干扰OsFLA19编码基因表达的RNA及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种干扰OsFLA19编码基因表达的RNA及其编码基因与应用。本发明提供的一种一种RNA分子，为如下（a）或（b）：（a）序列表的序列4所示的RNA分子；（b）与序列表的序列4反向互补的RNA分子。本发明的实验证明，本发明发现的OsFLA19，将其编码基因部分特异序列组成的DNA分子构建到目的载体pTCK303中，得到RNA干扰载体，利用农杆菌介导法将RNA干扰载体转化水稻Kitaake愈伤组织，经潮霉素筛选和PCR检测，得到OsFLA19的RNAi株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现出明显的矮化及叶夹角增大的特性，说明沉默OsFLA19表达与水稻株型调控密切相关。
【专利说明】干扰OsFLAI 9编码基因表达的RNA及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种干扰0sFLA19编码基因表达的RNA及其
编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]水稻是全世界重要的粮食作物之一，占全球谷类作物种植面积的1/3。随着人口迅速增长，全球粮食危机日益严重。我国城市化进程、水资源限制等导致耕地面积减少，加上种植结构调整，我国的水稻实际种植面积已有下降趋势，要满足巨大人口增长对稻米的需求，解决粮食安全问题，必须实现水稻育种上的新突破。20世纪60年代，我国选育出综合性状良好的矮杆抗倒品种，开创了我国水稻矮化育种的新纪元，矮杆水稻品种的选育和推广成为水稻育种实践中非常重要的研究课题。因此，发掘和鉴定影响水稻矮化的基因，开展矮化相关基因的定位、克隆及作用机理等方面的研究，实现对于水稻株高的定向改良，具有十分重要的理论意义和应用价值。
[0003]矮化作为水稻的一种优良性状，具有抗倒伏和增产的作用，并且水稻矮杆基因的发掘和育种利用已为人类粮食生产做出了巨大贡献。然而，中国矮杆资源十分贫乏、矮杆基因单一化以及可利用的矮源比较稀少，遗传研究表明，生产上应用的矮杆和半矮杆品种绝大多数是带有sdl的品种及其衍生品种，但是由于sdl基因与不良农艺性状的连锁，使其在生产上广泛利用潜伏着由遗传单一而带来的风险(Yu et al.,2005)。因此创建、筛选非sdl矮源，以扩大水稻矮杆基因的遗传基础，增加遗传多样性或者作为矮杆基因的储备是极为重要和必要的，该项研究受到广大水稻育种工作者和种质资源工作者的高度重视；到目前为止，已发现多种矮化突变体，而大多数突变体都过度矮化或不具备实用的农艺性状。因此挖掘新的矮杆资源，通过多种途径探求对育种具有应用价值的新矮源，无论在理论上还是在育种实践上都将具有非常重要的实用价值。
[0004]水稻植株矮化一般认为是矮杆基因的作用导致水稻植株形态学或细胞学上的变化，如节间变短和细胞数目减少等；同时，基因的表达还受到外部环境以及内源条件的影响。近年来，对水稻矮化相关基因的遗传学、矮化突变体的激素调控以及矮化相关基因的克隆和利用等方面开展了广泛而深入的研究，尤其在利用基因工程手段控制水稻株高方面取得了很大的进步。植物激素几乎参与水稻生长发育的整个过程，植物矮化突变与植物赤霉素(Gibberel I in, GA)和油菜素类固醇(Brassinosteroid, BR)有关；少数植物矮化突变与生长素(Auxin，IAA)有关。水稻矮化突变体dwarf I (dl)是钝感型突变体，表现为矮化、叶且呈墨绿色、花序紧密。研究表明，水稻dwarfl基因编码的是GTP结合蛋白，该蛋白在植物的生长发育中发挥着重要作用(Ashikari et al.，1999) oSasaki等分离的水稻矮化突变体gid2也是GA钝感突变体，因抑制GA的信号传导，导致植株矮化(Sasaki et al.，2003)。水稻brdl突变体是是一种BR缺陷型矮化突变体，外源施加BR能恢复到正常表型。该突变体叶鞘短、叶片短而弯曲、分蘖少、不育。内源BR含量分析发现BR合成过程中的BR-6-氧化酶减少(Mori et al.，2002)。Hong等研究发现，矮化突变体d2是BR敏感型突变体，外源施加10_6M的BL (BR的一种活性形式)，能使突变体的表型恢复到野生型，利用d2突变体克隆了 D2基因，该基因编码细胞色素P450家族中一个新成员，属于与BR合成酶高度相似的CYP90D家族(Hong et al.，2003)。随着RFLP、RAPD, AFLP, SSR等分子标记技术的开展及广泛应用，许多控制株高性状的基因已得到了定位和克隆，利用这些基因控制GA或者BR的生物合成或者信号传导从而获得适合的株高，将是未来生产的重要手段(Mori etal., 2002 ；Hong et al., 2003 ；Hedden et al., 2003 ；Sakamoto et al., 2003)。
[0005]水稻产量与它的株型密切相关，除了株高，还包括分蘖数目、分蘖角度、花形态和叶夹角等。直立叶片株型和密植相结合是目前获得水稻增产的新策略，拥有直立叶片的植株能够吸收更多的阳光促进光合作用和种子灌浆，从而提高整株的产量。水稻对油菜素内酯(BR)响应的一个重要形态特征就是产生直立叶片的表型。多年来科学家们对水稻中BRs合成和信号转导分子机制的研究投入了极大的热情，越来越多的水稻BRs合成和信号转导的关键元件被克隆和印证。BR合成减少的突变体以及信号减弱的突变体表现出矮化、叶片直立、种子变小等特征，例如brd2、d2、dll、brdl、d61，相反，超表达合成基因或者信号转导的正调控因子能够增大叶夹角的角度，例如超表达BZR1。因此，分离水稻油菜素内酯信号元件，不仅完善了水稻油菜素内酯信号传递的分子机制，而且对于改良水稻株型、提高水稻产量也有重要意义。[0006]具有类成束蛋白结构域(Fasciclin-like domain)的阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins,AGP)是阿拉伯半乳聚糖蛋白家族中的一类,它不仅包含有类AGP的糖基化区域,而且还存在1-2个fasciclin-like结构域,该类蛋白被许多实验证明行使分子粘连的功能。Faik等通过生物信息学的方法分析了水稻和小麦中的FLA基因，结果发现，这些谷物类的FLA蛋白与拟南芥的有相同的结构,包含fasciclin-like和AGP-1ike结构域。这些基因中的70%也被推测含有GP1-锚定序列。RNA gel blot分析发现大多数FLA基因在种子和根中微弱表达，而且大多数小麦FLA基因的表达因非生物条件的胁迫而下调(Faik et al.，2006)。到目前为止，水稻基因组中FLA基因家族已有29个成员被鉴定出来。在拟南芥基因组中已经报道的FLA类基因一共有24个成员。目前关于植物FLA蛋白的功能还知之较少，己有的证据表明，FLA蛋白可能在细胞伸长、细胞粘连和次生壁成熟的过程中起作用。拟南芥一个sos5(fla4)突变体生长在高盐浓度的培养基上时，表现出根尖膨胀、根的伸长受到了抑制，测序结果显示突变位点位于该基因内的fasciclin-like结构域中，因此，FLA4是细胞增殖所必需的(shi et al.，2003)。拟南芥另一个FLA基因AtFLAll，其mRNA在花序茎和荚果的厚壁组织(sclerenchyma)中特异表达，且表达强度随着果实的成熟不断增强，推测AtFLAll可能促进次生细胞壁的木质化，对次生细胞壁的成熟有重要的作用(Ito et al.,2005) ο
[0007]目前，虽然人们对AGP类基因家族蛋白的研究已经取得了一定的进展，但在水稻中的研究还比较少，该类基因参与的生物学过程还不清楚。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种干扰0sFLA19编码基因表达的RNA及其编码基因与应用。
[0009]本发明提供的RNA分子，为如下(a)或(b):[0010](a)序列表的序列4所不的RNA分子(单链RNA分子或双链RNA分子)；
[0011](b)与序列表的序列4反向互补的RNA分子(单链RNA分子或双链RNA分子)。
[0012]编码上述RNA分子的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0013]上述DNA分子包括片段F、内含子和片段R ;所述片段R为0sFLA19蛋白编码基因中的任意一个片段；所述片段F的核苷酸序列为所述片段R的反向互补序列；所述0sFLA19蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2 ;所述0sFLA19蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I ;
[0014]所述片段R的核苷酸序列具体为序列表中的序列I自5’末端第713-1028位核苷酸或序列表中的序列3自5’末端第884-1199位核苷酸。
[0015]上述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列表中的序列3自5’末端第16-1199位核苷酸。
[0016]含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
[0017]上述重组载体为将所述DNA分子插入表达载体中，得到的载体，在本发明的实施例中，表达载体具体为载体PTCK303。
[0018]上述的DNA分子或上述的RNA分子或上述的重组载体在沉默或失活目的植物中0sFLA19蛋白编码基因表达中的应用也是本发明保护的范围；所述0sFLA19蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0019]上述应用中，所述0sFLA19蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I。
[0020]上述应用中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
[0021]本发明的实验证明，本发明发现的0sFLA19，将其编码基因部分特异序列组成的DNA分子构建到目的载体pTCK303中，得到RNA干扰载体，利用农杆菌介导法将RNA干扰载体转化水稻Kitaake愈伤组织，经潮霉素筛选和PCR检测，得到0sFLA19的RNAi株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现出明显的矮化及叶夹角增大的特性，说明沉默0sFLA19表达与水稻株型调控密切相关。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为RT-PCR方法扩增到0sFLA19的全长cDNA中较特异的序列
[0023]图2为RNAi表达载体0sFLA19RNAi的部分结构示意图
[0024]图3为转基因水稻的Real-time-PCR鉴定
[0025]图4为0sFLA19RNAi转基因水稻矮化表型观察
[0026]图5为0sFLA19RNAi转基因水稻叶夹角变大表型观察
【具体实施方式】
[0027]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]实施例1、干扰0sFLA19编码基因表达载体0sFLA19RNAi的构建及干扰DNA分子的
获得[0030]1、干扰0sFLA19编码基因表达的靶片段的获得
[0031 ] 根据在GenBank提交的水稻基因序列，找到编码0sFLA19基因，其完整读码框序列GenBank号为ΝΜ_001053180 (序列I ;编码的蛋白命名为0sFLA19，其氨基酸序列为序列表中序列2)，据此设计正反向引物，5'端引物:5' -CGG GGTACC ACTAGTCAATAAGGAGCACAAGAAG-3 '(下划线序列为 Kpn 1、Spe I 位点)，3 '端引物:5 ' -CGCGGATCC GAGCTC CTGAGTGAATCATCATCAACA-3'(下划线序列为BamH 1、Sac I 位点)，以三叶期 Kitaake 水稻(Oryza sativaL.cv.Kitaake, Qu et al., J.Exp.Bot.2008, 59:24172424,公众可从中国科学院植物研究所获得，以下简称为野生型水稻)幼苗总RNA反转录的cDNA为模板，采用RT-PCR方法扩增到0sFLA19全长cDNA中316bp的特异序列。具体操作过程如下:
[0032]水稻总RNA的提取:选取三叶期Kitaake水稻。幼苗IOOmg为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含Iml Trizol试剂(Invitrogen)的1.5ml离心管中，充分混匀；室温25°C放置5分钟；每管中加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15秒，25°C温育2~3分钟；12，OOOrpm, 4°C，离心15分钟；把上清的水相0.5ml转移到一个新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，室温放置10分钟使RNA沉淀；12，OOOrpm，4°C，离心10分钟；去上清，将RNA沉淀用lml75%乙醇清洗2次，超净台吹至半干；用50 μ I DEPC_ddH20重悬沉淀，60°C水浴10分钟，以溶解RNA沉淀。将此RNA溶液分装后_70°C保存，备做反转录的模板。
[0033]RT-PCR:取I μ I上述RNA样品，用DEPC_ddH20稀释100倍，用分光光度计测定RNA浓度。参照RT-PCR试剂盒(Promega)说明书，根据RNA的定量结果，取2 μ g该RNA，加1.0 μ gOligo dT引物，用DEPC-ddH20补充至15 μ 1，混匀后70°C变性5分钟，冰浴5分钟。短暂离心后，加入25μ I反转录混合物(5μ I M-MLV5 X Reaction Buffer, 6 μ I dNTPMixture(2.5mM), I μ I M-MLV Reverse Transcriptase,0.5 μ I RNase Inhibitor,12.5 μ IDEPC-ddH20)。混匀后，42°C水浴I小时完成反转录过程；75°C水浴10分钟使反转录酶失活，得到含有第一链cDNA的混合物。
[0034]取I μ I上述第一链cDNA作为PCR的模板，按以下体系进行PCR反应:0.2 μ I LATaq( 5U/μ 1),10 μ 12 X GC buffer, 1.8μ I dNTPs, 0.5 μ 15'端引物(10 μ Μ)，0.5 μ 13'端引物(10 μ Μ)，加ddH20终体积20 μ I。引物序列如前，PCR程序为:94° C预变性3分钟后进入PCR循环，循环参数为94° C30秒变性一58° C30秒复性一72° Cl分钟延伸，30个循环后在72° C继续合成10分钟。
[0035]扩增的PCR产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，从图中可以看出，得到分子量大约0.3kb的条带，用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒回收该片断得到20 μ I回收产物。进行测序分析,测序结果316bp的PCR片段具有序列表中序列I自5’末端第713-1028之间的核苷酸，将该PCR片段命名为A。
[0036]克隆载体的构建和纯化:取3.5 μ I上述回收片段，加入T4-DNA连接酶I μ I (3U/μ 1)、2Χ 连接酶缓冲液 5 μ 1、pGEM-T Easy 载体(Promega) 0.5 μ I (50mg/ml) 4°C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到转化子，得到质粒pTeasy-A。
[0037]经过测序，质粒pTeasy-A为将序列表中序列I自5’末端第713-1028之间的核苷酸插入pGEM-T Easy载体中得到的质粒。[0038]2、0sFLA19RNAi表达载体的构建
[0039]pTCK303载体酶切:用限制性内切酶Spe I和Sac I双酶切载体pTCK303(pTCK303 记载在如下文献中:Wang Z, Chen C，Yunyuan Xu, et al.2004.A PracticalVector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice(Oryza sativa).PlantMolecularBiology reporter22:1-9.;公众可从中国科学院植物研究所获得)，酶切体系为:质粒 10 μ l、10x 酶切缓冲液 5 μ l、Spe I 1μ I (lOU/μ l),Sac I 10.8 μ I (lOU/μ I),加ddH20补充反应体系至50 μ 1，37°C酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收14621bp线性化的pTCK303大片段，溶于20 μ I ddH20中。
[0040]正向片段和反向片段的获得:用限制性内切酶Spe I和Sac I同样条件双酶切pTeasy-A并回收316bp酶切产物，命名为0sFLA19F (正向片段)。同样，用限制性内切酶BamHI和Kpn I对载体pTeasy-A进行双酶切并回收316bp酶切产物，命名为0sFLA19R (反向片段)。
[0041]0sFLA19RNAi表达载体:取回收的316bp的0sFLA19F产物10 μ 1、回收的载体PTCK303溶液6 μ 1，与T4DNA连接酶2 μ I (3U/ μ I)、IOx连接酶缓冲液2 μ I混和，16°C连接16小时，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，将该质粒命名为0sFLA19F/pTCK303。测序成功的该质粒用限制性内切酶Kpn I和BamH进行双酶切，酶切体系为:质粒10 μ 1、IOx酶切缓冲液5 μ 1、Kpn Il μ I (lOU/μΙ)、BamH 10.8 μ I (10U/μ I )，加ddH20补充反应体系至50 μ 1，37°C酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收14937bp线性化的0sFLA19F/pTCK303大片段，溶于20 μ IddH20中。取回收的316bp的0sFLA19R产物10 μ 1、回收的载体0sFLA19F/pTCK303溶液6 μ 1，与T4DNA连接酶2 μ I (3U/ μ I)、IOx连接酶缓冲液2 μ I混和，16°C连接16小时，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序。
[0042]该质粒为将序列表中的序列3所示的DNA分子插入pTCK303载体的Spe I和BamH间得到的质粒，即为含有正反向插入目的片段0sFLA19F和0sFLA19R的重组载体，命名为0sFLA19RNAi (0sFLA19RNAi载体结构图谱如图2所示)。
[0043]序列3所示的DNA分子由正向片段、内含子和反向片段组成，正向片段为序列表中序列3自5’末端第884-1199位核苷酸(即为序列表中序列I自5’末端第713-1028的核苷酸)，内含子序列表中序列3自5’末端第394-871位核苷酸；反向片段为序列表中序列3自5’末端第16-331位核苷酸。序列3所示的DNA分子编码的RNA为单链RNA或者双链RNA，该RNA为序列表的序列4所示的RNA分子或与序列表的序列4反向互补的RNA分子。
[0044]实施例2、干扰0sFLA19编码基因表达转基因水稻的获得及表型研究
[0045]一、干扰0sFLA19编码基因表达转基因水稻的获得
[0046]1、干扰0sFLA19编码基因表达转基因水稻的获得
[0047]遗传转化:参照电激仪(EasyJecT Plus电激仪，英国EquiBio公司)操作指南，将质粒0sFLA19RNAi用电击法转化农杆菌EHA105 (Biovector C0.,LTD公司目录号Biovec-ΙΙ)，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的RNAi工程菌，命名为EHA105/0sFLA19RNAi。
[0048]水稻阳性苗的筛选:将EHA105/0sFLA19RNAi 导入水稻 Kitaake (Oryza sativaL.cv Kitaake,野生型水稻)的愈伤组织,将该愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基(在附表中)上，筛选一代。两周后，转移至N6D2S2培养基(见表1)上筛选二代(2周/代)。取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基(见表1)上，在分化培养箱(12小时光周期，白天28°C，夜晚25°C)中培养7天；然后转移至分化培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基(见表1)上生根壮苗。待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得7个共21棵TO代转OsFLA19RNAi水稻株系。
[0049]表1水稻组织培养和转化过程中使用的培养基及其成分
【权利要求】
1.一种RNA分子，为如下(a)或(b): (a)序列表的序列4所不的RNA分子； (b)与序列表的序列4反向互补的RNA分子。
2.编码权利要求1所述RNA分子的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子包括片段F、内含子和片段R ;所述片段R为OsFLA19蛋白编码基因中的任意一个片段；所述片段F的核苷酸序列为所述片段R的反向互补序列；所述OsFLA19蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2 ;所述OsFLA19蛋白编码基因的核昔酸序列为序列表中的序列I。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于: 所述片段R的核苷酸序列为序列表中的序列I自5’末端第713-1028位核苷酸或序列表中的序列3自5’末端第884-1199位核苷酸。
5.权利要求2-4中任一所述的DNA分子，其特征在于: 所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列表中的序列3自5’末端第16-1199位核苷酸。
6.含有权利要求2-5中任一所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7.权利要求1所述的RNA分子或权利要求2-5中任一所述DNA分子或权利要求6所述的重组载体在沉默或失活目的植物中OsFLA19蛋白编码基因表达中的应用；所述OsFLA19蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述OsFLA19蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于:所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
【文档编号】C12N5/10GK103923919SQ201310009914
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月10日 优先权日:2013年1月10日
【发明者】种康, 陈丽萍, 马岩, 徐云远, 赵原 申请人:中国科学院植物研究所