专利名称：白念珠菌细胞凋亡促进因子基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码白念珠菌凋亡促进因子CaWwml的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽，本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备，更具体地，本发明涉及从白念珠菌的基因组中克隆到白念珠菌细胞凋亡促进因子基因CaffWMl及其用途。
背景技术：
白念珠菌也称为白色念珠菌(Candida albicans),它是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等疾病，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡(Odds, F. C. 1994. J Am Acad Dermatol. 31:S2_S5.)。细胞凋亡是一种重要的细胞生理活动，是外界刺激信号通过细胞信号转导通路引起细胞“自杀”的一种机制，过去认为细胞凋亡主要在多细胞生物中发生，起到协调机体生长的作用。但是，近年来的研究发现，单细胞的酵母也存在这种生理活动，乙酸，过氧化氢，葡萄糖，抗真菌药物能引起酵母发生凋亡。然而，究竟哪些基因参与酵母细胞凋亡的信号转导还不十分清楚。有报道在酿酒酵母中表达高等生物的Bax,Bax InhibitorCBI), Caspase等凋亡相关基因会影响酿酒酵母的凋亡率，说明从酵母到高等生物其凋亡的机理存在一定相似性。目前发现，白念珠菌在多种理化因子的诱导下会发生细胞凋亡，然而，对白念珠菌凋亡发生的分子机制研究尚不清楚。
由于白念珠菌会严重威胁人们的身体健康，因此，开发白念珠菌凋亡有关的各种蛋白或因子，对于更好的防治白念珠菌感染有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的与白念珠菌生长有关的凋亡促进因子CaWwml蛋白以及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的CaWwml多肽，它包括具有SEQ IDN0:2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，并且具有调控白念珠菌菌丝形成的功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，该多肽是具有SEQ ID N0:2氨基酸序列的多肽。在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70%相同性(a)编码上述白念珠菌CaWwml多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO:1中1-711位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-708位的序列；或(c)具有SEQ ID NO:1中翻译起始密码子到终止密码子的序列。在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。在本发明的第四方面，提供了制备具有白念珠菌CaWwml蛋白活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达白念珠菌CaWwml蛋白的条件下,培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有白念珠菌CaWwml蛋白活性的多肽。在本发明的第五方面，提供了与上述的白念珠菌CaWwml多肽特异性结合的抗体。在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗白念珠菌CaWwml多肽活性的化合物，以及抑制白念珠菌CaWwml多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是白念珠菌CaWwml多肽的编码序列或其片段的反义序列。在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CaWwml蛋白的方法，它包括将样品与CaWwml蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaWwml蛋白。在本发明的第八方面，提供了一种检测与白念珠菌CaWwml多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进白念珠菌CaW wml多肽活性的激动剂，或者筛选抑制白念珠菌CaWwml多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的白念珠菌CaWwml蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如O. 001-99. 99wt%)的本发明的白念珠菌CaWwml多肽的拮抗剂或抑制剂或抗体以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗白念珠菌感染等病症。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显不了白念珠菌CaWwml蛋白因子和酿酒酵母ScWwml蛋白因子结构域比较。图2显示了利用PCR从白念珠菌基因组DNA中扩增得到CaWWMl基因编码区。图3为Northern杂交图，显示了在白念珠菌菌株SC5314酵母型与菌丝型生长状态下中CaffWMl基因的表达状况。以CaACTl基因为对照。图4显示了在酿酒酵母中表达CaffWMl基因后，酿酒酵母在乙酸与过氧化氢的作用下的细胞生存率。结果显示，CaWwml蛋白提高了酿酒酵母在乙酸和过氧化氢中的凋亡率，这种效应在低浓度的情况下尤其明显。图5显示了 CaWwml因子和CaMcal因子存在相互作用。
具体实施例方式本发明人通过广泛而深入的研究，首次在白念珠菌中克隆了一种促进白念珠菌凋亡因子基因CaWwml。具体地，本发明人利用基因表达原理，在酿酒酵母中高表达CaWWMl，导致酿酒酵母细胞存活率比对照细胞明显降低，尤其是在低浓度乙酸及过氧化氢作用下，CaffWMl基因在酿酒酵母中的表达导致酿酒酵母细胞凋亡率提高，说明CaWwml蛋白是白念珠菌中的一个重要的促凋亡因子，在此基础上完成了本发明。在本发明中，术语“CaWwml蛋白”、“CaWwml多肽”或“凋亡促进因子CaWwmr’可互换使用，都指具有白念珠菌凋亡促进因子CaWwml氨基酸序列(SEQ ID N0:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的凋亡促进因子CaWwml。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的CaWwml蛋白或多肽”是指CaWwml多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CaWwml蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。CaWwml多肽的纯度能用氨基酸序列分析。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆 虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括白念珠菌CaWwml蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然白念珠菌CaWwml蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。在本发明中，术语“白念珠菌CaWwml多肽”指具有白念珠菌CaWwml蛋白活性的SEQID N0:2序列的多肽。该术语还包括具有与白念珠菌CaWwml蛋白相同功能的、SEQ IDN0:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括白念珠菌CaWwml蛋白的活性片段和活性衍生物。该术语还包括与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%序列相同性，并且具有调控白念珠菌菌丝形成的功能的多肽。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与白念珠菌CaWwmlDNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗白念珠菌CaWwml多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含白念珠菌CaWwml多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了白念珠菌CaWwml多肽的可溶性片段。通常，该片段具有白念珠菌CaWwml多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供白念珠菌CaWwml蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然白念珠菌Caffwml多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“白念珠菌CaWwml蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替 换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I
权利要求
1.一种分离的白念珠菌CaWwml多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID N0:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，并且具有促进细胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于该多肽是具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组Ca)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种Ca)具有SEQ ID NO:1中1-711位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-708位的序列。
5.—种载体,其特征在于它含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.—种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于它含有权利要求5所述的载体。
7.—种多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含Ca)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出白念珠菌CaWwml蛋白多肽。
8.一种能与权利要求1所述的白念珠菌CaWwml蛋白特异性结合的抗体。
9.一种检测样品中是否存在CaWwml蛋白的方法，其特征在于将样品与权利要求9所述的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaWwml蛋白。
10.如权利要求1-9所述的多肽、多核苷酸和编码序列，可用于筛选促进白念珠菌Caffwml多肽活性的激动剂，筛选抑制白念珠菌CaWwml多肽活性的拮抗剂，或者被用于肽指纹图谱鉴定，多聚核苷酸可用于CaWwml蛋白相关疾病的诊断，白念珠菌CaWwml蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
全文摘要
本发明公开了一种白念珠菌细胞凋亡促进因子基因CaWWM1及其用途，属于生物医药技术领域。包括提供了一种新的细胞凋亡调控因子-CaWwm1蛋白，编码CaWwm1蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种CaWwm1蛋白的方法，以及编码这种CaWwm1蛋白的多核苷酸的用途，CaWwm1是对白念珠菌凋亡有促进作用的蛋白，它的表达量提高能促进酵母细胞发生凋亡。
文档编号C12N1/19GK103059110SQ20131000170
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者倪坚, 尹军霞, 金立方, 弭忠祥 申请人:绍兴文理学院