使用xpd解旋酶表征多核苷酸的方法

使用xpd解旋酶表征多核苷酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法利用孔和XPD解旋酶。所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。
【专利说明】使用XPD解旋酶表征多核苷酸的方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。该方法使用孔及xro解旋酶。解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动。

【背景技术】
[0002]当前需要一种适合于各种应用的快速且廉价的多核苷酸(例如DNA或RNA)测序和鉴定的技术。现有技术很慢并且昂贵，这主要是因为它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸并需要大量专门的荧光化学物质来检测信号。
[0003]当跨膜孔(纳米孔)具有极大的用作聚合物及多种小分子的直接的电生物传感器的潜力。特别是，最近关注的是将纳米孔作为潜在的DNA测序技术。
[0004]当跨纳米孔施加电势时，当分析物，如核苷酸，在桶内短暂停留一定时间段后，电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸得到已知标志(signature)的电流变化和持续时间。在“链测序”(“Strand Sequencing”)方法中，使单个多核苷酸链穿过孔,得到对该核苷酸的鉴定。链测序可包括，使用核苷酸调控蛋白来控制多核苷酸穿过孔的运动。


【发明内容】

[0005]本发明已经证明了 XPD解旋酶可控制多核苷酸穿过孔的运动，尤其是当对所述孔施加电势，例如电压时 。解旋酶能够以可控和逐步的方式逆着或顺着由施加电压得到的场移动目标多核苷酸。出人意料的是，解旋酶能够在高盐浓度下起作用，所述高盐浓度对表征多核苷酸有利，特别是对使用链测序确定其序列有利。这将在下面更详细地讨论。
[0006]因此，本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法，包括:
[0007](a)使目标多核苷酸与跨膜孔及XPD解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔，并使XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；和
[0008](b)当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
[0009]本发明还提供了:
[0010]-一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括在孔和XPD解旋酶之间形成复合体并从而形成用于表征目标多核苷酸的传感器；
[0011]-xro解旋酶在控制目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用；
[0012]-一种表征目标多核苷酸的试剂盒，其包括(a)孔和(b) Xro解旋酶；和
[0013]-—种用于表征样本中目标多核苷酸的分析装置，包括多个孔和多个XPD解旋酶；
[0014]-—种表征目标多核苷酸的方法，包括:
[0015](a)使目标多核苷酸与xro解旋酶接触，使得xro解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动；和
[0016](b)当xro解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并从而表征所述目标多核苷酸；
[0017]-XPD解旋酶在表征目标多核苷酸过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用；
[0018]-xro解旋酶在对目标多核苷酸的一部分或全部进行测序的过程中，控制目标多核苷酸的运动中的应用；
[0019]-一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析装置，其特征在于其包括XPD解旋酶；和
[0020]-一种表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)用于表征所述目标多核苷酸的分析装置和(b) xro解旋酶。

【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1A)为使用解旋酶控制DNA移动穿过纳米孔的实施例的示意图。反侧的箭头显示了 DNA的运动方向。顺侧的箭头显示了解旋酶相对于DNA的运动方向。从左到右，具有含胆固醇标签的退火引物的单链DNA底物(图1B)被添加到双分子层的顺侧。胆固醇标签结合到双分子层，将所述底物富集在双分子层表面。添加到顺式隔室(cis compartment)的解旋酶结合到DNA。在二价金属离子和NTP底物存在时，解旋酶沿着DNA移动。在施加的电压下，所述DNA底物经DNA上的前导区部分被纳米孔捕获。在施加的电势的力的作用下，所述DNA被牵拉穿过所述纳米孔直到结合到DNA上的解旋酶与所述孔的顶部接触，防止进一步的不受控的DNA移位。所述解旋酶沿着所述DNA以5’到3’的方向运动，便于使螺旋状(threaded) DNA顺着施加的电场受控移位而穿过所述纳米孔。所述解旋酶促使DNA移位穿过纳米孔，使其进入反式隔室。穿过纳米孔的DNA的最后部分为3’端。当解旋酶已促使DNA穿过纳米孔的移位完成时，该解旋酶从该链上解离。图1B为在本实施例中使用的DNA底物设计之一。
[0022]图2显示了解旋酶能够以受控方式使DNA移动穿过纳米孔，随着DNA移动穿过纳米孔，电流发生逐步变化。示例解旋酶-DNA事件(140mV, 400mM NaCl, HepesρΗ8.0, 0.6nM400mer DNA, 10nM XPD Mbu, ImM DTT, ImM ATP, ImM MgCl2)。上部)为，获得的XPD400mer DNA事件穿过MspA B2纳米孔的电流对时间的分图。开孔电流为~95pA。在施加的电势(+140mV)的力的情况下，DNA被纳米孔捕获。连接有酶的DNA得到长的模块(block)(在该条件下，在~25pA)，随着酶使DNA移动穿过所述纳米孔，该模块显示出逐步变化的电流。下部)，该下分图显示了解旋酶控制DNA运动事件之一的放大图，示出了 DNA-酶的捕获、当DNA被牵拉出所述纳米孔时电流的逐步变化。
[0023]图3显示了解旋酶控制DNA运动事件的另一个例子。下部)为，所述事件的一部分的放大图，示出了当DNA链不同部分移动穿过纳米孔时电流的逐步变化。
[0024]图4显示了解旋酶至少以两种操作模式控制DNA的移动。解旋酶沿着DNA的5’到3’的方向运动，而DNA在纳米孔中的定向(取决于该DNA的哪一端被捕获)是指，所述酶能用于将DNA逆着施加的电场移出所述纳米孔，或者将DNA顺着该施加的电场移入所述纳米孔。左图)为，当DNA的3’端被捕获时，解旋酶逆着电压所施加的电场的方向起作用，将螺旋状DNA牵拉出纳米孔，并进入顺式隔室中。右图)为，当DNA的5’端(5’ -down)向下被捕获到纳米孔中时，解旋酶沿着电场的方向将DNA移动到纳米孔中，并进入到双分子层的反侧。
[0025]图5显示了测试酶活性的荧光试验。A)使用常规的荧光底物来检测解旋酶用于置换(displace)杂交的双链DNA的能力。I)荧光底物链(50nM终浓度)具有5’单链DNA悬突，以及杂交的双链DNA的40个碱基部分。主链上部(major upper strand)在3’末端具有羧基荧光素碱基，并且所述杂交的互补链在5’末端具有黑洞淬灭剂(black-holequencher (BHQ-1))碱基。当杂交时，荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭，并且底物基本上是无荧光的。该试验中包括与荧光底物的较短链互补的I μ M捕获链。2)在ATP(ImM)和MgCl2(1mM)的存在下，添加到底物的解旋酶(150ηΜ)结合至荧光底物的5'尾部，沿着主链移动，并如所示置换互补链。3)具有BHQ-1的互补链完全被置换，主链上荧光素发荧光。4)过量的捕获链优选与互补链DNA退火以防止初始底物重新退火并防止丢失荧光。B)显示了在含有10mM至2Μ的不同浓度的KCl的缓冲溶液(10mM Hepes pH 8.0, ImM ATP, 1mMMgCl2, 50nM荧光底物DNA，I μ M捕获DNA)中的Mbu XPD解旋酶活性的初始速率的图。
[0026]图6为实施例1中所用的垫片(spacer) iSpl8的结构。
[0027]序列表的说明
[0028]SEQ ID NO:1示出了密码子优化的、编码MS-Bl突变MspA单体的多核苷酸序列。该突变缺少信号序列并包括下列突变:D90N, D91N, D93N, D118R, D134R和E139K。
[0029]SEQ ID NO: 2示出了 MspA单体的MS-Bl突变的成熟形式的氨基酸序列。该突变缺少信号序列并包括下列突变:D90N, D91N, D93N, D118R, D134R和E139K。
[0030]SEQ ID N0:3 示出了编码 α -溶血素 _E111N/K147N( a -HL-NN ；Stoddart etal., PNAS, 2009 ; 106 (19):7702-7707)的一个亚基的多核苷酸序列。
[0031]SEQ ID N0:4示出了 a-HL-NN的一个亚基的氨基酸序列。
[0032]SEQ ID NO: 5至7示出了 MspB、C和D的氨基酸序列。
[0033]SEQ ID N0:8和9示出了 XPD模序(motif) V和VI的氨基酸序列。
[0034]SEQ ID NO: 10至62示出了表5中XPD解旋酶的氨基酸序列。
[0035]SEQ ID NO: 63至68示出了各实施例中使用的序列。
具体实施方案
[0036]应理解的是，公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需求进行调整。还应理解的是，本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案，不意欲进行限制。
[0037]另外，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式的“一个”、“所述”包括复数指代物，除非文中另有明确说明。因此，例如，涉及“一个孔”时包括两个或多个这样的孔，涉及“一个解旋酶”时包括包括两个或多个这样的解旋酶，涉及“一个多核苷酸”时包括两个或多个多这样的多核苷酸，等。
[0038]所有在本文中引用的出版物、专利和专利申请，无论前文或后文，均以全文参考的方式纳入本文中。
[0039]本发明的方法
[0040]本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法。所述方法包括使目标多核苷酸与跨膜孔和XPD解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过孔，并使XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。然后当目标多核苷酸相对于孔移动时，使用本领域已知的标准方法测量该目标多核苷酸的一个或多个特征。所述目标多核苷酸的一个或多个特征优选在该多核苷酸移动穿过所述孔时进行测量。步骤(a)和(b)优选通过跨所述孔施加电势而实施。如下文更详细的论述，施加电势通常导致在所述孔和解旋酶之间形成复合体。所施加的电势可以是电压电势。替代地，所施加的电势可以是化学电势。其一个例子是在跨两性分子层中使用盐梯度。Holden 等人，J Am Chem Soc.2007Julll ;129 (27): 8650-5 中公开了盐梯度。
[0041]在一些情形中，当多核苷酸相对于所述孔而移动时，使用穿过所述孔的电流来确定目标多核苷酸的序列。这就是链测序。
[0042]所述方法具有多个优势。首先，本发明人出乎意料地发现XPD解旋酶具有出乎意料的高的盐耐受性，因此本发明方法可以在高的盐浓度下实施。在链测序中，电荷载体，诸如盐，是产生导电溶液必须的，所述导电溶液用于施加补偿电压以捕获和异位目标多核苷酸以及当目标多核苷酸相对于孔移动时测定产生的序列依赖性电流变化。由于测量信号依赖于盐浓度，因此有利的是使用高的盐浓度以提高获得信号的强度。高的盐浓度提供了高信噪比，并使得在正常电流波动的背景下，代表核苷酸存在的电流能被识别。对于链测序，超过10mM的盐浓度是理想的，例如超过400mM, 600mM或800mM的盐浓度。本发明人出乎意料地发现xro解旋酶能在极高的盐浓度下有效发挥作用，例如IM的盐浓度下。本发明包括在超过IM的盐浓度下，例如2M盐浓度下有效发挥作用的解旋酶。
[0043]第二，当施加电压时，XPD解旋酶能出乎意料地朝两个方向，即逆着或顺着由施加的电压产生的电场而移动目标多核苷酸。因此，本发明的方法可以一种或两种优选方式实施。根据目标多核苷酸相对所述孔移动的方向，即顺着或逆着电场的方向，获得不同的信号。下面将对这进行更详细地论述。
[0044]第三，xro解旋酶通常每次移动目标多核苷酸中的一个核苷酸穿过所述孔。xro解旋酶由此能起到类似单碱基棘齿(ratchet)的作用。当然，这在测序目标多核苷酸时是有利的，因为使用所述孔可以鉴定目标多核苷酸中的基本全部的一如果不是全部的话一核苷酸。
[0045]第四，xro解旋酶能够控制单链多核苷酸和双链多核苷酸的移动。这意味着根据本发明能够表征多种不同的目标多核苷酸。
[0046]第五，xro解旋酶对施加的电压产生的电场表现出极大的耐受性。本发明人发现在“解链”(“unzipping”)状态下多核苷酸几乎不发生移动。解链状态通常是在缺乏核苷酸，例如缺乏ATP时候出现。当所述解旋酶在解链模式下操作时，其作用类似闸，防止目标序列在所施加电压的影响下太快地移动穿过所述孔。这是很重要的，因为这意味着，当逆着所施加电压产生的电场移动多核苷酸时，不会发生由不希望的“向后”移动而产生的问题。
[0047]第六，xro解旋酶容易制备和容易操控。因此它们适合用于直接且便宜的测序方法。
[0048]本发明方法是用于表征目标多核苷酸。多核苷酸，例如核酸，是一种含有两个或多个核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可以包含任何核苷酸的任何组合。所述核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被破坏。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被修饰，例如使用标记或标签。所述目标核苷酸可以包括一个或多个间隔物。
[0049]核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基团。核苷碱基通常是杂环的。核碱基包括，但不限于，嘌呤和嘧啶，以及更具体地，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖通常为戊糖。核苷酸糖包括，但不限于，核糖和脱氧核糖。所述核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可以连接在核苷酸的5’或3’端。
[0050]核苷酸包括，但不限于，腺苷单磷酸(AMP)、鸟苷单磷酸(GMP)、胸苷单磷酸(TMP)、尿苷单磷酸(UMP)、胞苷单磷酸(CMP)、环状腺苷单磷酸(cAMP)，环状鸟苷单磷酸(cGMP)、脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、脱氧胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧尿苷单磷酸(dUMP)和脱氧胞苷单磷酸(dCMP)。所述核苷酸优选选自AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 或 dCMP。
[0051]核苷酸可以是脱碱基的(即缺少核碱基)。
[0052]所述多核苷酸可以是单链或双链的。至少多核苷酸的一部分优选是双链的。
[0053]所述多核苷酸可以是核酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。所述目标多核苷酸可包括与一条DNA链杂交的一条RNA链。所述多核苷酸可以是本领域已知的任何人造核酸，诸如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(locked nucleicacid, LNA)，或其他具有核苷酸侧链的合成聚合物。
[0054]目标多核苷酸的整体或仅部分可以使用该方法表征。所述目标多核苷酸可具有任何长度。例如，所述目标多核苷酸可以具有至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸对的长度。所述目标多核苷酸可以具有1000或更多核苷酸对、5000或更多核苷酸对的长度或100000或更多核苷酸对的长度。
[0055]目标多核苷酸存在于任何合适的样本中。本发明通常针对已知含有或怀疑含有目标多核苷酸的样本而实施。替代地，对样本实施本发明可以是为了确认一个或多个目标多核苷酸的同一'I"生，所述目标多核苷酸已知或预期存在于所述样本中。
[0056]所述样本可以是生物样本。本发明可以针对由任何有机体或微生物体获得或提取的样本在体外实施。所述有机体或微生物体通常是古核的(archaean)、原核的或真核的，并通常属于以下五界之一:植物界、动物界、真菌界、无核原生物界和原生生物界。本发明可以针对由任何病毒获得或提取的样本在体外实施。所述样本优选为液体样本。所述样本通常包括患者的体液。所述样本可以是尿液、淋巴液、唾液、粘液或羊水，但优选为血液、血衆或血清。通常，所述样本来自人，但替代地，其可以是来自其他哺乳动物，例如来自商购的家畜，如马、牛、羊或猪，或可替代地，为宠物，如猫或狗。替代地，源自植物的样本通常获得自经济作物，例如谷类、豆类、水果或蔬菜，如小麦、大卖、燕麦、油菜、玉米、大豆、稻、香蕉、苹果、西红柿、马铃薯、葡萄、烟草、黄豆、扁豆、甘蔗、可可、棉花。
[0057]所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选为液体样本。所述非生物样本的实例包括外科手术液体、水，例如饮用水、海水或河水，以及用于实验室测试的试剂。
[0058]通常在分析前对所述样本进行处理，例如，通过离心或通过膜过滤掉不需要的分子或细胞，诸如红血细胞。所述样本可以在获取后立即进行检测。所述样本通常也可以在分析前储存，优选在低于_70°C储存。
[0059]跨膜孔是一种能在一定程度上跨膜的结构。其能使离子，例如水合离子，在被施加的电势驱动下而流经所述膜或在所述膜内中流动。跨膜孔通常跨整个膜，使得离子可以从膜的一侧流到膜的另一侧。但是，跨膜孔不一定必须跨所述膜。其可以是一端封闭的。例如，所述孔可以是可使离子流经或流入的膜中的一个孔。
[0060]本发明可使用任何膜。合适的膜是本领域已知的。所述膜优选为两性分子层。两性分子层是一种由具有至少一个亲水性部分和至少一个亲脂性或疏水性部分的两性分子，例如磷脂，形成的层。所述两性分子层可以是单分子层或双分子层。两性分子层通常为平面脂质双分子层或支撑双分子层。
[0061]所述两性分子层通常为脂质双分子层。脂质双分子层是细胞膜的模型并被用作多种实验研究的优良平台。例如，脂质双分子层能被用于通过单通道记录在体外研究膜蛋白。替代地，脂质双分子层可以用作生物传感器，以检测多种物质的存在。所述脂质双分子层可以是任何的脂质双分子层。合适的脂质双分子层包括但不限于，平面脂质双分子层、支撑双分子层或脂质体。所述脂质双分子层优选为平面脂质双分子层。合适的脂质双分子层在国际申请号 PCT/GB08/000563 (公布号 W02008/102121)、国际申请号 PCT/GB08/004127 (公布号 TO2009/077734)和国际申请号 PCT/GB2006/001057 (公布号 W02006/100484)中有公开。
[0062]形成脂质双分子层的方法是本领域已知的。合适的方法公开在实施例中。脂质双分子层通常通过Montal 和 Mueller (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA., 1972 ；69:3561-3566)的方法形成，其中脂质单分子层穿过孔的任一侧负载在水溶液/空气界面上，所述孔垂直于所述界面。
[0063]所述Montal & Mueller的方法被普遍应用，因为其成本经济并是一种相对直接的用于形成适合蛋白质孔嵌入(protein pore insert1n)的质量良好的脂质双分子层的方法。其他常用的形成双分子层的方法包括脂质体双分子层的尖端浸溃(tip-dipping)、涂覆双分子层(painting bilayers)和膜片钳(patch-clamping)方法。
[0064]在一个优选实施方案中，所述脂质双分子层如国际申请号PCT/GB08/004127(公布号W02009/077734)中所述而形成。
[0065]在另一个优选实施方案中，所述膜为固态层。固态层不来源于生物体。换言之，固态层不是由生物环境获得或分离出的，所述生物环境诸如有机体或细胞，或是生物学可获得的结构的合成制备产物(synthetically manufactured vers1n)。固态层可以由有机和无机材料形成，所述有机和无机材料包括但不限于，微电子材料、绝缘材料，如Si3N4、Al2O3和S1，有机和无机聚合物，如聚酰胺、塑料，如Teflon?或弹性体，如双组分加成固化硅橡胶，以及玻璃。所述固态层可以由单原子层形成，如石墨烯，或者只有几个原子厚的层形成。适合的石墨烯层在国际申请号PCT/US2008/010637(公布号W02009/035647)中有公开。
[0066]所述方法通常使用以下物质而实施:(i)含有孔的人工两性分子层，(ii)分离出的天然存在的含有孔的脂质双分子层，或(iii)含有孔嵌入其中的细胞。所述方法通常使用人工两性分子层，诸如人工脂质双分子层而实施。所述层除孔之外还可以含有其他跨膜和/或膜内蛋白以及其他分子。适合的设备和条件如下所述。本发明的方法通常在体外实施。
[0067]所述多核苷酸可以偶联到所述膜。这可使用任何已知方法完成。如果所述膜是两性分子层，如脂质双分子层(如上文详细描述的)，则所述多核苷酸优选通过存在于所述膜中的多肽或存在于所述膜中的疏水锚(anchor)偶联到所述膜。所述疏水锚优选为脂质、月旨肪酸、固醇、碳纳米管或氨基酸。
[0068]所述多核苷酸可以直接偶联到所述膜。所述多核苷酸优选通过连接体(linker)偶联到所述膜。优选的连接体包括但不限于，聚合物如多核苷酸，聚乙二醇(PEG)和多肽。如果多核苷酸直接偶联到所述膜，则由于所述膜与所述解旋酶之间的距离，表征不能持续进行到所述多核苷酸的末端，因此将丢失一些数据。如果使用连接体，则所述多核苷酸能够被表征完全。如果使用连接体，则连接体可以在任何位置连接到所述多核苷酸。所述连接体优选在尾部聚合物连接到所述多核苷酸。
[0069]所述偶联可以是稳定的或暂时的。对于某些应用，暂时性的偶联是优选的。如果稳定偶联的分子直接连接到多核苷酸的5’或3’端，则由于所述双分子层与所述解旋酶的活性位点之间的距离，表征不能持续进行到所述多核苷酸的末端，因此将丢失一些数据。如果所述偶联是暂时性的，则当偶联的末端随机地变为双分子层的自由端时，所述多核苷酸能被表征完全。与膜形成稳定或暂时性的连接的化学基团在下面更详细的描述。所述多核苷酸可以使用胆固醇或脂肪酰链暂时性地偶联到两性分子层，例如脂质双分子层。可以使用具有6-30个碳原子长度的任何脂肪酰链，例如十六烷酸。
[0070]在优选实施方案中，将多核苷酸偶联到两性分子层。多核苷酸与合成的脂质双分子层的偶联已预先用多种不同的栓系策略(tethering strategies)实施。这些策略概述于下表1中。
[0071]表1
[0072]

【权利要求】
1.一种表征目标多核苷酸的方法，包括: (a)使目标多核苷酸与跨膜孔及XPD解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔，并使XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；和 (b)当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)目标多核苷酸的长度，(ii)目标多核苷酸的同一性，(iii)目标多核苷酸的序列，(iv)目标多核苷酸的二级结构，和(V)目标多核苷酸是否被修饰。
3.根据权利要求2所述的方法，其中对所述目标多核苷酸用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物、标签或间隔物通过甲基化、氧化、损伤，进行了修饰。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述目标多核苷酸的一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行测量。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述电测量为电流测量、阻抗测量、隧道测量或场效应晶体管(FET)测量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括: (a)使目标多核苷酸与跨膜孔和XPD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔并使XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；和 (b)当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔而移动时，测量穿过所述跨膜孔的电流，其中所述电流代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括当所述目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔时获取一个或多个测量值。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括跨所述跨膜孔施加电压以在所述跨膜孔和所述解旋酶之间形成复合体的步骤。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少所述目标多核苷酸的一部分是双链的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述跨膜孔为跨膜蛋白孔或固态孔。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔选自溶血素、杀白细胞素、耻垢分枝杆菌膜孔蛋白A(MspA)、外膜蛋白F(OmpF)、外膜蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A、奈瑟氏菌自转运脂蛋白(NalP)和WZA。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述跨膜蛋白由下述物质形成:(a)SEQIDNO:2中所示八个相同的亚基；或(b)所述亚基的变体，其中，基于氨基酸的同一性，七个亚基中的一个或多个与SEQ ID N0:2的整个序列具有至少50%的同一性，且保留有孔活性。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述跨膜蛋白为:(a)SEQID N0:4中所示由七个相同亚基形成的α-溶血素；或(b)所述亚基的变体，其中，基于氨基酸的的同一性，所述七个亚基中的一个或多个与SEQ ID N0:4的整个序列具有至少50%的同一性，且保留有孔活性。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述XPD解旋酶包括: (a)氨基酸模序 X1-X2-X3-G-X4-X5-X6-E-G(SEQ ID NO:8)，其中 XI，X2, X5 和 X6 独立地选自除D，E，K和R之外的任意氨基酸，且其中X3和X4可为任意氨基酸残基；和/或(b)氨基酸模序 Q-Xa-Xb-G-R-Xc-Xd-R-(Xe)3-Xf-(Xg)7-D-Xh-R(SEQ ID N0:9)，其中Xa, Xe和Xg可为任意氨基酸残基，且其中Xb，Xe和Xd独立地选自除D，E，K和R之外的任意氨基酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中XI，X2,X5及X6和/或Xb，Xe及Xd独立地选自G, P, A, V, L, I, M, C，F，Y, W, H, Q, N, S 和 T。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述解旋酶包括以下模序:
(a)YLffGTLSEG(SEQID NO:11)和 / 或
QAMGRVVRSPTDYGARILLDGR(SEQ ID NO:12)；
(b)SLffGTLAEG(SEQID NO:14)和 / 或
QAIGRVVRGPDDFGVRILADRR(SEQ ID NO:15)；
(c)YLffGTLSEG(SEQID NO:11)和 / 或
QAMGRWRSP⑶FGVRILLDAR(SEQ ID NO: 17)；
(d)YLffGTLSEG(SEQID NO:11)和 / 或
QAMGRVVRSPSDYGARILLDGR(SEQ ID NO:19)；
(e)SLffGTLAEG(SEQID NO:14)和 / 或
QALGRVVRSPTDFGVR VLVDER(SEQ ID NO:21)；
(f)VTGGVFAEG(SEQID NO:23)和 / 或
QAAGRVLRTPEDRGVIALLGRR(SEQ ID NO:24)；
(g)LGTGAFffEG(SEQID NO:26)和 / 或
QGVGRLIRDERDRGVLILCDNR(SEQ ID NO:27)；
(h)YIffGTLSEG(SEQID NO:29)和 / 或
QAMGRVVRSPTDYGARILIDGR(SEQ ID NO:30)；
(i)YLffGTLSEG(SEQID NO:11)和/或
QAMGRIVRSPDDYGVRILLDSR(SEQ ID NO:32)；
(j)SLffGTLAEG(SEQ ID NO:14)和 / 或
QALGRVIRAPDDFGVRVLADKR(SEQ ID NO:34)；
(k)VSGGRLSEG(SEQ ID NO:36)和 / 或 QEIGRLIRSAEDTGACVILDKR(SEQ ID NO:37)；
(l)VMGGRNSEG(SEQ ID NO:39)和 / 或
QAAGRVHRSEEEKGAVVVLDYR(SEQ ID NO:40)；
(m)VMGGRNSEG(SEQ ID NO:39)和 / 或
QAAGRVHRSEEEKGSIVILDYR(SEQ ID NO:42)；
(n)SLffGTLAEG(SEQ ID NO:14)和 / 或
QAMGRVIRSPEDFGVRMLVDRR(SEQ ID NO:45)；
(o)LATGRFAEG(SEQ ID NO:47)和 / 或
QMIGRLIRTENDYGVVVIQDKR(SEQ ID NO:48)；
(p)IARGKLAEG(SEQ ID NO:50)和 / 或
QSIGRAIRGPTDNATIffLLDKR(SEQ ID NO:51)；
(q)VGKGKLAEG(SEQ ID NO:53)和 / 或
QAIGRAIRDVNDKCNVffLLDKR(SEQ ID NO:54)；(r)VMGGRNSEG(SEQ ID NO:39)和 / 或
QAAGRVHRSAEEKGAIIILDYR(SEQ ID NO:56)；
(s)SLffGTLAEG(SEQ ID NO:14)和 / 或
QALGRVIRSPEDVGVRALLDRR(SEQ ID NO:58)；
(t)SLffGTLAEG(SEQ ID NO:14)和 / 或
QALGRVIRSPEDFGVRILLDKR(SEQ ID NO:60);或
(u)YLffGTLSEG(SEQ ID NO:11)和 / 或
QAMGRWRSP⑶FGVRILLDAR(SEQ ID NO: 17)。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述xro解旋酶为表4或5中所示解旋酶之一或其变体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述XH)解旋酶含有(a)SEQ ID NO: 10, 13, 16，18，20，22，25，28，31，33，35，38，41，43，44，46，49，52，55，57，59，61 和 62 种任一个所示的序列，或(b)所述序列的变体，基于氨基酸的同一性，该变体与相关序列的整个序列具有至少30%的同一性，且保留有解旋酶活性。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述Xro解旋酶含有(a)SEQ ID NO: 10中所示的序列，或(b)所述序列的变体，基于氨基酸的同一性，该变体与SEQ ID NO: 10的整个序列具有至少40%的同一性，且保留有解旋酶活性。
20.根据前述权利 要求中任一项所述的方法，其中所述方法使用至少0.3M的盐浓度实施，并且所述盐可选地为KCl。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述盐浓度至少为1.0M。
22.—种形成表征目标多核苷酸用传感器的方法，包括在孔和xro解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述复合体通过下述形成:(a)在目标多核苷酸的存在下使所述孔和解旋酶接触，和(b)跨所述孔施加电势。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述电势为电压电势或化学电势。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述复合体通过将所述孔共价连接到所述解旋酶而形成。
26.XPD解旋酶在控制目标多核苷酸移动穿过孔中的应用。
27.一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)XH)解旋酶。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括含两性分子层的芯片。
29.—种用于表征样本中目标多核苷酸的分析设备，包括多个孔和多个XPD解旋酶。
30.根据权利要求29所述的分析设备，其中所述分析设备包括: 传感器装置，能支撑所述多个孔，并可操作地使用所述孔和解旋酶来表征多核苷酸； 至少一个存储器，容纳用于进行表征的材料； 流体系统，配置成从至少一个存储器可控地向所述传感器装置供应材料；以及多个容器，用于接收各样本，所述流体系统被配置成，选择性地从所述容器向所述传感器装置供应样本。
31.一种表征目标多核苷酸的方法，包括: (a)使目标多核苷酸与XPD解旋酶接触，使得所述XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸的移动；和 (b)当所述XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸移动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
32.根据权利要求31所述的方法，其中: (a)所述一个或多个特征如权利要求2中所限定； (b)所述目标多核苷酸如权利要求3或9中所限定； (c)所述一个或多个特征按权利要求4或5中限定的进行测量； (d)所述XPD如权利要求14至19中任一项所限定；或 (e)所述方法按按权利要求20或21中限定的来实施。
33.XPD解旋酶在表征目标多核苷酸过程中控制该目标多核苷酸的移动中的应用。
34.XPD解旋酶在对目标多核苷酸进行部分或完整测序过程中控制该目标多核苷酸的移动中的应用。
35.一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析设备，其特征在于，所述分析设备包含xro解旋酶。
36.一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒,包括(a)用于表征目标多核苷酸的分析设备，和(b) xro解旋酶。
【文档编号】C12Q1/68GK104136631SQ201280068306
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2011年12月29日
【发明者】露丝·莫伊西, 安德鲁·约翰·赫伦, 绍博尔奇·苏罗尔斯 申请人:牛津纳米孔技术公司