述的任何适合的 胶凝剂）、有利于沙门氏菌属微生物的生长的营养物质（例如，如本文所述的任何适合的营 养物质）、抑制革兰氏阳性微生物的生长的至少一种第一选择剂（例如，如本文所述的任 何适合的第一选择剂）、包含至少一种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系统 (例如，如本文所属的任何适合的第一区别性指示剂系统和第一区别性指示剂化合物）、包 含被脲酶活性转化为第二可检测产物的第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示剂系 统（例如，如本文所述的任何适合的第二区别性指示剂系统和第二区别性指示剂化合物） 和包含被β-半乳糖苷酶活性转化为第三可检测产物的第三区别性指示剂化合物的第三 区别性指示剂系统（例如，如本文所述的任何适合的第三区别性指示剂系统和第三区别性 指示剂化合物）组成。在该实施例中，所述第一区别性指示剂化合物能够被沙门氏菌属的 多个成员转化为第一可检测产物。在该实施例中，所述种第一区别性指示剂化合物不能够 被在所述培养基之内和/或之上形成可检测的菌落的非沙门氏菌属的、革兰氏阴性的肠道 微生物的多个属转化。
[0055] 本公开的组合物能够被用于检测样品中的沙门氏菌属微生物的方法。在本公开的 方法中被检测的样品包括多种可能被怀疑包含沙门氏菌属微生物的样品。尤其值得关注的 样品包括来自食品加工或饮料加工操作的原材料、中间产物、或成品材料。其他适合的样 品包括，例如，水样品（例如，地表水、工业用水）、环境样品（例如，空气样品；来自墙壁、地 板、排水沟、食品接触表面、加工设备的表面样品）和临床样品。临床样品的非限制性例子 包括血液、胆汁、胃肠道样品、直肠样品和粪便样品。试验样品可包括液体以及溶于或悬浮 于液体介质中的一种或多种固体。
[0056] 图1示出了根据本公开的检测样品中沙门氏菌属微生物的方法10的一个实施例。 方法10包括提供试验样品、所述组合物的组分和培养装置的步骤45。本发明的组合物的组 分可以在培养装置中被提供（例如，作为皮氏培养皿中的含水的组合物、薄膜培养装置中 的一个或多个基本上无水的可再水化的涂层）或者它们可以根据本领域中已知的方法被 添加至培养装置。
[0057] 方法10还包括使所述组合物与样品接触以形成经接种的培养装置的步骤50。样 品能够以任何的多种方式在培养装置中与所述组合物接触。例如，在本发明的方法的一个 实施例中，所述组合物能够作为以含水的形式的混合物（例如，在含水的半固体培养基中） 被置于培养装置中。在该实施例中，样品（例如，液体样品、固体样品、过滤器上捕集的液体 和/或固体样品、液体介质中悬浮的固体样品）能够通过本领域已知的技术诸如，例如移 液、平板涂布接种技术和划线平板接种技术，被置入在、并任选地分布在所述混合物内或在 其上。
[0058] 在一个可供选择的实施例中，样品（例如，包括液体和/或固体材料）与包含所述 组合物的液体混合物（例如，熔化的、温热的液体琼脂溶液）接触并与其混合。如果尚未存 在于培养装置中，则将包含样品和所述组合物的混合物转移至培养装置。
[0059] 在另一个可供选择的实施例中，组合物以脱水的形式被设置在培养装置中，诸如 在本文所述的薄膜培养装置中。将适合的含水液体（例如，无菌水、无菌稀释液；任选地包 含所述组合物的一种或多种组分）移液至培养装置中，并使培养装置中的胶凝剂再水化。 随后，样品能够被置入（例如，通过移液、划线、置入包括样品的膜过滤器）培养装置，与上 述组分接触。
[0060] 本领域的普通技术人员将认识到所述组合物在其中能够在培养装置中与样品接 触的多种其他方法。
[0061] 重新参考图1，方法10还包括孵育经接种的培养装置第一时间长度的步骤55。通 常，在升高的温度下（例如，约35-45°C )孵育（例如，在培养箱、烘箱等等中）经接种的培 养装置，以有利于肠道微生物的生长。在一些实施例中，在约37°C的温度下孵育经接种的培 养装置。在一些实施例中，孵育培养装置能够包括在包括端值在内的介于41-44°C之间的 温度下孵育培养装置。在一些实施例中，其中所述组合物包含用于检测β_半乳糖苷酶活 性的指示剂系统，经接种的培养装置可以在高于40°C的温度下被孵育，以区分邦戈尔沙门 氏菌与样品中的其他革兰氏阴性的肠道微生物，如2011年12月28日提交的美国专利申请 No. 61/580,860中所述，该文献全文以引用方式并入本文。
[0062] 培养装置被孵育一段足以允许样品中存在的肠道微生物生长和增殖的第一时间 长度。通常，培养装置将被孵育一段至少6小时的第一时间长度。在一些实施例中，培养装 置被孵育一段至少8小时的第一时间长度。在一些实施例中，培养装置被孵育一段至少10 小时的第一时间长度。在一些实施例中，培养装置被孵育一段约14至约48小时的第一时 间长度。在一些实施例中，培养装置被孵育一段约18至约48小时的第一时间长度。在一 些实施例中，培养装置被孵育一段约24至约36小时的第一时间长度。在一个优选的实施 例中，培养装置被孵育一段约24±2小时的第一时间长度。
[0063] 方法10还包括观察培养装置以检测可检测产物的步骤60。可检测产物可以是本 文所述的第一可检测产物。第一可检测产物是试验样品中可能存在沙门氏菌属微生物的指 示。沙门氏菌属微生物将第一区别性指示剂化合物转化（例如，通过发酵、通过代谢活动、 通过酶活性）为第一可检测产物。通常，在第一孵育时间长度之后观察培养装置中的营养 物质培养基。在任何实施例中，观察所述营养物质培养基以检测第一可检测产物的存在能 够包括观察所述培养装置以检测第一可检测颜色。在一些实施例中，第一可检测颜色能够 通过荧光被检测（例如，在其中第一区别性指示剂化合物包含4-甲基伞形酮- a -D-半乳 糖苷的一个实施例中）。
[0064] 在一个实施例中，其中第一区别性指示剂系统包含可发酵碳水化合物和pH指示 齐IJ，所述第一可检测颜色可以是能够将所述碳水化合物转化为一种或多种酸性产物的微生 物菌落附近的（例如，相邻的）与pH指示剂相关的有色区域。在一些实施例中，菌落可能 看上去具有与周围的营养物质培养基中的pH指示剂相同的颜色。
[0065] 在一个实施例中，其中第一区别性指示剂化合物包含显色酶底物，所述第一可 检测颜色可以是微生物菌落附近的有色区域。例如，有色区域可以包含从微生物的酶 与显色底物（例如，4-硝基苯基-α-D-半乳糖苷）的反应产生的可扩散的水溶性产物 (例如，4-硝基苯酚）。作为另外一种选择，有色区域可以包含从微生物的酶与显色底物 (5-溴-4-氯-3-吲哚基-a -D-半乳糖苷）的反应产生的水不溶性产物（例如，靛蓝）。 [0066] 观察培养装置（步骤60)包括观察该培养装置以检测本文所述的第二可检测产物 的存在或不存在。第二可检测产物通过可与细菌菌落相关联的脲酶活性对脲酶底物的水解 作用产生。在一些实施例中，第二可检测产物可包括pH指示剂，其在通过脲酶活性在含水 液体中对脲的水解作用产生的产物氢氧化铵的存在下改变颜色。不同于可以包含，例如，被 发酵为酸性产物的碳水化合物的第一区别性指示剂系统（酸性产物使得邻近与第一区别 性指示剂反应的菌落的培养基pH的降低），与第二区别性指示剂（例如，脲）反应的菌落产 生足够的氢氧化铵，使邻近该菌落的培养基的pH升高，即使该菌落能够将第一指示剂化合 物发酵为酸性产物。因此，观察到邻近微生物菌落的第二可检测产物（例如，与脲的水解相 关联的有色区域）是该菌落不属于沙门氏菌属的指示。
[0067] 当第三区别性指示剂系统存在于培养装置中时（例如，其存在于所述组合物中）， 观察培养装置（步骤60)包括观察该培养装置以检测本文所述的第三可检测产物的存在或 不存在。类似于第二可检测产物的检测，观察到第三可检测产物（例如，有色的或荧光的微 生物菌落和/或邻近菌落的区域）是该菌落不属于沙门氏菌属的指示。
[0068] 在一些实施例中，方法10还能够包括使经接种的营养物质培养基与包含第三区 另|J性指示剂化合物的第四区别性指示剂系统接触的任选的步骤65。第三区别性指示剂化合 物能够被沙门氏菌属微生物转化为第四可检测产物，并且因此，第四区别性指示剂系统起 确认第一区别性指示剂系统的结果（即，沙门氏菌属微生物的存在的指示）的作用。即，第 一可检测产物和第四可检测产物均提供沙门氏菌属微生物的存在的指示。
[0069] 第四区别性指示剂化合物能够是用于检测沙门氏菌属微生物的任何适合的指示 剂化合物，只要从其来源的第四可检测产物是能够与第一区别性指示剂系统的第一可检测 产物、第二区别性指示剂系统的第二可检测产物和第三区别性指示剂系统的第三可检测产 物相区分的，优选地为可在光学上区分的，更优选地为可从视觉上区分的。因此，在一个实 施例中，第四区别性指示剂系统可包含与能够被转化（例如，通过发酵）为第一可检测产物 (例如，酸性化合物诸如乳酸和/或例如气体如二氧化碳）的营养物质（例如，碳水化合物） 结合的pH指示剂，如本文所述。在另一个实施例中，第四区别性指示剂系统可包含显色酶 底物，如本文所述。在另一个实施例中，第四区别性指示剂系统可以是显色酶底物，如本文 所述。本文所述的任何第一区别性指示剂系统可适合被用作第四区别性指示剂系统，只要 其基本上不妨碍并且可区分于第一区别性指示剂系统和第二区别性指示剂系统和/或第 四指不剂系统（当存在时）。
[0070] 有利地，第四区别性指示剂系统能够被用作"确认"沙门氏菌属微生物在样品中的 存在的方式。即，当观察到第一可检测产物在培养装置中的存在时，这种存在能够被解释为 沙门氏菌属微生物在样品中可能的存在的指示。然而，当第四可检测产物的存在与第一可 检测产物的存在一起被观察到时（即，第一和第四可检测产物与相同的细菌菌落相关联）； 这种观察结果能够指示沙门氏菌属微生物在样品中存在的更高的可能性（例如，显著更高 的可能性）。
[0071] 在第一孵育时间长度之后，能够使用多种方法使第四区别性指示剂系统在经接种 的培养装置中与营养物质培养基相接触，包括，例如，通过使包括第四指示剂系统的制品与 营养物质培养基接触。这可以通过，例如，使用具有包括第四区别性指示剂系统的涂层的 制品来进行。例如，具有包含第四区别性指示剂系统的涂层的制品可以使用与美国专利 No. 6, 022, 682中所描述的相似的方法制备，该专利全文以引用方式并入本文。
[0072] 在包含第四区别性指示剂化合物的第四区别性指示剂系统与经接种的营养物质 培养基接触之后，所述方法可包括孵育平板第二时间长度的任选的步骤（未显示）。
[0073] 孵育经接种的培养装置第二时间长度能够包括将该装置保持在升高的温度下 (例如，在温控培养箱中）。在升高的温度下（例如，高于25°C但低于或等于约44°C)孵育 经接种的培养装置能够有利于第四区别性指示剂混合物通过肠道微生物（例如，沙门氏菌 属的成员）向第四可检测产物的转化。优选地，孵育经接种的培养装置第二时间长度包括 在包括端值在内的35-42 °C的温度下孵育所述培养装置。优选地，孵育经接种的培养装置第 二时间长度包括在42°C ±1°C的温度下孵育所述培养装置。
[0074] 在一些实施例中，第四区别性指示剂系统在孵育的第一时间长度之后与经接种的 营养物质培养基接触。有利地，这样可缩短检测第四可检测产物所需的第二孵育时间长度 的长度。因此，在一些实施例中，第二孵育时间长度能够是1小时至约6小时。在一些实施 例中，第二孵育时间长度能够是约2小时至约5小时。在一个优选的实施例中，第二孵育时 间长度是4小时± 1小时。
[0075] 本领域的普通技术人员将认识到，在任何实施例中，第一可检测产物、第二可检测 产物、第三可检测产物、或第四可检测产物中的任何一种，当存在时应当基本上不妨碍任何 其他可检测产物的检测（例如，通过颜色掩蔽或荧光淬灭）。本领域的普通技术人员将认识 至IJ，在一个实施例中，其中第一可检测产物、第二可检测产物、第三可检测产物和/或第四 可检测产物是通过颜色和/或荧光被检测，每一可检测产物应当包含不同于（例如，颜色上 可区分的）其他可检测产物的发色团和/或荧光团。
[0076] 本公开的方法包括观察培养装置以检测第一可检测产物、第二可检测产物、第三 可检测产物和/或第四可检测产物。在本发明的方法的任何实施例中，观察培养装置能够 包括观察该培养装置中的营养物质培养基。在本发明的方法的任何实施例中，观察培养装 置能够包括通过视觉上观察所述培养装置（例如，利用一个或多个人眼）。
[0077] 另外或作为另外一种选择，在任何实施例中，观察培养装置能够包括以机械方式 观察所述培养装置（例如，使用成像系统诸如，例如，美国专利No. 6, 243, 486 ;7, 496, 225 ; 和7, 351，574中描述的成像系统，上述每一专利的每个全文以引用方式并入本文。在该实 施例中，观察培养装置能够包括使用成像装置生成所述培养装置的图像。除生成培养装置 的图像外，所述方法还任选地能够包括使用处理器分析该图像。
[0078] 本公开的方法能够被用于检测样品中的微生物并任选地对其进行计数。例如，观 察到第一可检测产物在培养装置中的存在能够指示沙门氏菌属微生物（例如，邦戈尔沙门 氏菌种的成员或肠道沙门氏菌种的成员）在样品中可能的存在。然而，在根据本公开的方 法中，观察到第一可检测产物与第二可检测产物一起存在指示沙门氏菌属微生物之外的微 生物的存在。
[0079] 根据本公开对微生物进行计数还能够包括对一种或多种类型的微生物进行计数。 这些类型可通过它们各自与所述指示剂系统中的任何一种或多种的反应或没有反应而被 区分。能够通过本发明的方法被计数的微生物的类型的非限制例子包括沙门氏菌属微生 物、非沙门氏菌属微生物、产β -半乳糖苷酶的微生物和产脲酶的微生物。
[0080] 当根据本公开使用时，本发明的方法能够检测沙门氏菌属微生物在样品中的存在 或不存在。图2示出了与从图1中示出的方法获得的结果一起使用的分析流程图的一个实 施例。该流程图能够被用于确定任何给定的微生物菌落（如果其基本上是纯的并且空间上 是与其他微生物菌落分隔的）包含沙门氏菌属的成员还是非沙门氏菌属的革兰氏阴性肠 道微生物。
[0081] 在上文描述的第一孵育时间长度之后，观察培养装置以检测第一可检测产物（步 骤100)的存在或不存在和检测第二可检测产物（步骤110)的存在或不存在。第一可检测 产物和/或第二可检测产物能够如本文所述被检测。
[0082] 如果在孵育时间长度之后没有检测到第一可检测产物，则试验样品被推定为不包 含沙门氏菌属微生物（即，结果105被认为是"推测为阴性"）。如果观察到第一可检测产 物，则进一步观察培养装置以检测第二可检测产物与第一可检测产物一起的存在。如果第 一可检测产物和第二可检测产物均被观察到与一个微生物菌落相关联，则该微生物菌落被 推定为不包含沙门氏菌属微生物（即，结果115被认为是"阴性的"）。
[0083] 如果第一可检测产物被观察到与一个微生物菌落相关联，而第二可检测产物没有 被观察到与该菌落相关联，则结果117被认为是"推测为阳性"（即，结果指示该菌落可能属 于沙门氏菌属。在这种情况下，操作者可使用本文所述的第四区别性指示剂系统来确认该 微生物是否是沙门氏菌属的成员。因此，在观察微生物菌落以检测第一可检测产物和第二 可检测产物之后，观察该菌落以检测第四可检测产物的存在或不存在（步骤120)。如果第 四可检测产物被观察到与产生第一可检测产物并且不产生第二可检测产物的菌落相关联， 则关于该菌落的结果125被认为是"确认为阳性"（即，有三项独立的结果指示该菌落中存 在的微生物属于沙门氏菌属）。如果第四可检测产物没有被观察到与产生第一可检测产物 并且不产生第二可检测产物的菌落相关联，则结果135指示该微生物菌落可能是或可能不 是属于沙门氏菌属，并且可使用附加的测试（例如，基因测试、免疫学测试、生物化学测试） 来帮助鉴定该微生物。
[0084] 实施例
[0085] 实施例1是一种组合物，所述组合物包含：
[0086] 半固体培养基，其包含：
[0087] 胶凝剂；
[0088] 至少一种抑制革兰氏阳性微生物的生长的第一选择剂；
[0089] 包含至少一种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系统；和
[0090] 包含第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示剂系统，所述第二区别性指示剂 化合物被脲酶活性转化为第二可检测产物；
[0091] 其中所述第一区别性指示剂化合物能够被沙门氏菌属的多个成员转化为第一可 检测产物；
[0092] 其中所述第一区别性指示剂化合物不能够被在所述培养基之内和/或之上形成 可检测的菌落的非沙门氏菌属的、革兰氏阴性的肠道微生物的多个属转化。
[0093] 实施例2是根据实施例1所述的组合物，其中所述第一区别性指示剂化合物是选 自蜜二糖、2-脱氧-D-核糖、甘露糖醇、L-阿拉伯糖、半乳糖醇、麦芽糖、L-鼠李糖、海藻糖、 D-木糖、山梨糖醇以及上述化合物中的任何两种或更多种的组合的化合物。
[0094] 实施例3是根据实施例1或实施例2所述的组合物，所述组合物还包含缓冲剂。 [0095] 实施例4是根据实施例3所述的组合物，其中所述缓冲剂选自MOPS、磷酸盐、TES、 HEPES以及它们的组合。
[0096] 实施例5是根据前述实施例中任一项所述的组合物，所述组合物还包括第三区别 性指示剂系统，所述第三区别性指示剂系统包含被β-半乳糖苷酶活性转化为第三可检测 产物的第三区别性指示剂化合物。
[0097] 实施例6是根据实施例5所述的组合物，其中所述第三区别性指示剂化合物是显 色酶底物。
[0098] 实施例7是根据实施例6所述的组合物，其中所述第三区别性指示剂化合物选自 5_溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、邻-硝 基苯基-β -D-半乳糖苷、对-硝基苯基-β -D-半乳糖苷、3, 4-环己酮七叶苷-β -D-半乳 糖苷和6-氯_3_ Π 引哚基-β -D-半乳糖苷。
[0099] 实施例8是根据前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述至少一种第一选择 剂选自胆汁盐、胆酸、脱氧胆酸、结晶紫或上述化合物中任何两种或更多种的组合。
[0100] 实施例9是根据前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述pH指示剂选自酚 红、氯酚红、中性红、溴百里酚蓝和溴百里酚紫。
[0101] 实施例10是根据前述实施例中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一 种第二选择剂，所述第二选择剂抑制至少一种不是沙门氏菌属成员的革兰氏阴性肠道微生 物的生长。
[0102] 实施例11是根据实施例10所述的组合物，其中所述至少一种第二选择剂选自 β -内酰胺类抗生素、氨基糖甙类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素、多粘菌素抗生素 以及上述抗生素中的任何两种或更多种的组合；其中所述至少一种第二选择剂的浓度被选 择为允许沙门氏菌属微生物的生长。
[0103] 实施例12是根据实施例11所述的组合物，其中所述至少一种第二选择剂包括萘 啶酸、链霉素和多粘菌素 Β的组合；其中所述至少一种选择剂各自在所述组合中的浓度被 选择为允许沙门氏菌属微生物的生长。
[0104] 实施例13是根据实施例5所述的组合物，其中所述第一选择剂包括胆汁盐； 所述至少一种第一区别性指示剂化合物包括2-脱氧-D-核糖和蜜二糖；所述pH指示 剂包括酚红，所述第二区别性指示剂化合物包括脲，所述第三区别性指示剂化合物包括 5_氯-4-溴-3-吲哚氧基-β -D-半乳糖苷；并且所述至少一种第二选择剂包括萘啶酸、链 霉素和多粘菌素 Β。
[0105] 实施例14是根据前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述胶凝剂选自琼脂、 琼脂糖、果胶、明胶、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、藻 酸脂以及上述中的任何两种或更多种的组合。
[0106] 实施例15是基本上由下列组成的组合物：
[0107] 半固体培养基，其包含：
[0108] 胶凝剂；
[0109] 有利于多种革兰氏阴性肠道微生物的生长的营养物质；
[0110] 至少一种抑制多种革兰氏阳性微生物的生长的第一选择剂；
[0111] 包含至少一种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系统；和
[0112] 包含第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示剂系统，所述第二区别性指示剂 化合物被脲酶活性转化为第二可检测产物；
[0113] 其中所述第一区别性指示剂化合物能够被沙门氏菌属的多个成员转化为第一可 检测产物；
[0114] 其中所述第一区别性指示剂化合物不能够被在所述培养基之内和/或之上形成 可检测的菌落的非沙门氏菌属的、革兰氏阴性的肠道微生物的多个属转化。
[0115] 实施例16是基本上由下列组成的组合物：
[0116] 半固体培养基，其包含：
[0117] 胶凝剂；
[0118] 有利于沙门氏菌属微生物的生长的营养物质；
[0119] 至少一种抑制革兰氏阳性微生物的生长的第一选择剂；
[0120] 包含至少一种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系统；和
[0121] 包含第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示剂系统，所述第二区别性指示剂 化合物被脲酶活性转化为第二可检测产物；
[0122] 其中所述第一区别性指示剂化合物能够被沙门氏菌属的多个成员转化为第一可 检测产物；
[0123] 其中所述第一区别性指示剂化合物不能够被在所述培养基中和/或在其上形成 可检测的菌落的非沙门氏菌属的、革兰氏阴性的肠道微生物的多个属转化。
[0124] 实施例17是基本上由下列组成的组合物：
[0125] 半固体培养基，其包含：
[0126] 胶凝剂；
[0127] 有利于沙门氏菌属微生物的生长的营养物质；
[0128] 至少一种抑制革兰氏阳性微生物的生长的第一选择剂；
[0129] 包含至少一种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系统；
[0130] 包含第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示剂系统，所述第二区别性指示剂 化合物被脲酶活性转化为第二可检测产物；和
[0131] 包含第三区别性指示剂化合物的第三区别性指示剂系统，所述第三区别性指示剂 化合物被β-半乳糖苷酶活性转化为第三可检测产物；
[0132] 其中所述第一区别性指示剂化合物能够被沙门氏菌属的多个成员转化为第一可 检测产物；
[0133] 其中所述第一区别性指示剂化合物不能够被在所述培养基之内和/或之上形成 可检测的菌落的非沙门氏菌属的、革兰氏阴性的肠道微生物的多个属转化。
[0134] 实施例18是一种检测沙门氏菌属微生物的方法，所述方法包括：
[0135] 提供试验样品、培养装置和实施例1至17中任一项所述的组合物；
[0136] 在所述培养装置中使所述组合物与所述试验样品接触，以形成经接种的培养装 置；
[0137] 孵育所述经接种的培养装置第一时间长度；以及
[0138] 观察所述培养装置以检测第一可检测产物，其中所述第一可检测产物是沙门氏菌 属微生物的存在的第一指示。
[0139] 实施例19是根据实施例18所述的方法，其中检测所述第一可检测产物包括观察 所述pH指示剂与由细菌产生的酸性化合物的反应。
[0140] 实施例20是根据实施例18或实施例19所述的方法，所述方法还包括观察所述营 养物质培养基以检测第二可检测产物，其中所述第二可检测产物指示非沙门氏菌属的微生 物的存在。
[0141] 实施例21是根据实施例20所述的方法，其中检测第二可检测产物包括观察所述 pH指示剂与由细菌产生的碱性化合物的反应。
[0142] 实施例22是根据实施例18至21中任一项所述的方法，所述方法还包括观察所述 营养物质培养基以检测第三可检测产物，其中所述第三可检测产物指示非沙门氏菌属的微 生物的存在。
[0143] 实施例23是根据实施例22所述的方法，其中检测所述第三可检测产物包括检测 由β-半乳糖苷酶活性产生的有色产物。
[0144] 实施例24是根据实施例18至23中任一项所述的方法，所述方法还包括：
[0145] 提供具有能够被沙门氏菌属微生物代谢为第四可检测产物的验证性指示剂化合 物的制品，其中当所述第四可检测产物存在时，其能够与所述第一可检测产物、第二可检测 产物和第三可检测产物相区分；
[0146] 使所述制品与所述培养基接触；
[0147] 孵育所述装置第二时间长度；以及
[0148] 观察所述培养装置以检测所述第四可检测产物；
[0149] 其中检测到所述第四可检测产物与所述第一可检测产物一起存在是沙门氏菌属 微生物在所述样品中存在的第二指示。
[0150] 实施例25是根据实施例24所述的方法，其中孵育所述培养装置包括孵育该装置 约2小时至约5小时。
[0151] 实施例26是根据实施例18至25中任一项所述的方法，所述方法还包括对第一类 型的微生物的多个菌落进行计数。
[0152] 实施例27是根据实施例26所述的方法，所述方法还包括对第二类型的微生物的 多个菌落进行计数。
[0153] 实施例28是根据实施例18至27中任一项所述的方法，其中孵育所述培养装置包 括在包括端值在内的介于41-44°C之间的温度下孵育所述培养装置。
[0154] 实施例29是根据实施例18至28中任一项所述的方法，其中观察所述培养装置包 括视觉上观察所述培养装置。
[0155] 实施例30是根据实施例18至29中任一项所述的方法，其中观察所述培养装置包 括使用成像装置生成所述培养装置的图像。
[0156] 实施例31是根据实施例30所述的方法，所述方法还包括使用处理器分析所述图 像。
[0157] 实魁
[0158] 本发明的目的和优点进一步通过以下实例来说明，但这些实例中列举的特定材料 及其量，以及其他条件和细节不应解释为对本发明的不当限制。除非另外指明，所有份数和 百分比均以重量计，所有水为蒸馏水，并且所有分子量为重均分子量。通过将所选择的微生 物划线接种在TSA平板（含有5%羊血液的胰酶大豆琼脂平板；美国加尼福尼亚州圣玛利 亚的 Hardy Diagnostics 公司（Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA))并在 37°C孵育平板 过夜，制备了纯的细菌培养物。所有的微生物计数是根据针对菌落形成单位数的标准微生 物计数方法进行的，计数值是近似数量。
[0159] 材料。除非另有说明，材料是可从美国马里兰州巴尔的摩的Alpha Biosciences 公司（Alpha Biosciences, Baltimore, MD)商购获得的。列有ATCC编号的微生物培养物购 自美国典型培养物保藏中心（ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯（Manassas，VA))。实例的制 备中利用的材料示出在表1中。
[0160] 表1.材料
[0161]

【权利要求】
1. 一种组合物，其包含： 半固体培养基，其包含： 胶凝剂； 至少一种抑制革兰氏阳性微生物的生长的第一选择剂； 包含至少一种第一区别性指示剂化合物的第一区别性指示剂系统；和 包含第二区别性指示剂化合物的第二区别性指示剂系统，所述第二区别性指示剂化合 物被脲酶活性转化为第二可检测产物； 其中所述第一区别性指示剂化合物能够被沙门氏菌属（Salmonella)的多个成员转化 为第一可检测产物； 其中所述第一区别性指示剂化合物不能够被在所述培养基之内和/或之上形成可检 测的菌落的非沙门氏菌属的、革兰氏阴性的肠道微生物的多个属转化。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一区别性指示剂化合物是选自蜜二糖、 2_脱氧-D-核糖、甘露糖醇、L-阿拉伯糖、半乳糖醇、麦芽糖、L-鼠李糖、海藻糖、D-木糖、 山梨糖醇以及上述化合物中的任何两种或更多种的组合的化合物。
3. 根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其还包含缓冲剂。
4. 根据权利要求3所述的组合物，其中所述缓冲剂选自MOPS、磷酸盐、TES、HEPES以及 它们的组合。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包括第三区别性指示剂系统，所述 第三区别性指示剂系统包含被β-半乳糖苷酶活性转化为第三可检测产物的第三区别性 指示剂化合物。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述第三区别性指示剂化合物是显色酶底物。
7. 根据权利要求6所述的组合物，其中所述第三区别性指示剂化合物选自 5_溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、邻-硝 基苯基-β -D-半乳糖苷、对-硝基苯基-β -D-半乳糖苷、3, 4-环己酮七叶苷-β -D-半乳 糖苷和6-氯_3_ Π 引哚基-β -D-半乳糖苷。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述至少一种第一选择剂选自胆汁 盐、胆酸、脱氧胆酸、结晶紫或上述化合物中任何两种或更多种的组合。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述pH指示剂选自酚红、氯酚红、 中性红、溴百里酚蓝和溴百里酚紫。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含至少一种第二选择剂，所述第 二选择剂抑制至少一种不是沙门氏菌属成员的革兰氏阴性肠道微生物的生长。
11. 根据权利要求10所述的组合物，其中所述至少一种第二选择剂选自β-内酰胺类 抗生素、氨基糖甙类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素、多粘菌素抗生素以及上述抗 生素中的任何两种或更多种的组合；其中所述至少一种第二选择剂的浓度被选择为允许沙 门氏菌属微生物的生长。
12. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述至少一种第二选择剂包括萘啶酸、链霉 素和多粘菌素 Β的组合；其中所述至少一种选择剂各自在所述组合中的浓度被选择为允许 沙门氏菌属（Salmonella)微生物的生长。
13. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述第一选择剂包括胆汁盐；所述至少一种第 一区别性指示剂化合物包括2-脱氧-D-核糖和蜜二糖；所述pH指示剂包括酚红，所述第二 区别性指示剂化合物包括5-氯-4-溴-3-吲哚氧基-β -D-半乳糖苷；并且所述至少一种 第二选择剂包括萘啶酸、链霉素和多粘菌素 Β。
14. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胶凝剂选自琼脂、琼脂糖、果 胶、明胶、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、褐藻胶以及 上述中的任何两种或更多种的组合。
15. -种检测沙门氏菌属微生物的方法，所述方法包括： 提供试验样品、培养装置和权利要求1至14中任一项所述的组合物； 在所述培养装置中使所述组合物与所述试验样品接触以形成经接种的培养装置； 孵育所述经接种的培养装置第一时间长度；以及 观察所述培养装置以检测第一可检测产物，其中所述第一可检测产物是沙门氏菌属微 生物的存在的第一指示。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中检测所述第一可检测产物包括观察所述pH指示 剂与由细菌产生的酸性化合物的反应。
17. 根据权利要求15或权利要求16所述的方法，该方法还包括观察所述营养物质培养 基以检测第二可检测产物，其中所述第二可检测产物指示非沙门氏菌属的微生物的存在。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中检测所述第二可检测产物包括观察所述pH指示 剂与由细菌产生的碱性化合物的反应。
19. 根据权利要求15至18中任一项所述的方法，该方法还包括观察所述营养物质培养 基以检测第三可检测产物，其中所述第三可检测产物指示非沙门氏菌属的微生物的存在。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中检测所述第三可检测产物包括检测由β-半乳 糖苷酶活性产生的有色产物。
21. 根据权利要求15至20中任一项所述的方法，该方法还包括： 提供具有能够被沙门氏菌属微生物代谢为第四可检测产物的验证性指示剂化合物的 制品，其中当所述第四可检测产物存在时，其能够与所述第一可检测产物、第二可检测产物 和第三可检测产物相区分； 使所述制品与所述培养基接触； 孵育所述装置第二时间长度；以及 观察所述培养装置以检测所述第四可检测产物； 其中检测到所述第四可检测产物与所述第一可检测产物一起存在是沙门氏菌属微生 物在所述样品中存在的第二指示。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中孵育所述装置包括孵育该装置2小时至5小时。
23. 根据权利要求15至22中任一项所述的方法，该方法还包括对第一类型的微生物的 多个菌落进行计数。
24. 根据权利要求23所述的方法，该方法还包括对第二类型的微生物的多个菌落进行 计数。
25. 根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其中孵育所述培养装置包括在包括端 值在内的介于41-44°C之间的温度下孵育所述培养装置。
26. 根据权利要求15至25中任一项所述的方法，其中观察所述培养装置包括视觉上观 察所述培养装置。
27. 根据权利要求15至26中任一项所述的方法，其中观察所述培养装置包括使用成像 装置生成所述培养装置的图像。
28. 根据权利要求27所述的方法，该方法还包括使用处理器分析所述图像。
【文档编号】C12Q1/04GK104093851SQ201280065492
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2011年12月28日
【发明者】克里斯蒂娜·A·宾斯费尔德, 帕特里克·A·马赫, 玛拉·S·切尔特, 亚当·J·斯塔内纳斯 申请人:3M创新有限公司