专利名称：一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种干细胞库及其构建方法，具体地说是涉及一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现其存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前，我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题:随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制备过程不容易质控；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤,患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞 的生物学特性，与传统骨髓间充质干细胞相比，该类间充质干细胞由于来源于更原始的胎盘和脐带，所以免疫原性尚未发育完全，移植后异体的免疫反应不强。再加上胎盘与脐带作为医疗废弃物，更容易获得，取材容易。但是，胎盘和脐带组织来源有限，已经出生的人无法再获得胎盘与脐带，这就诱发我们去寻找就理想的间充质干细胞来源。最近研究发现，脂肪间质干细胞，是脂肪组织中一类多能性干细胞。由于脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小，因此日益受到研究者的重视，而且与骨髓来源相比，脂肪来源间充质干细胞分离效率高40倍，200 mL脂肪，可分离出约IXlO6个间质干细胞。目前，研究人员已成功地在体内、体外条件下，将其诱导分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉等组织类型细胞。干细胞库就是将干细胞于深低温状态下长期保存。一个完善的干细胞库可为临床细胞治疗提供良好的、足够量的细胞来源。目前，国内主要的干细胞库按来源可分为脐带干细胞库，胎盘干细胞库，牙髓干细胞库，牙周膜干细胞库等；按提供方法可分为公共库和自体库。脂肪间充质干细胞库尚无，特别的是脂肪间充质干细胞自体库尚无
发明内容
为了弥补无人脂肪间充质干细胞库的不足，本发明提供一种人脂肪间充质干细胞库及其制备方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于:包括下述步骤，
(1)无菌采集人体脂肪；
(2)油脂的去除:将脂肪剪碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤；
(3)胶原酶消化:加入等体积的胶原酶消化；加入等体积的含10%血清的DMEM-LG终止消化，充分混均后室温静置IOmin分层；去掉上层，离心，收集下层部分；
(4)红细胞的裂解:加入2倍体积的红细胞裂解液重悬3min，离心，弃上清；用PBS液清洗，40 μ m滤膜过滤后，向所得细胞中加含10%血清的DMEM-LG培养液，离心收集细胞，并于100U/mL青霉素/链霉素、10%血清的DMEM-LG中培养，即获得人脂肪间充质干细胞；
(5)扩大培养:人脂肪间充质干细胞进行扩大培养；
(6)冻存:收集扩大培养后的人脂肪间充质干细胞于冻存液中，置液氮冷冻，按AB0/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脂肪间充质干细胞库。作为本发明人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，步骤(4)得到的人脂肪间充质干细胞需要进行增殖能力验证，选择增殖能力强的人脂肪间充质干细胞进行扩大培养。作为本发明人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，所述血清为自体血清。作为本发明人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，自体血清由下述方法制得:无菌采集外周静脉血20mL，于4°C冰箱静置4h，在37°C温箱孵育4h，1500r/min离心5min，吸取上层血清，0.22 μ m过滤灭菌，在超净工作台内分装，经细菌培养阴性，_20°C保存备用。作为本发明人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，所述人脂肪间充质干细胞库为自体库。一种采用本发明人脂肪间充质干细胞库的构建方法构建出的人脂肪间充质干细胞库。与现有技术相比，本发明具有显著的有益效果。人脂肪间质干细胞是脂肪组织中一类多能性干细胞，能诱导分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉等组织类型细胞。脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小；而且与骨髓等来源的间充质干细胞相比，脂肪来源间充质干细胞增殖快，分离效率高，200 mL脂肪，可分离出约I X 106个间质干细胞，是骨髓的40倍。本发明提供一种人脂肪间充质细胞库及其构建方法，弥补了无脂肪间充质干细胞库的不足。
图1自体血清与胎牛血清培养脂肪间充质干细胞增殖柱状图。
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合具体实施方式
做进一步说明。一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤:
(I)无菌采集人体脂肪:先对脂肪间充质干细胞保存人进行AB0/RH血型分型、HLA分型、微生物学检测，HIV, HBV, HCV, TP检测，然后无菌采集脂肪；采集位点最好是人体脂肪较丰厚的大腿内侧部位；为了方便操作，采集的脂肪条优选长7-8cm。(2)油脂的去除:取5g脂肪组织，先用无菌的手术剪刀或者小刀剪碎，长度要求不大于3mm，然后收集于15mL离心管，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静至5min，等分为两层后小心收集上层部分(包含有间充质干细胞、脂肪细胞、磷酸盐缓冲液及红细胞)，去掉下层的油脂/脂质 ，收集的上层部分采用磷酸盐缓冲液洗涤3遍。(3)胶原酶的消化:加入等体积的0.075%的胶原酶I消化，37°C水浴30min ;加入等体积的含10%血清的DMEM终止消化，充分混均后室温静置IOmin分层；去掉上层(脂质/碎片)，200C，280g离心5min收集下层部分(基质血管部分、干细胞、红细胞)。(4)红细胞裂解:加入2倍体积的红细胞裂解液重悬3min，离心，弃上清；用PBS液清洗，40 μ m滤膜过滤后，向所得细胞中加含10%血清的DMEM-LG培养液，离心收集细胞，并于100U/mL青霉素/链霉素、10%血清的DMEM-LG中培养，即获得人脂肪间充质干细胞。将获得的人脂肪间充质干细胞按1/3接种量接种于24细胞孔培养板中，等待细胞贴壁后加入CCK-8试剂，对获得的人脂肪间充质干细胞进行增殖能力验证。CCK-8试剂在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的四氮唑盐的还原产物。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。(5)扩大培养:选择增殖能力强的人脂肪间充质干细胞进行扩大培养。(6)冻存:将人脂肪间充质干细胞置液氮冷冻，按AB0/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脂肪间充质干细胞库。作为本发明人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，所述血清为自体血清。作为本发明人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，自体血清由下述方法制得:无菌采集外周静脉血20mL，于4°C冰箱静置4h，在37°C温箱孵育4h，1500r/min离心5min，吸取上层血清，0.22 μ m过滤灭菌，在超净工作台内分装，经细菌培养阴性，_20°C保存备用。作为本发明人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，所述人脂肪间充质干细胞库为自体库。一种采用本发明人脂肪间充质干细胞库的构建方法构建出的人脂肪间充质干细胞库。为了保证人脂肪间充质干细胞库的成功建成和其安全性，上述全部过程均在无菌环境下操作。实施例1
人脂肪间充质干细胞库，采用如下方法构建:
(I)无菌采集人体脂肪:先对脂肪间充质干细胞保存人进行AB0/RH血型分型、HLA分型、微生物学检测，HIV, HBV, HCV, TP检测，以上各指标的检测结果均为阴性；然后无菌采集脂肪，I次可取200 mL脂肪，从中可分离出约I X IO6个间质干细胞。(2)油脂的去除:将获取的脂肪组织先用无菌的手术剪刀或者小刀剪碎，长度要求不大于3mm，再用等体积PBS液反复冲洗，静置等分层，去掉下层的油脂/脂质，收集的上层部分。(3)胶原酶消化:加入0.075% I型胶原酶，37 °C振荡、消化30 min，然后以含10%自体血清的DMEM-LG培养基终止消化；280g离心5 min,弃上清液及悬浮的残存组织，重悬细胞；
(4)红细胞的裂解:加入2倍体积的红细胞裂解液(160 mM NH4Cl + KHCO3 10 mmol/L+ EDTA 0.1 mmol/L)静置3 min,280g离心5 min,弃上清液。用适量的PBS液清洗3次，40 μ m滤膜过滤，所得细胞接种于25 cm2的培养瓶，加5 mL 10%自体血清的DMEM-LG培养基，混合均匀，置于37 °C、5%的CO2饱和湿度培养箱内培养。倒置显微镜观察细胞形态特征及增殖情况，第二天首次换液，以后每三天换液I次。待细胞融合超过培养瓶底80%时，常规胰酶消化传代。将分离所得细胞按1/3接种量接种于24细胞孔培养板中，等待细胞贴壁后加入CCK-8试剂，CCK-8试剂在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的四氮唑盐的还原产物。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。(5)扩大培养:选择增殖能力强的细胞进行扩大培养。(6)冻存:将所获得的人脂肪间充质干细胞装进冻存管，用程序除温盒置于-80 V，第二天将冻存管存在_196°C的液氮罐中，将其详细信息记录入库，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脂肪间充质干自体细胞库。在国内外传统干细胞培养方法中，常采用胎牛血清作为营养支持，胎牛血清对于细胞的生长起着重要的作用，但同时也成为未来临床应用的一个障碍。因为胎牛血清可增加病毒感染及异种蛋白所导致基因免疫应答反应、排异反应以及炎症反应的可能性，尤以反复体内输入时更易发生。尽管采用国外优质的胎牛血清，经过了严格的处理，但仍然存在病毒或细菌感染的潜在风险。据报道，采用异体/异种血清培养间充质干细胞后移植治冶疗后导致恶性室性心律失常；胎牛血清中的朊病毒通过按照自身结构重建正常蛋白结构来引发Creutzfeldt-Jakob病(或在牛身上引发“疯牛病”)；研究发现，扩增获得108个细胞时含7-30mg的胎牛血清，所在风险将进一步扩大。而采用自体血清作为营养支持，排异反应以及炎症反应的可能性大大降低。作为本发明人脂肪间充质干细胞库的一种优选实施方式，自体血清由下述方法制得:无菌采集外周静脉血20mL，于4°C冰箱静置4h，在37°C温箱孵育4h, 1500r/min离心5min,吸取上层血清,0.22 μ m过滤灭菌,在超净工作台内分装,经细菌培养阴性，_20°C保存备用。用含胎牛血清的DEME-LG培养基做对照，与使用胎牛血清培养方法相比原代培养时贴壁时间无统计学差异，传代培养时自体血清培养人脂肪间充质干细胞增殖速率明显增快，如图1所示。本发明采用人自体血清培炎脂肪间充质干细胞,不含动物血清,大大降低了免疫反应发生的概率。而且，在扩增前进行增殖 能力检测，有选择性的进行扩增培养，大大提高了干细胞库中干细胞的数量和质量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以`所附权利要求为准。
权利要求
1.一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，包括下述步骤: (1)无菌采集人体脂肪； (2)油脂的去除:将脂肪剪碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤； (3)胶原酶消化:加入等体积的胶原酶消化；加入等体积的含10%血清的DMEM-LG终止消化，充分混均后室温静置IOmin分层；去掉上层，离心，收集下层部分； (4)红细胞的裂解:加入2倍体积的红细胞裂解液重悬3min，离心，弃上清；用PBS液清洗，40 μ m滤膜过滤后，向所得细胞中加含10%血清的DMEM-LG培养液，离心收集细胞，并于100U/mL青霉素/链霉素、10%血清的DMEM-LG中培养，即获得人脂肪间充质干细胞； (5)扩大培养:对人脂肪间充质干细胞进行扩大培养； (6)冻存:收集扩大培养后的人脂肪间充质干细胞于冻存液中，置液氮冷冻，按AB0/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脂肪间充质干细胞库。
2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于:步骤(4)得到的人脂肪间充质干细胞需要进行增殖能力验证，选择增殖能力强的人脂肪间充质干细胞进行扩大培养。
3.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞库构建方法，其特征在于:所述血清为自体血清。
4.根据权利要求3所述的人脂肪间充质干细胞库构建方法，其特征在于:自体血清由下述方法制得:无菌采集外周静脉`血20mL，于4°C冰箱静置4h，在37°C温箱孵育4h，1500r/min离心5min,吸取上层血清,0.22 μ m过滤灭菌,在超净工作台内分装，经细菌培养阴性，-20°C保存备用。
5.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞库构建方法，其特征在于:所述人脂肪间充质干细胞库为自体库。
6.一种权利要求1-5任一项所述的人脂肪间充质干细胞库的构建方法构建出的人脂肪间充质干细胞库。
全文摘要
本发明公开一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法，本发明人脂肪间充质干细胞库由下述步骤构建得到(1)无菌采集人体脂肪；(2)油脂的去除；(3)胶原酶消化；(4)红细胞的裂解；(5)扩大培养；(6)冻存。人脂肪间质干细胞是脂肪组织中一类多能性干细胞，能诱导分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉等组织类型细胞。脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小；而且与骨髓等来源的间充质干细胞相比，脂肪来源间充质干细胞增殖快，分离效率高。
文档编号C12N5/0775GK103074298SQ20131000064
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者冯文峰, 列浦昌, 佘志勇, 方海庆 申请人:广州爱菲科生物科技有限公司