专利名称：一种生产甲醇蛋白的发酵培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别是一种生产甲醇蛋白的发酵培养基。
背景技术：
应用发酵法生产单细胞蛋白作为饲料，在国内外已有较多报道，部分加工工艺较为成熟，如用假丝酵母(Candida),酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等作为发酵菌种等为原料生产的单细胞蛋白报道较多。但以甲醇为主要碳源生产单细胞的报道还不多，目前国内外生产甲醇蛋白的方法主要有细菌发酵法和酵母发酵法，细菌法包括英国的ICI法。德国的Hoechst-Uhde法和瑞典的Norprotein法酵母菌种生产法包括日本的MGC法，法国的 IFP 法和美国的 Philips Petroleum 法(Zheng GH, 2002. Methanol proteinproduction technology. M-Sized Nitrogenous Fertilizer Progress, 2:12-15)。除ICI法工业化生产外，我国部分研究单位公布的实验室小试生产甲醇蛋白方法多是利用酵母菌生产单细胞蛋白。但生产实践表明，利用原有蛋白配方，出现了蛋白产量低，含盐分大，保证不了产品质量的问题，因此生产甲醇蛋白的配方(组合物)亟待改进和创新。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供创新的一种生产甲醇蛋白的发酵培养基，可有效解决蛋白产量低，含盐分大，保证不了产品质量的问题。本发明解决的技术方案是，根据生产蛋白质的实践，并经检测发现，之所以出现蛋白产量低、含盐分大，根本问题在于生产甲醇蛋白的配方(组合物)不尽合理，特别是用量的配伍上缺乏有效性，因此科学研究、分析和实验，本发明组合物采用由以下组分质量浓度85% 磷酸(H3PO4)24. 5-25. 5ml、硫酸钙(CaSO4 ·2Η20)0· 85-0. 88g、硫酸钾(K2SO4) 17-17. 8g、硫酸镁(MgSO4 · 2H20) 15. 5-16. 08g、氢氧化钾(KOH) 3. 5-4. Og、甘油 42_44g、1-苯基 ~5~ 巯基四氮唑(PMTl) 3. 5-3. 8ml，加水至IOOOml组成。本发明组方科学合理，使用效果好，可有效解决提高蛋白产量，克服甲醇蛋白盐分含量大，质量得不到保证的问题，是甲醇蛋白生产上的创新。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式
作详细说明。实施例1
本发明在具体实施中，由以下组分质量浓度85%磷酸25. 3ml、硫酸钙0. 87g、硫酸钾
17.5g、硫酸镁15. 7g、氢氧化钾3. 98g、甘油43g、1-苯基-5-巯基四氮唑3. 6ml，加水至IOOOrnl 组成。实施例2
本发明在具体实施中，也可由以下组分质量浓度85%磷酸24. 5ml、硫酸钙0. 85g、硫酸钾17g、硫酸镁15. 5g、氢氧化钾3. 5g、甘油42g、l-苯基-5-巯基四氮唑3. 5ml，加水至IOOOml 组成。实施例3
本发明在具体实施中，还可由以下组分质量浓度85%磷酸25. 5ml、硫酸钙O. 88g、硫酸钾17. 8g、硫酸镁16. 08g、氢氧化钾4g、甘油44g、l-苯基-5-巯基四氮唑3. 8ml,加水至IOOOml 组成。实施例4
本发明在具体实施中，还可由以下组分质量浓度85%磷酸24. 8ml、硫酸I丐O. 86g、硫酸钾17. lg、硫酸镁16g、氢氧化钾3. 7g、甘油43g、l-苯基-5-巯基四氮唑3. 7ml，加水至IOOOml 组成。实施例5
本发明在具体实施中，也可由以下组分质量浓度85%磷酸25ml、硫酸钙O. 87g、硫酸钾17. 3g、硫酸镁15. 9g、氢氧化钾3. 8g、甘油43. 5g、l_苯基_5_巯基四氮唑3. 6ml，加水至IOOOml 组成。上述各组分均可从商业途径得到，为公知技术，本发明的贡献在于将它们科学合理的组合在一起，构成新的生产甲醇蛋白的培养基组合物。本发明培养基用于生产甲醇蛋白质量好，节约原料，有效提高甲醇蛋白的产量，并经实际应用得到了有效证明，有关资料如下(在以下的实际应用过程中，除本发明的培养基是创新之外，其余均为现有技术):
一、固体斜面的制作
用电子天平称取重量计蛋白胨(北京奥博星)2%，酵母膏(北京奥博星)1%，葡萄糖(北京奥博星)2%，琼脂粉2%，加水至100%，搅拌均匀后，在炉子上煮沸，成蛋白胨培养基。用IOml移液枪取5-8ml蛋白胨培养基加入试管并用塞子盖好，每7支一捆，用四层报纸包好，放入121°C的高压灭菌锅里灭菌20分钟，取出冷却至60°C左右，在无菌操作台中摆成斜面(培养基倾斜后不能超过试管的1/2)，冷却后成固体斜面培养基，待用；
二、活化斜面
取出放在4°C冰箱保存的巴斯德毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母为已有菌种，如中国典型培养物保藏中心保藏号CCTCC N0:M2012342的巴斯德毕赤酵母，保藏时间2012年9月12日)，在无菌操作台中，酒精灯旁，用取样环刮取一环菌种，并在上述固体斜面培养基上轻轻地画曲线，成活化好的菌种斜面，把活化好的菌种斜面放入30°C培养箱中培养24小时，取出待用；
三、一级种子培养
在无菌操作台中将活化好的斜面种子，用取样环刮取几环接种到装有150ml YH)液体培养基的500ml三角瓶中(YPD培养基配方为北京奥博星的酵母膏1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，加水至100%组成，充分溶解后，装瓶灭菌)，瓶口用8层纱布包好，30°C摇床振荡培养，转速200rpm，培养24-30小时，得到一级种子。四、二级种子培养
一级种子利用火焰接种法通过接种口接入50升发酵罐中即为二级种子液发酵温度% 30 0C，通风比1:1. 5-2，罐压 O. 05MPa，PH5. 0-5. 5，转速 150rpm，培养 24 小时，(二级培养液BSM由二水硫酸钙0.2-0. 4g，硫酸钾8-10g，七水硫酸镁6_8g，85%磷酸15_20ml，甘油36-44g，加水至IOOOml组成)，培养结束后即为二级种子液，必要时，按上述方法，可继续培养三级种子液、四级种子液……，以满足生产对种子的需要。五、五吨发酵罐生产甲醇蛋白
在发酵罐内加入5吨本发明培养基(试剂)，每IOOOml试剂中加入微量元素溶液3-5ml(微量元素溶液配方五水硫酸铜14-18g，碘化钾O. 07-0. lg，一水硫酸锰4-6g，二水钥酸钠
O.1-0. 2g，硼酸O. 1-0. 2g，六水合氯化钴l_3g，氯化锌36-44g，七水合硫酸亚铁65_79g，浓硫酸4-6ml充分溶解，加水至IOOOml制成)，将上述一级种子液(或二级、三级种子液……)接入50升发酵罐中(接种量以5%为宜)罐内甘油消耗完，溶氧以曲线形式再次持续升高时，开始向罐内流加甲醇，甲醇流加量控制在5-6克/ (升.小时)即每小时每升管内液体量流加甲醇5-6g，调节通气量，保持罐内溶氧在30%以上，最大流加量达到10-12g/(L*h)，发酵过程中，每16小时补加微量元素溶液，每次流加2升，发酵72-84小时后，取样测发酵液的湿重达到300g/L，发酵结束，该发酵液用常规方法生产甲醇蛋白，经实际测量和计算，所生产的甲醇蛋白质量好，盐分度得到了有效降低，只是原甲醇蛋白盐分含量的20%，蛋白产量增加了 10%以上，而且节约原料30-50%，在商业上取得了巨大的成功，而且大大减少了废弃物对环境的污染，经济和 社会效益巨大。
权利要求
1.一种生产甲醇蛋白的发酵培养基，其特征在于，由以下组分质量浓度85%磷酸 24. 5-25. 5ml、硫酸钙 O. 85-0. 88g、硫酸钾 17-17. 8g、硫酸镁 15. 5-16. 08g、氢氧化钾3. 5-4. 0g、甘油42-44g、l-苯基-5-巯基四氮唑3. 5-3. 8ml，加水至IOOOml组成。
2.根据权利要求1所述的生产甲醇蛋白的发酵培养基，其特征在于，由以下组分质量浓度85%磷酸25. 3ml、硫酸钙O. 87g、硫酸钾17. 5g、硫酸镁15. 7g、氢氧化钾3. 98g、甘油43g、l-苯基-5-巯基四氮唑3. 6ml，加水至IOOOml组成。
3.根据权利要求1所述的生产甲醇蛋白的发酵培养基，其特征在于，由以下组分质量浓度85%磷酸24. 5ml、硫酸钙O. 85g、硫酸钾17g、硫酸镁15. 5g、氢氧化钾3. 5g、甘油42g、1-苯基-5-巯基四氮唑3. 5ml，加水至IOOOml组成。
4.根据权利要求1所述的生产甲醇蛋白的发酵培养基，其特征在于，由以下组分质量浓度85%磷酸25. 5ml、硫酸钙O. 88g、硫酸钾17. 8g、硫酸镁16. 08g、氢氧化钾4g、甘油44g、1-苯基-5-巯基四氮唑3. 8ml，加水至IOOOml组成。
5.根据权利要求1所述的生产甲醇蛋白的发酵培养基，其特征在于，由以下组分质量浓度85%磷酸24. 8ml、硫酸钙O. 86g、硫酸钾17. lg、硫酸镁16g、氢氧化钾3. 7g、甘油43g、1-苯基-5-巯基四氮唑3. 7ml，加水至IOOOml组成。
6.根据权利要求1所述的生产甲醇蛋白的发酵培养基，其特征在于，由以下组分质量浓度85%磷酸25ml、硫酸钙O. 87g、硫酸钾17. 3g、硫酸镁15. 9g、氢氧化钾3. 8g、甘油43. 5g、1-苯基-5-巯基四氮唑3. 6ml，加水至IOOOml组成。
全文摘要
本发明涉及生产甲醇蛋白的发酵培养基，可有效解决蛋白产量低，含盐分大，保证不了产品质量的问题，其解决的技术方案是，采用由以下组分质量浓度85%磷酸24.5-25.5ml、硫酸钙0.85-0.88g、硫酸钾17-17.8g、硫酸镁15.5-16.08g、氢氧化钾3.5-4.0g、甘油42-44g、1-苯基-5-巯基四氮唑3.5-3.8ml，加水至1000ml组成，本发明组方科学合理，使用效果好，可有效解决提高蛋白产量，克服甲醇蛋白盐分含量大，质量得不到保证的问题，是甲醇蛋白生产上的创新。
文档编号C12N1/16GK103060211SQ20131000165
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者乔国厚, 王兰甫, 苟万晓, 胡元森, 张寅 , 曹敏, 樊崇, 张国杰, 许宗浩, 卫红伟, 田亚鹏, 朱广有, 王霞 申请人:义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司