来自人类脐带组织衍生的细胞的诱导性多能干细胞的制作方法
【专利摘要】我们已公开诱导性多能干细胞和由人类脐带组织衍生的细胞制备诱导性多能干细胞的方法。更具体地，我们已公开可分化成外胚层、中胚层和内胚层谱系的细胞的人类脐带组织衍生的iPS细胞。
【专利说明】来自人类脐带组织衍生的细胞的诱导性多能干细胞
【技术领域】
[0001]本发明涉及诱导性多能干细胞。更具体地，本发明涉及将人类脐带组织衍生的细胞(hUTC)重编程为诱导性多能干(iPS)细胞。
【背景技术】
[0002]诱导性多能干(iPS)细胞已产生在再生医学中应用的兴趣，因为它们允许在体外生成具有用于细胞治疗的潜在价值的患者特异性祖细胞(Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell《细胞》126,663-76(2006))。然而，在许多情况下，现成的方法将是期望的，诸如用于急性病症的细胞治疗，或当患者的体细胞由于慢性疾病或衰老而改变时。
[0003]使用整合病毒方法的多能性因子和癌基因的异位表达足以在小鼠和人类的成纤维细胞两者中诱导多能性(Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell《细胞》126，663-76 (2006)；Takahashi, K.等人 Cell《细胞》131，861-72 (2007) ；Hochedlinger, K.和 Plath, K.，Development《发育》136, 509-23 (2009) ；Lowry, ff.E.等人，Proc NatlAcad Sci USA《美国国家科学院院刊》105,2883-8(2008))。然而，该过程是缓慢无效的，并且载体永久整合到基因组内限制iPS细胞用于治疗应用的用途(Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell《细胞》126,663-76(2006))。进一步的研究已显示年龄、起源和使用的细胞类型对重编程效率具有深刻的影响。近来，已显示在与成纤维细胞进行比较时，人类角质形成细胞的逆转录病毒转导导致100倍更有效的和两倍快速的重编程为多能性。假设这些差异可起因于KLF4和c-MYC在起始角质形成细胞群中的内源表达和/或更顺应重编程的呈现后生状态的一群未分化的祖细胞的存在(Lowry，W.E.等人，Proc NatlAcad Sci USA《美国国家科学院院刊》105,2883-8(2008).)。后面的假设还已得到对小鼠的其他研究的支持。(Silva, J.等人，PLoS B1l《植物实验室-生物学》6，e253(2008) jPEminli，S.等人，Stem Cells《干细胞》26,2467-74(2008))。然而，干细胞通常是罕见的并且难以接近的并且大量分离的(例如神经干细胞)(Kim, J.B.等人，Cell《细胞》136，411-9 (2009) ；Kim, J.B.等人，Nature《自然》454，646-50 (2008))。
[0004]人类脐带组织衍生的iPS细胞代表用于许多应用的多能细胞的可行供应。它对再生医学特别感兴趣，因为脐带组织来自早期发育起源，并且已显示具有多谱系分化潜能。另外，当与青少年或成人供体细胞诸如皮肤成纤维细胞或角质形成细胞相比较时，脐带组织可能免于掺入的突变。
【发明内容】
[0005]我们在本文中描述了通过使人类脐带组织衍生的细胞重编程制备的诱导性多能干细胞。人类脐带组织衍生的细胞是从基本上不含血液的人类脐带组织中分离的经分离的脐带组织细胞，所述脐带组织细胞能够在培养中自我更新和扩增，具有分化成其他表型的细胞的潜能，可在培养中经历至少40次的倍增，在传代时保持正常核型，并且具有下述特征:表达 CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr- a、PD-L2 和 HLA-A, B、C 中的每一种；不表达 CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CDl 17、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G 或 HLA-DR, DP、DQ 中的任一种；以及相对于成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人类细胞的表达，对于白细胞介素8、浆膜蛋白I和趋化因子(C-X-C基序)配体3中的每一种的增加的基因表达。人类脐带组织衍生的细胞还具有下述特征:分泌因子MCP-1、MIPl β、IL-6、IL_8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、RANTES 和 --ΜΡ1 中的每一种；并且不分泌因子 SDF-1 α、TGF- β 2、ANG2、PDGFbb、MIPla 和 VEGF 中的任一种。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1.利用人类的0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC以及针对p53的shRNA的hUTC转导获得人类脐带组织衍生的iPS细胞、克隆Kl的形态。克隆显示于在第I代的被照射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上。
[0007]图2.在MEF饲养层上生长且对碱性磷酸酶进行染色的人类脐带组织衍生的iPS细胞(克隆κι) (4x放大率)。
【具体实施方式】
[0008]我们在本文中公开了通过四种(OSKM)转录因子的逆转录病毒转导连同或不连同P53的下调，将人类脐带组织衍生的细胞(hUTC)重编程为多能性。使用本文描述的方法和组合物，hUTC通过利用0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的逆转录病毒转导而重编程为多能性。所得的重编程的hUTC具有诱导性多能干(iPS)细胞的特征。
[0009]在一个实施例中，由人类脐带组织衍生的细胞制备的诱导性多能干(iPS)细胞，在本文中称为人类脐带组织衍生的iPS细胞。hUTC通过在针对p53的shRNA存在或不存在的情况下重编程因子的被迫表达而重编程。重编程的细胞在形态、碱性磷酸酶的染色、多能性标记的表达、特定启动子的甲基化和特定胚层标记的表达方面被表征。
[0010]hUTC是从人类脐带组织中分离的独特细胞群。用于分离hUTC的方法在全文以引用方式并入本文的美国专利号7，510，873中有所描述。简而言之，该方法包括(a)获得人类脐带组织；(b)去除基本上所有血液，以收获基本上不含血液的脐带组织，(c)通过机械处理或酶促处理或两者来解离组织，(d)使组织重悬浮于培养基中，以及(e)提供允许人类脐带组织衍生的细胞生长的生长条件，所述人类脐带组织衍生的细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化成其他表型的细胞的潜能。
[0011]在优选的实施例中，细胞不表达端粒酶(hTert)。因此，一个实施例是不表达端粒酶(hTert)并且具有一种或多种本文公开的特征的人类脐带组织衍生的细胞。
[0012]在一个实施例中，细胞是脐带组织衍生的细胞，其从基本上不含血液的人类脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化成其他表型的细胞的潜能，可经历至少40次的倍增，并且具有下述特征:(a)表达⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr- α、PD-L2 和 HLA-A、B、C 中的每一种；(b)不表达 CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD 117、CD141、CD 178、B7-H2、HLA-G或HLA-DR、DP、DQ中的任一种；以及(c)相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人类细胞的表达，白细胞介素8、浆膜蛋白I和趋化因子受体配体(C-X-C基序)配体3的增加的表达。在一个实施例中，这些脐带衍生的细胞还具有下述特征中的一种或多种:(a)分泌因子 MCP-1、MIPl β、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TP0、RANTES和--MP1 中的每一种；以及(b)不分泌因子 SDF-1 a、TGF_3 2、ANG2、H)GFbb、MIPla和VEGF中的任一种。在另一个实施例中，这些脐带组织衍生的细胞不表达hTERT或端粒酶。
[0013]在另一个实施例中，细胞是脐带组织衍生的细胞，其从基本上不含血液的人类脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化成其他表型的细胞的潜能，不表达⑶117且表达端粒酶或hTert。在另外一个实施例中，细胞还不表达⑶45。在替代实施例中，细胞还不表达 CD31、CD34、CD80、CD86、CD 141、CD 178、B7-H2、HLA-G 或 HLA-DR、DP、DQ 中的任一种。在另一个替代实施例中，细胞还表达⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr- α、PD-L2和HLA-A、B、C中的每一种。在本发明的另外一个实施例中，细胞还可经历至少40次的倍增。在另外一个实施例中，相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人类细胞的表达，细胞还显示白细胞介素-8 ;浆膜蛋白I ;和趋化因子受体配体(C-X-C基序)配体3的增加的表达。在另外一个实施例中，细胞还具有下述特征中的每一种:(a)分泌因子 MCP-1、MIPl β、IL-6、IL-8, GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF, BDNF, TPO, RANTES 和 --ΜΡ1中的每一种，以及(b)不分泌因子SDF-1 α TGF-β 2、ANG2、PDGFbb、MIPla和VEGF中的任一种。
[0014]hUTC使用病毒重编程方法进行重编程。在一个实施例中，hUTC利用单个地携带组成性表达的人类转录因子0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的逆转录病毒进行转柒。简而言之，将hUTC在hFib培养基中以I X 15细胞/孔在6孔板上铺平板，并且在5% CO2和37°C下温育6小时。将四种鼠逆转录病毒构建体(0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC)和用于增加转柒效率的试剂加入到每个孔中。在5% CO2和37°C下过夜温育后，重复该转导步骤。在24小时后，抽吸培养基并加入新鲜的hFib培养基。在另外48小时后，将细胞收集并在hFib培养基中在预种植有小鼠胚胎饲养(MEF)细胞的60mm的皿上铺平板。在48小时后，将培养基用hES培养基替换。允许细胞温育三至四周，同时每天替换hES培养基。
[0015]在另一个实施例中，hUTC用单个地携带组成性表达的人类转录因子0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC以及p53-shRNA的VSVg鼠逆转录病毒进行转柒。p53的抑制先前已显示假定通过减慢细胞增殖来增强特定细胞类型的重编程效率(Zhao Y等人，(2008)Cell StemCell《细胞-干细胞》3 =475-479 ；Sarig, R.等人，J.Exp.Med.《实验医学杂志》207:2127-2140 (2010))。简而言之，将hUTC在Hayflick培养基中以I X 15细胞/孔在6孔板中铺平板，并且在5% CO2和37°C下过夜温育。对于病毒转染，制备具有四种VSVg鼠逆转录病毒构建体(0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC)和p53_shRNA以及增加转染效率的试剂的转导培养基用于每个孔。从孔中抽吸培养基，加入转导培养基，并在5% CO2和37°C下过夜温育。第二天重复该转导步骤，并且在过夜温育后，将转导培养基用Hayflick培养基替换。允许细胞温育另外四天，同时每两天替换Hayflick培养基。
[0016]随后将经转染的hUTC进行培养并观察典型iPS细胞形态的出现。典型iPS细胞形态指紧密填充的细胞集落的形成，所述细胞集落在光学显微镜下是折光的或“有光泽的”，具有非常尖锐且界限清楚的边缘。将表现出典型iPS细胞形态的细胞分离，传代培养并扩增，以提供人类脐带组织衍生的iPS细胞。
[0017]若干标准用于评估iPS细胞是否是完全重编程的，包括形态(如上所述)、碱性磷酸酶的染色、多能性标记的表达、特定启动子的甲基化和特定胚层标记的表达。关键的多能性因子NANOG和胚胎干细胞特异性表面抗原(SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81)的表达已常规地用于鉴定完全重编程的人类细胞。在功能性水平上，iPS细胞也展示出分化成来自所有三个胚胎胚层的谱系的能力。
[0018]通过本文描述的方法制备的人类脐带组织衍生的iPS细胞在多能性方面被表征。显示出典型iPS细胞形态的这些细胞能够自我更新，表达关键的多能性标记(TRA1-60、TRA1-81、SSEA3、SSEA4和NAN0G)，展示出分化成来自三个胚层的谱系，并且显示正常核型。
[0019]人类脐带组织衍生的iPS细胞代表用于再生医学的多能细胞的良好来源。利用这种技术，目前能够生成大量的多能细胞。另一个重要的有益效果是由源于早期发育起源的组织和由相对于成人供体细胞可能不含掺入的突变的组织获得iPS细胞。这些细胞可用于在源自多重组织的iPS细胞中，关于后生重编程的程度、分化能力、所得的谱系的稳定性和相关异常的危险的比较。
[0020]本发明将在以下说明书中参照附图图解以本发明的非限制性实例、各种实施例的方式得到进一步的解释。
[0021]SM
[0022]实例1.将hUTC重编稈为iPS细朐
[0023]根据美国专利号7，510，873中所述的方法获得的hUTC利用单个地携带组成性表达的人类转录因子(0 CT4、S0X2、KLF4和c-MYC)的鼠逆转录病毒进行转导。
[0024]将hUTC解冻且在转导前培养一代。在第I天时，使hUTC胰蛋白酶化，并在2毫升hFib培养基(DMEM(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英潍捷基公司(InvitrogenCorporat1n, Carlsbad, CA),目录号 11965-092))中以 I X 15 细胞 / 孔在 6 孔板上铺平板，所述hFib培养基含有以商品名BENCHMARK销售的10%胎牛血清(FBS)(美国加利福尼亚州西萨克拉门托的双子座生物制品公司(Gemini B1-products, West Sacramento, CA),目录号100-106，体积/体积)、2毫摩尔以商品名GLUTAMAX销售的L-谷氨酰胺(英潍捷基公司(Invitrogen Corporat1n),目录号35050-061) >50单位/毫升青霉素和50毫克/毫升链霉素(英潍捷基公司(Invitrogen Corporat1n),目录号15140-122) /孔。使细胞在5% CO2和37°C下温育6小时。抽吸培养基以去除非活细胞，并且加入2毫升新鲜的hFib培养基。将单个地携带0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的逆转录病毒(各自具有5的Μ0Ι)和10微升(200x)以商品名TRANSDUX销售的感染试剂(美国加利福尼亚州山景城的美国SBI公司(System B1sCiences, Inc.，Mountain View, CA),目录号 LV850A-1)加入到每个孔内，并通过旋转所述板逐渐混合。在第2天时，重复病毒转导步骤。在第3天时，去除转导培养基，洗涤细胞并将培养基用2毫升hFib培养基替换。在同一天，将I X 15丝裂霉素C处理的MEF细胞种植到60-毫米的皿(预涂有0.1 %明胶(美国马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore Corporat1n, Billerica,MA),目录号 ES-006-B,重量 / 体积)上，并且在5% CO2和37°C下过夜温育。
[0025]为了监控重编程或iPS细胞集落的形成，通过在第4天时受胰蛋白酶作用收获经转导的hUTC，重悬浮于hES培养基(DMEM/F12，英潍捷基公司，目录号11330-32)中，所述hES培养基含有20% knockout血清(KSR，英潍捷基公司，目录号10828-028，体积/体积)、10纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子(bFGF ;美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物科技公司(R&D Systems, Inc.，Minneapolis，MN)，目录号 233-FB-025)、I 毫摩尔 GLUTAMAX、0.1毫摩尔非必需氨基酸(英潍捷基公司，目录号11140-050)、0.1毫摩尔2-巯基乙醇(美国密苏里州圣路易的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO),目录号M7522)、50单位/毫升青霉素和50毫克/毫升链霉素(英潍捷基公司，目录号15140-122)，并且随后以IX 16细胞/60毫米的皿的浓度在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养平板上铺平板。细胞以3X 14至IX 15细胞的不同细胞密度铺平板。在第6天时，抽吸培养基并替换为hES培养基。每天将培养基更换为新鲜的hES培养基，共3至4周。每天检查平板，以鉴定iPS细胞集落。
[0026]对于在针对p53的shRNA的存在下的重编程，hUTC用逆转录病毒构建体进行转导，所述逆转录病毒构建体具体是单个地携带组成性表达的人类转录因子(0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC)的VSVg鼠逆转录病毒，和含有p53-shRNA的VSVg鼠逆转录病毒。
[0027]使用293_gp2逆转录病毒包装细胞产生鼠逆转录病毒，所述包装细胞在转染前一天以3 X 16细胞/皿的密度在6厘米的皿上铺平板，并且在5% CO2和37°C下过夜温育。根据制造商的标准方案，每个皿随后用3微克pMX载体(Sox2、0ct4、cMyc、Klf4或p53_shRNA载体，I微克VSV-g和16微升在商品名FUGENE HI下销售的转染试剂(美国印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏应用生物科学公司(Roche Applied B1science, Indianapolis, IN),目录号04709705001))进行转染。随后在转染后48小时收集病毒，并且在使用前通过0.45微米滤器进行过滤。
[0028]将hUTC解冻且在转导前培养一代。在转导前一天，使hUTC受胰蛋白酶作用，并且以I X 15细胞/孔在6孔板的2个孔上在2毫升肾上皮生长培养基(REGM，美国马里兰州沃克斯维尔的 Lonza Walkersville 公司(Lonza ffalkersville, Inc.，Walkersville, MD))/孔中铺平板。使细胞在5% CO2和37°C下过夜温育。在第I天时，制备2.5毫升转导培养基用于每个孔，所述转导培养基含有500微升每种新鲜制备的病毒和4纳克/毫升聚凝胺。从孔中抽吸培养基，加入转导培养基，并且在5% CO2和37°C下过夜温育。在第2天时，重复病毒转导步骤。在第3天时，去除转导培养基并替换为REGM。培养基更换每2天执行直至第7天时。
[0029]为了监控重编程的集落或iPS细胞集落的形成，通过胰蛋白酶化收获经转导的hUTC，重悬浮于补充有另外的20纳克/毫升bFGF以商品名STEMEDIUM NUTRISTEM销售的培养基(美国马萨诸塞州剑桥的Stemgent公司(Stemgent, Inc., Cambridge, MA),目录号01-0005) (iPS-Nu培养基)中，或具有20纳克/毫升bFGF的含标准knockout血清替代品(KSR)的人类ES培养基(iPS-KSR培养基)中，并且随后在以商品名MATRIGEL销售的涂布的基底膜基质(美国伊利诺州芝加哥的BD生物科学公司(BD B1sciences, Chicago, IL),目录号354277)上或在6孔板中以IX 14细胞/孔的浓度的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养平板上铺平板。在第一周期间每2天并且在第2至6周期间每天，将培养基用新鲜的iPS培养基更换。每天检查平板以鉴定iPS细胞集落。
[0030]表现出“典型”重编程的或iPS细胞形态的集落从MEF饲养平板手动地挑选，并且种植到12孔MEF饲养平板的单个孔上。每天更换培养基。在4-6天后，从12孔板中手动挑选集落且扩增到6孔板内。每天更换培养基，并且每4-6天以1: 3手动分开。使用以商品名CRY0STEM销售的冷冻培养基(Stemgent公司，目录号01-0013)将来自每个孔的细胞在各个阶段进行冷冻。
[0031]MS
[0032]利用表达四种重编程因子的逆转录病毒的hUTC重编程导致表现出iPS细胞形态的重编程的集落。手动挑选重编程的集落，并且将这些集落中的12个扩增并冷冻。使用四种重编程因子获得的人类脐带组织衍生的iPS细胞被指示为FF，随后为集落编号。
[0033]利用表达四种重编程因子和针对p53的shRNA的逆转录病毒的hUTC重编程导致表现出iPS细胞形态的重编程的集落。手动挑选二十五个重编程的集落，并且将这些集落中的19个扩增并冷冻。使用四种重编程因子和p53 ShRNA获得的人类脐带组织衍生的iPS细胞被指示为N (最初在含STEMEDIUMNUTRISTEM培养基中保持)，随后为集落编号，或被指示为K (最初在含KSR培养基中保持)，随后为集落编号(图1)。
[0034]实例2.多能性标记的表达
[0035]实例I中制备的人类脐带组织衍生的iPS细胞通过免疫细胞化学对其多能性标记的表达进行评估。在4%多聚甲醛中固定集落后，使用表1中所示的抗体试剂(所有抗体均购自Stemgent公司)执行对多能性标记的免疫突光染色。
[0036]表1.
[0037]
【权利要求】
1.一种包含重编程的人类脐带组织衍生的细胞的诱导性多能干细胞，其中所述人类脐带组织衍生的细胞是从基本上不含血液的人类脐带组织中分离的经分离的脐带组织细胞，所述脐带组织细胞能够在培养中自我更新和扩增，具有分化成其他表型的细胞的潜能，可在培养中经历至少40次的倍增，在传代时保持正常核型，并且具有下述特征:表达⑶10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr- a、PD-L2 和 HLA-A, B、C 中的每一种；不表达 CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CDl 17、CD141、CD178、Β7-Η2、HLA-G 或 HLA-DR、DP、DQ 中的任一种；以及相对于成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人类细胞的表达，对于白细胞介素8、浆膜蛋白I和趋化因子(C-X-C基序)配体3中的每一种的增加的基因表达。
2.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞，其中所述人类脐带组织衍生的细胞还具有下述特征:分泌因子 MCP-1、MIPI β、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、RANTES 和 --ΜΡ1 中的每一种；以及不分泌因子 SDF-1 a、TGF-β 2、ANG2、PDGFbb, MIPla 和VEGF中的任一种。
3.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞，其中所述诱导性多能干细胞表达TRA1-60、TRA1-81、SSEA3、SSEA4和 NANOG。
4.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞，其中所述诱导性多能干细胞对于碱性磷酸酶染色是阳性的。
5.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞，其中所述诱导性多能干细胞分化成外胚层、中胚层和内胚层谱系的细胞。
6.一种诱导性多能干细胞，所述诱导性多能干细胞由包括下述步骤的方法制备: 提供人类脐带组织衍生的细胞，其中所述人类脐带组织衍生的细胞是从基本上不含血液的人类脐带组织中分离的经分离的脐带组织细胞，所述脐带组织细胞能够在培养中自我更新和扩增，具有分化成其他表型的细胞的潜能，可在培养中经历至少40次的倍增，在传代时保持正常核型，并且具有下述特征:表达⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr- α、PD-L2 和 HLA-A、B、C 中的每一种；不表达 CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G或HLA-DR、DP、DQ中的任一种；以及相对于成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人类细胞的表达，对于白细胞介素8、浆膜蛋白I和趋化因子(C-X-C基序)配体3中的每一种的增加的基因表达； 利用单个地携带组成性表达的人类转录因子0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的鼠逆转录病毒来转染所述人类脐带组织衍生的细胞， 培养所述经转染的人类脐带组织衍生的细胞， 鉴定诱导性多能干细胞， 分离所述人类脐带组织衍生的IPS细胞， 传代培养所述诱导性多能干细胞， 以及提供诱导性多能干细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述鼠逆转录病毒还携带p53-shRNA。
【文档编号】C12N5/0735GK104136604SQ201280070176
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2012年12月4日 优先权日:2011年12月20日
【发明者】C.布恩苏塞索, A.塞达, D.C.科尔特, S.德哈纳拉, B.C.克拉梅 申请人:德普伊新特斯产品有限责任公司