用于室温原位检测生物样品中的目标核酸的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测生物样品中的目标核酸的原位杂交方法，包括在室温下进行一个或多个方法步骤(例如，预处理、变性、杂交、洗涤)。本发明进一步涉及用于进行这种方法的试剂盒。
【专利说明】用于室温原位检测生物样品中的目标核酸的方法和试剂盒
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2011年12月12日提交的美国临时申请号61/569, 656的权益。
[0003] 上述申请的全部教导通过引用并入本文中。
【背景技术】
[0004] 20多年来，荧光原位杂交（FISH)已用作检测人类染色体上DNA序列的分子技术 (Bauman 1985 ;Pinkel 1986)。在过去的二十年，FISH技术各个方面的改进已促进人类细 胞遗传学和分子诊断领域，使得能够鉴定与实性肿瘤和造血系统恶性肿瘤有关的染色体 异常以及诊断感染性疾病。（Heim 和 Mitelman 1995 ;Klinger 1995 ;Timm，Podniesinski 等· 1995 ;Heselmeyer, Macville 等· 1997 ;Sauer, Wiedswang 等· 2003) ·
[0005] 当前的FISH程序是劳动密集型和费时的，要求多个手动处理步骤和遵守精确的 温度和时间要求。标准FISH技术通常要求十多个处理玻片样品的步骤，其中几个步骤在不 同温度下进行，需要使用许多通常昂贵的温度设备如水浴器、加热板和孵育箱。这些及其它 技术上的限制妨碍其在研究和临床实验室中更广泛地使用。
[0006] 目前，需要要求更少处理步骤、更少时间和更少设备的进行FISH的更简化且成本 有效的方法。
[0007] 发明概述
[0008] 在一个实施方式中，本发明涉及用于检测生物样品中的目标核酸的方法，包括步 骤：在约19摄氏度至约25摄氏度的温度下用包含蛋白酶的溶液预处理包含目标核酸的生 物样品；使所述样品变性；使至少一个探针与所述样品中的目标核酸杂交，其中所述探针 包含与所述目标核酸中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测标记；和 检测与所述目标核酸杂交后的寡核苷酸探针上的至少一个可检测标记，由此检测所述样品 中的目标核酸。
[0009] 在另一实施方式中，本发明涉及用于检测生物样品中的目标核酸的方法，包括步 骤：在约19摄氏度至约25摄氏度的温度下，使至少一个探针与所述样品中的目标核酸杂 交，其中所述探针存在于包含约Ι-lOmM碱且pH为约10至约13的杂交缓冲液中，并且包含 与所述目标核酸中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测标记；和检测 与所述样品中的目标核酸杂交后的探针上的至少一个可检测标记，由此检测所述样品中的 目标核酸。
[0010] 在另一实施方式中，本发明涉及用于检测生物样品中的目标核酸的方法，包括步 骤：使包含目标核酸的生物样品变性；使至少一个探针与所述样品中的目标核酸杂交，其 中所述探针包含与所述目标核酸中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可 检测标记；在约19摄氏度至约25摄氏度的温度下，在pH为约10至约13的洗涤缓冲液中 洗涤所述样品，所述洗涤缓冲液包含约Ι-lOmM的碱和最终浓度为约0. 03M至约0. 09M的一 种或多种盐；和检测已与所述样品中的目标核酸杂交的探针上的至少一个可检测标记，由 此检测所述样品中的目标核酸。 toon] 在另一实施方式中，本发明涉及用于检测生物样品中的目标核酸的方法，包括步 骤：通过将所述样品与包含碱和约50%至约80%醇的溶液接触，使包含目标核酸的生物 样品变性；使至少一个探针与所述样品中的目标核酸杂交，其中所述探针存在于包含约 Ι-lOmM的碱且pH为约10至约13的杂交缓冲液中，并且包含与所述目标核酸中的核苷酸 序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测标记；在pH为约10至约13的洗涤缓冲液 中洗涤所述样品，所述洗涤缓冲液包含约Ι-lOmM的碱和最终浓度为约0. 03M至约0. 09M的 一种或多种盐；和检测已与所述样品中的目标核酸杂交的探针上的至少一个可检测标记， 由此检测所述样品中的目标核酸，其中步骤a)、b)和c)的每一步均在约19摄氏度至约25 摄氏度的温度下进行。
[0012] 在另一个实施方式中，本发明涉及用于测定生物样品中是否存在目标核酸的方 法，包括步骤：
[0013] 使包含目标核酸的生物样品变性；用所述样品孵育至少一个探针，其中所述探针 包含与所述目标核酸中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测标记；在 洗涤缓冲液中洗涤所述样品；和通过检测一个或多个已与所述样品中的目标核酸杂交的探 针来测定所述样品中是否存在所述目标核酸，其中步骤a)、b)和c)的至少一步在约19摄 氏度至约25摄氏度的温度下进行。
[0014] 本文描述的所述方法中的任何步骤均可有效地在室温下进行。因此，在室温下进 行全部方法步骤避免了对昂贵温度设备和遵守精确且可变的温度要求的需求。与标准的升 温FISH技术相比，这种方法要求更少的步骤和更少的时间来完成。
[0015] 附图简要说明
[0016] 本专利或申请文件包含至少一个以彩色制作的图。将按要求通过办事处提供具有 彩色附图的本专利或专利申请公开的副本和支付必要的费用。
[0017] 图1为描述在使用常规变性条件（蓝色）或室温变性条件（灰色）的FISH后，由 标记的Y和X染色体寡核苷酸探针所产生的信噪比（SNR)的对比的图。
[0018] 图2为示出使用室温变性和杂交步骤以及标准洗涤条件的FISH后， Oligo HSmii X(红色）和Y染色体（绿色）（箭头）探针所产生的信号的来自外周血 液的中期染色体涂片和间期核的图像。
[0019] 图3为描述未处理的外周血细胞上的室温（Iso Hyb(3. OmM NaOH缓冲液））或 37°C (对照）下杂交后的染色体3 (金色）、染色体6 (浅绿色）、染色体7 (绿色）和染色体 20(红色）探针的信噪比的图。
[0020] 图4为描述膀胱上皮细胞上的室温（Iso Hyb (3. OmM NaOH缓冲液））或37°C (对 照）下杂交后的染色体3 (金色）、染色体6 (浅绿色）、染色体7 (绿色）和染色体20 (红 色）探针的信噪比的图。
[0021] 图5为根据本文实施例5中描述的FISH方案已用由BAC制备的单一序列染色体 13探针在室温下杂交的外周血液玻片的图像。
[0022] 发明详述
[0023] 定义
[0024] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通 技术人员通常理解的相同的含义。
[0025] 如本文所使用，术语〃室温〃和〃RT〃是指约19摄氏度至约25摄氏度的温度。
[0026] 如本文所使用，〃室温方法〃或〃室温程序〃（例如，〃室温FISH")是指在标准的 现有技术原位检测方法中通常在高温（例如，大于25摄氏度的温度）下进行的至少一个方 法步骤（例如，变性、杂交、杂交后洗涤）在约19摄氏度至约25摄氏度的范围内进行的方 法。在本文中描述的室温方法中，优选至少两个、更优选至少三个、甚至更优选所有这种方 法步骤在约19摄氏度至约25摄氏度的范围内进行。如果"室温方法"中的两个或更多个 步骤在室温下进行，则那些步骤中每一个进行的温度不需要相同，只要所述温度在约19摄 氏度至约25摄氏度的范围内。
[0027] 术语"核苷酸"是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体，以及非天然 存在的其衍生物和类似物。因此，核苷酸可包括，例如，包含天然存在的碱基（例如，A、G、C 或T)的核苷酸和包含修饰的碱基（例如，7_去氮杂鸟苷（7-deazaguanosine)或肌苷）的 核苷酸。
[0028] 关于核酸的术语〃序列〃是指通过共价键（例如磷酸二酯键）连接的连续系列的 核苷酸。
[0029] 术语"核酸"是指具有多个核苷酸单体的聚合物。核酸可以是单链或双链的，可以 是DNA(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA或杂化聚合物（例如，DNA/RNA)。核酸可以是化学 或生物化学修饰的和/或可包含非天然的或衍生的核苷酸碱基。核酸修饰包括，例如，甲基 化，用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰如不带电的连接（例如，膦 酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等）、带电的连接（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯等）、悬挂部分（例如，多肽）、嵌入剂（例如，吖啶、补骨脂素等）、螯合剂、烷基化剂和 修饰的连接（例如，α异头核酸等）。核酸还包括在其通过氢键键合和其它化学相互作用 结合至指定序列的能力上模拟核酸的合成分子。通常，核苷酸单体通过磷酸二酯键连接，尽 管核酸的合成形式可包含其它连接（例如，肽核酸（本文中也称为"ΡΝΑ")，如Nielsen等， Science 254,1497-1500,1991中所描述）。核酸还可以包括，例如，构象限制的核酸（例如， 〃锁核酸〃或〃LNA〃，如 Nielsen 等，J. Biomol. Struct. Dyn. 17:175-91，1999 中所描述）、吗 啉代、乙二醇核酸（GNA)和苏糖核酸（TNA)。〃核酸〃不限于任何特定长度的聚合物，因此 基本上可以是任何长度，通常约6个核苷酸至约109个核苷酸或更长。在双链聚合物情况 下，"核酸〃可以指任一条或两条链。
[0030] 术语〃寡核苷酸〃是指通过共价键如磷键（例如，磷酸二酯、膦酸烷基和芳基酯、 硫代磷酸酯、磷酸三酯）和/或非磷键（例如，肽、氨基磺酸酯等）连接的长度通常为约6 至100个核苷酸碱基的短核酸。
[0031] 如本文所使用，术语〃基因组片段〃是指从基因组DNA制备的片段，包括但不限 于，克隆的基因组片段和扩增的基因组片段（例如，通过PCR扩增制备的基因组片段）。
[0032] 术语〃目标核酸〃是指期望检测其是否存在于样品中的核酸。
[0033] 术语〃目标序列〃是指能够与寡核苷酸探针上的互补序列（例如，基本上互补的 序列）形成氢键键合的双链体（duplex)的目标核酸中的核苷酸序列。
[0034] 如本文所使用，〃互补的〃是指两个不同的核酸链之间或相同核酸链的两个区域 之间的序列互补性。如果当以反平行方式排列两个区域时，第一区域的至少一个核苷酸残 基能够与第二区域的残基碱基配对（即，氢键键合），从而形成氢键键合的双链体，则核酸 的第一区域与相同或不同的核酸的第二区域是互补的。
[0035] 术语〃基本上互补的〃是指能够在严格的杂交条件下彼此碱基配对以形成稳定 的氢键键合的双链体的两个核酸链（例如，目标核酸链和互补的单链寡核苷酸探针），所述 严格的杂交条件包括本文中描述的室温杂交条件。通常，"基本上互补的"是指具有至少 70%、例如约 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%互补性的两个核酸。
[0036] 〃重复序列〃或〃重复的序列〃是指人类基因组中非编码的串联重复的核 苷酸序列，其包括，例如，来自α随体、随体1、随体2、随体3、β随体、γ随体和端粒 的重复序列。重复序列是本领域已知的，例如在（Allshire等，Nucleic Acids Res 17(12):4611-27(1989) ;Cho 等，Nucleic Acids Res 19(6):1179-82(1991) ;Fowler 等， Nucleic Acids Res 15(9):3929(1987) ;Haaf 等，Cell 70(4):681-96(1992) ;Lee 等， Chromosoma 109(6):381-9(2000) ;Maeda和Smithies,Annu Rev Genet 20:81-108(1986); Meyne 和 Goodwin, Chromosoma 103 (2):99-103 (1994) ;Miklos(1985) .Localized highly repetitive DNA sequences in vertebrate genomes. Molecular evolutionary genetics. I. J. R. Macintyre. NY, Plenum Publishing Corp. : 241-321 (1985) ;Tagarro 等， Hum Genet 93(2):125-8(1994) ;Waye 和 Willard，PNAS USA 86(16):6250-4(1989);以及 Willard和Waye，J Mol Evol25(3) :207-14(1987)中描述。重复序列位于例如染色体的 着丝粒区域、近着丝粒（pericentromeric)区域、异染色质区域和端粒区域。一致性重复 序列在例如 Willard 和 Waye，J Mol Evol 25(3):207-14(1987) ;Tagarro 等，Hum Genet 93(2):125-8(1994) ;Vissel 和 Choo, Nucleic Acids Res. 15(16):6751-6752(1987) ;Cho 等，Nucleic Acids Res 19(6):1179-82(1991)中描述。
[0037] 如本文所使用，术语〃染色体特异性核酸序列〃或〃染色体特异性核苷酸序列〃 是指对细胞基因组内的特定染色体特异性的核酸序列。
[0038] 术语〃探针〃是指包括与目标核酸中的目标序列基本上互补的目标结合区域因而 能够与目标核酸形成氢键键合的双链体的寡核苷酸。通常，所述探针为单链探针，具有一个 或多个可检测标记以允许在与其互补目标杂交后检测所述探针。
[0039] 如本文所使用，〃目标结合区域〃是指能够与互补目标核酸形成氢键键合的双链 体的寡核苷酸探针的一部分。
[0040] 如本文所使用，术语"可检测标记"是指表示其结合的相应分子（例如，探针）存 在的部分。
[0041] 〃间接标记〃是指使用特异性结合所述间接标记的标记的二级试剂或结合配体的 配偶体检测的部分或配体。
[0042] 〃直接标记〃是指不存在结合配体的配偶体的相互作用的情况下可检测的部分。 [0043] 术语〃生物样品〃是指生物来源（例如，细胞、组织、器官、流体）的材料。
[0044] 在两个分子（无论是单体还是聚合分子）的连接的上下文中的〃接头〃表示插入 在所连接的两个分子之间且与它们相邻的分子（无论是单体还是聚合分子）。"接头"可 用于连接例如寡核苷酸探针序列和标记（例如，可检测标记）。所述接头可以是核苷酸接头 (即，在非相邻的序列之间且与它们相邻的核酸序列）或非核苷酸接头。
[0045] 术语〃杂合体（hybrid) 〃是指通过互补的核苷酸之间的氢键键合而形成的双链核 酸分子。
[0046] 术语〃严格性〃是指影响杂合体的稳定性的杂交条件，例如温度、盐浓度、pH、甲酰 胺浓度等。凭经验优化这些条件以使探针与目标核酸的特异性结合最大化，并使探针与目 标核酸的非特异性结合最小化。
[0047] 术语〃荧光团〃是指具有荧光性的化学基团。
[0048] 术语〃任选〃表示可包括或不包括所列举的步骤（例如，在本发明的方法的情况 下）或组分（例如，在本发明的试剂盒的情况下）。
[0049] 本发明部分基于发现了简化且有效的替代性荧光原位杂交（FISH)技术（在本文 中称为"室温FISH")，其中样品变性、探针杂交、洗涤或它们的任何组合可在室温下进行。 传统FISH方法与本发明的两种不同的室温FISH方法之间的对比显示于表1中。列出了完 成所述方法所需的不同步骤，以及要求的温度、装置和与寡核苷酸探针一起使用所需的时 间。本发明的室温方法避免了对传统FISH方法通常要求的昂贵的精确温度设备（例如，水 浴器、加热板、孵育箱、冷冻装置）的需要。
[0050] 表1.传统FISH与室温FISH方法的对比
[0051]
【权利要求】
1. 一种检测生物样品中的目标核酸的方法，包括步骤： a) 在约19摄氏度至约25摄氏度的温度下用包含蛋白酶的溶液预处理包含所述目标核 酸的生物样品； b) 使所述样品变性； c) 使至少一个探针与所述样品中的目标核酸杂交，其中所述探针包含与所述目标核酸 中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测标记； d) 洗涤所述样品，以去除未与所述目标核酸杂交的探针；和 e) 检测与所述目标核酸杂交后的寡核苷酸探针上的所述至少一个可检测标记，由此检 测所述样品中的目标核酸。
2. 权利要求1所述的方法，其中a)中的所述溶液包含约0. 1%至约0. 3%的胃蛋白酶。
3. 权利要求1或2所述的方法，其中a)中的所述溶液具有酸性pH。
4. 权利要求3所述的方法，其中a)中的所述溶液包含0. 01N HC1。
5. 权利要求1、2或3所述的方法，其中使所述样品与a)中的所述溶液接触约5至约 20分钟。
6. 权利要求5所述的方法，其中使所述样品与a)中的所述溶液接触约15分钟。
7. 权利要求1-6任一项所述的方法，其中步骤b)-d)的一个或多个在约19摄氏度至约 25摄氏度的温度下进行。
8. 权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述探针为包含约20至约50个核苷酸的单 链寡核苷酸探针。
9. 权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述探针由基因组片段制备。
10. 权利要求1-9所述的方法，其中所述生物样品包含上皮细胞、皮肤细胞、骨髓细胞、 分裂球、精细胞、卵母细胞或极体，或它们的组合。
11. 一种检测生物样品中的目标核酸的方法，包括步骤： a) 在约19摄氏度至约25摄氏度的温度下，使至少一个探针与所述样品中的目标核酸 杂交，其中所述探针： 1) 存在于包含约Ι-lOmM碱且pH为约10至约13的杂交缓冲液中，和 2) 包含与所述目标核酸中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测 标记； b) 洗涤所述样品，以去除未与所述目标核酸杂交的探针；和 c) 检测与所述样品中的目标核酸杂交后的所述探针上的所述至少一个可检测标记，由 此检测所述样品中的目标核酸。
12. 权利要求11所述的方法，其中所述杂交缓冲液的pH为约11至约12。
13. 权利要求11或12所述的方法，其中所述杂交缓冲液包含约l-5mM碱、约20-60% 甲酰胺和约5-40%硫酸葡聚糖。
14. 权利要求11、12或13所述的方法，其中所述碱为NaOH。
15. 权利要求14所述的方法，其中所述杂交缓冲液包含约1.0-3. OmM NaOH、约30-50% 甲酰胺和约10%硫酸葡聚糖。
16. 权利要求14所述的方法，其中所述杂交缓冲液包含约4. 2mM NaOH、约42%甲酰胺 和约28 %硫酸葡聚糖。
17. 权利要求11-16任一项所述的方法，其中步骤a)的持续时间为约5分钟至约15分 钟。
18. 权利要求11-17任一项所述的方法，其中所述探针为包含约20至约50个核苷酸的 单链寡核苷酸探针。
19. 权利要求11-17任一项所述的方法，其中所述探针由基因组片段制备。
20. 权利要求11-19任一项所述的方法，其中所述生物样品包含上皮细胞、皮肤细胞、 骨髓细胞、分裂球、精细胞、卵母细胞或极体，或它们的组合。
21. 权利要求11-20任一项所述的方法，其中步骤b)在约19摄氏度至约25摄氏度的 温度下进行。
22. -种检测生物样品中的目标核酸的方法，包括步骤： a) 使包含所述目标核酸的生物样品变性； b) 使至少一个探针与所述样品中的目标核酸杂交，其中所述探针包含与所述目标核酸 中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测标记； c) 在约19摄氏度至约25摄氏度的温度下，在pH为约10至约13的洗涤缓冲液中洗涤 所述样品，所述洗漆缓冲液包含约Ι-lOmM的碱；和 d) 检测已与所述样品中的目标核酸杂交的探针上的所述至少一个可检测标记，由此检 测所述样品中的目标核酸。
23. 权利要求22所述的方法，其中所述洗涤缓冲液的pH为约11。
24. 权利要求22或23所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含约l-3mM碱和约2 X SSC。
25. 权利要求22、23或24所述的方法，其中所述碱为NaOH。
26. 权利要求22-25任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含约1. 75至2mM NaOH 和约2XSSC。
27. 权利要求22-26任一项所述的方法，其中步骤c)包含一次或多次洗涤，并且每次洗 涤的持续时间为约2分钟至约5分钟。
28. 权利要求22-27任一项所述的方法，其中所述探针为包含约20至约50个核苷酸的 单链寡核苷酸探针。
29. 权利要求22-27任一项所述的方法，其中所述探针由基因组片段制备。
30. 权利要求21-29所述的方法，其中所述生物样品包含上皮细胞、皮肤细胞、骨髓细 胞、分裂球、精细胞、卵母细胞或极体，或它们的组合。
31. 权利要求21-30任一项所述的方法，其中步骤a)和b)的一个或多个在约19摄氏 度至约25摄氏度的温度下进行。
32. -种检测生物样品中的目标核酸的方法，包括步骤： a) 通过用包含碱和约50 %至约80%的醇的溶液接触所述样品，使包含所述目标核酸 的生物样品变性； b) 使至少一个探针与所述样品中的目标核酸杂交，其中所述探针： 1) 存在于包含约Ι-lOmM碱且pH为约10至约13的杂交缓冲液中，和 2) 包含与所述目标核酸中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测 标记； c) 在pH为约10至约13的洗涤缓冲液中洗涤所述样品，所述洗涤缓冲液包含约 1-lOmM ;和 d)检测已与所述样品中的目标核酸杂交的探针上的所述至少一个可检测标记，由此检 测所述样品中的目标核酸， 其中，步骤a)、b)和c)中的每一个均在约19摄氏度至约25摄氏度的温度下进行。
33. -种测定生物样品中是否存在目标核酸的方法，包括步骤： a) 使包含所述目标核酸的生物样品变性； b) 用所述样品孵育至少一个探针，其中所述探针包含与所述目标核酸中的核苷酸序列 基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测标记； c) 在洗涤缓冲液中洗涤所述样品；和 d) 通过检测已与所述样品中的目标核酸杂交的一个或多个探针，测定所述样品中是否 存在所述目标核酸， 其中，步骤a)、b)和c)中至少一个在约19摄氏度至约25摄氏度的温度下进行。
34. 权利要求33所述的方法，其中步骤a)、b)和c)各自在约19摄氏度至约25摄氏 度的温度下进行。
35. -种用于检测生物样品中的目标核酸的试剂盒，其包括： a) 包含约0. 03M至约0. 17M碱和约50%至约80%的醇的变性缓冲液； b) 包含约Ι-lOmM碱且pH为约10至约13的杂交缓冲液；和 c) 包含约Ι-lOmM碱的洗涤缓冲液，其中所述洗涤缓冲液的pH为约10至约13。
36. 权利要求35所述的试剂盒，进一步包含用于预处理所述样品的一种或多种蛋白 酶。
37. 权利要求36所述的试剂盒，其中所述一种或多种蛋白酶包括胃蛋白酶。
38. 权利要求35、36或37所述的试剂盒，进一步包含至少一个包含与所述目标核酸中 的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列和至少一个可检测标记的探针。
39. 权利要求35-38任一项所述的试剂盒，其中所述变性缓冲液包括约0. 07M氢氧化钠 和约70%乙醇。
40. 权利要求35-39任一项所述的试剂盒，其中所述杂交缓冲液包含约l-5mM碱、约 20-60%甲酰胺和约5-40%硫酸葡聚糖。
41. 权利要求35-40任一项所述的试剂盒，其中所述洗涤缓冲液包括约1. 75至2mM NaOH。
42. 权利要求41所述的试剂盒，其中所述洗涤缓冲液进一步包含约2 XSSC。
【文档编号】C12Q1/68GK104145027SQ201280069016
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2012年12月12日 优先权日:2011年12月12日
【发明者】J·奥里驰-科斯塔 申请人:塞雷公司