专利名称：抗猪流行性腹泻病毒pedv的反义核酸及肽核酸pna的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，尤其是针对PEDV中N和S两种主要蛋白基因的保守区域涉及的病毒特异性的反义核酸序列以及由该核酸序列制备的肽核酸PNA。
背景技术：
猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的，以腹湾、呕吐、脱水为主要特征，是一种高度接触性肠道传染病。各种周龄、各个品种猪均可感染此病，其中对哺乳仔猪、架子猪及育肥猪影响最大，发病率高达100%，成年母猪发病率在15% 90%。PEDV发病特点为“日龄小，症状重，日龄大，症状轻”，发病急，流行快。I周龄哺乳仔猪通常会在腹泻3 4d后脱水死亡，病死率约50%。断奶猪、育肥猪症状较轻，腹泻可持续4 7d，成年猪仅发生呕吐和厌食。病猪是主要传染源，PEDV随粪便排出后，随PEDV污染的环境、饲料、饮水及用具等而感染，在发病规律上，其途径主要通过消化道。通常是大猪舍首发，发病后病猪水样腹泻，粪便呈草绿色，有恶臭，随后诱发全群腹泻，继而波及相邻猪舍并引起全场或某一地区相继感染发病。PED是世界范 围内发生的猪病之一，1971年英国首次被报道了 PED的发生，此后比利时、加拿大、德国、匈牙利、韩国及日本等多个国家相继报道了 PED的发生，PED每年均造成严重的经济损失。当前PED发生率居高不下，发病情况也越来越复杂，常出现与其它病毒混合感染的现象，因而倍受广大研究人员的重视。我国在1976年首次报道PED的发生，在20世纪80年代我国就不断的有PED的发生，发病区域遍及全国各省份，已报道该病在我国26个省市自治区均有发生。PED在国内常年发生，发病季节以秋、冬、春季多发。近年来，本病的流行区域有逐渐扩大的趋势。目前，PED已成为我国养猪业重要的腹泻病之一。随着集约化养殖规模的不断扩大，给该病的传播创造了有利条件。目前，主要采用疫苗接种来预防和控制该病。目前针对PED的疫苗主要有以下几种形式组织灭活苗、PED细胞灭活苗、PED弱毒苗、转基因植物疫苗、乳酸杆菌疫苗等。在欧洲和其他很多地区的血清学调查显示，PEDV毒株只有I种血清型，且尚无迹象表明存在不同的PED血清型。在长期流行的过程中，病毒为了更好地适应地区的环境差异，会随所处环境条件的改变而发生变异。因而要防控住该病毒的流行，需要开发特异性的药物。1991年国际病毒分类委员会(ICTV)第五次报告将PED列为冠状病毒属的可能成员，1995年第6次报告将其列为冠状病毒属的正式成员。PEDV属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae) α 冠状病毒属(A^pAacoronaVi^rus)的成员，具有囊膜的不分节段的单股正链RNA病毒。PEDV的基因结构及功能PEDV基因组是单股正链RNA，基因组核酸具有感染性，基因组结构与其他冠状病毒相似，5’端有一个帽子结构(cap)，3，端有一个Poly(A)尾，基因组全长为27000 33000nt (PEDV参考毒株CV777基因组大小为28 033 nt)。基因组5’端非翻译区(5’ UTR)位于复制酶多聚蛋白基因上游，大小为296 nt;5’UTR内含有长为65 98 nt的前导序列(L)和以AUG为起始密码子，同时拥有Kozak序列(GUUCaugC)和编码12个氨基酸的开放阅读框架(0RF)。迄今为止，除人冠状病毒HCV 229E外，已报道的其他冠状病毒成员都有Kozak序列,但序列有所差异。基因组3’端非翻译区(3’ UTR)长度为334 nt,末端连有Poly (A)序列，3’ UTR内含有由8个碱基(GGAAGAGC)组成的保守序列，起始于poly(A)上游的73 nt处，所有冠状病毒成员都包含这个序列，但在基因组中位置不同。PEDV基因组靠近3’端5kb区域内有5个主要的开放阅读框(0RF),编码4种结构蛋白:S蛋白(spike protein), sM蛋白(small membraneprotein),M 蛋白(membrane protein)和 N 蛋白(nucleoportein),位于 sM基因上游的 ORF,命名为0RF3，0RF3基因长675 nt，编码非结构蛋白，在每两个相邻基因之间有基因间隔序列(interval sequence, IS),它与基因组和亚基因组mRNA的L序列3’端有7 18 nt相同，在病毒基因组复制和翻译过程中发挥重要作用。复制酶多聚蛋白基因占全基因组2/3，长20 346 nt,包括ORFIa (12 354 nt)和ORFIb (8 037 nt) 2个开放阅读框架，二者之间有46 nt的重叠序列，重叠处有滑动序列(UUUAAAC)和假结节结构，它们能使核糖体进行移码阅读(frameshifting)从而保证基因I的正确翻译。PEDV基因组结构如
图1所示。蛋白
PEDV的N基因是已鉴定的ORF中最大的一个。N基因长达1700bp，编码一个441个氨基酸多肽。N基因处于PEDV基因组3’端，N基因的3’端和poly(A)尾之间有一个11个核苷酸的序列，这一序列在已测序的其它冠状病毒中都较保守。PEDV基因组的3’端这11个核苷酸的序列保守，为病毒复制过程中RNA负链合成的识别位点。N基因的5’端也存在一个类似于内部保守基因的7bp的序列。PEDV的N基因是最早被克隆的，所以对N基因的研究也较为详细。适应细胞生长的PEDV N基因含有三个内部开放阅读框(internal openreading frames, I 0RF)，分别被命名为1- 1( 113个密码子)，1- 2( 63个密码子)和1- 3( 72个密码子)，此三个I ORF均绝对保守。N蛋白为磷蛋白， 相对分子量为57kD。病毒感染细胞中N蛋白含量最为丰富。该蛋白等电点(Pl)高，缺少糖基化和RNA结合位点。此蛋白同其它冠状病毒MHV、IBV、HCV 0C43和 BCV 的一致性为 12% 19%,同 FIPV、CCV、PRCV、TGEV 和 HCV229E 的一致性为 32% 37%。PEDV与HCV229E的N蛋白最接近。N蛋白能与病毒多聚酶作用，或许还有可能同细胞因子作用，从而改变宿主细胞的转录。蛋白
PEDV的S( spike)蛋白由S基因编码。该基因的启动密码子通常并不是用于启动蛋白质的合成，而是翻译分子量为151 kD的1383个Aa的多肽，此多肽含有29个潜在的糖基化位点，缺乏蛋白水解位点。生物信息学预测表明，PEDV S基因大多数糖基化位点都具有生物学意义。对S基因的序列保守性分析表明，PEDV S基因与HCV229E的序列分别有60.6% ( S2区)和37. 0% (SI)相同;%TGEV，FIPV和CCV相比，S序列则分别有59. 6% -60. 0% (SI)和 35. 5%- 35. 9% (S2 区)相同。PEDV 和 HCV229E 旁侧序列 KWPffffVWL 相同，该序列与KWPWYVWL相比仅有一个氨基酸不同，后者在迄今所测定的所有S蛋白基因中都显示了保守性。S蛋白在免疫介导中起着重要作用，S蛋白还具有其它生物学作用，如识别靶细胞，促进病毒和细胞膜的融合。反义核酸(antisense nucleic acid)是一段与革E基因(mRNA或DNA)的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在复制、转录和翻译水平调节靶基因的表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA，进而使其功能丧失。反义核酸包括反义RNA (antisense RNA)和反义DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力强等特点。反义核酸作为一种新的抗病毒、抗肿瘤药物，掀起了一场药理学领域的革命，即新的药物受体mRNA通过新受体结合方式(Watson-Crick杂交)、引发新的药物受体结合后反应(I) RNase H介导的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。可以说反义寡核苷酸(ODNs)疗法比传统的药物治疗手段有更高的特异性。从二十世纪70年代末到现在，在这三十年的时间中，反义核酸药物已走出实验室，进入了实际临床应用。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen通过FDA批准上市后,人们对反义疗法尤为关注。反义核酸作用原理基于碱基配对原则，可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有①反义RNA与病毒mRNA结合形成互补双链阻断核糖体与病毒mRNA的结合，从而抑制了病毒mRNA翻译成蛋白质的过程。②反义DNA能与祀基因形成一种三链核酸(triple helix nucleic acid),它通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，对基因的转录进行调控。③反义核酸与病毒mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输。④反义核酸与病毒mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别降解，从而大大缩短mRNA的半衰期。上述四种作用途径都可表现为对病毒基因表达的抑制或调控，且这种调控是高度特异性的。反义核酸是通过碱基互补配对的原理来识别所打靶的基因，从理论来分析，研究人员以动物细胞为例，其染色体大约有几十亿对碱基，如果4个碱基(A、G、C和T)的数目大致相同，并在整个基因中随机分布，那么按照统计学原理，大于17个碱基的反义核酸与非靶基因杂交的可能性不大，所以长度超过17个碱基的反义核酸分子与靶基因的结合可以说是唯一的，从而使反义核酸具有高度的特异性。研究表明，在细胞内部一个拷贝的基因会产生200-300条mRNA，翻译出10万个具有生物活性的蛋白质分子。传`统药物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某结构域上的几个作用位点，事实上蛋白的结构是非常复杂的，且在生物体内，活性蛋白的空间结构又是千变万化的，以传统药物有限的几种作用位点来控制靶分子的动态的和整体的功能很难达到理想的效果，因而不难看出传统药物的局限性。由mRNA可翻译出几十到几百个蛋白，反义核酸在mRNA水平对靶基因直接进行调控，这个步骤相当于将传统药物作用放大了数十到数百倍，可见反义核酸的调控是极其经济合理的。毒理学研究表明，反义核酸在体内具有很低的毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。与传统药物相比，反义核酸药物具有特异性强，效率高和毒副作用低等优点，在抑制肿瘤生长和抗病毒复制等方面显现出了良好的应用价值。目前已有多个药物进入美国和欧洲市场，另还有30多种反义核酸药物正在进行临床前期的研究或开发后进入了1、II和III期实验。由于动物体内存在大量的核酸外切酶，反义核酸若不经过化学修饰，很快就被降解，失去活性。目前对反义核酸的化学修饰有很多方法，常见的有硫代修饰反义核酸及2’-甲氧基修饰反义核酸等。且目前硫代修饰药物的研究最为全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同时可促进核酸酶Rase H的活性，目前这种修饰方法已成功用于临床的反义核酸药物。但这些还只是第一代反义核酸的修饰方法，随着技术的发展与进步，新的修饰途径与方法被开发出来，使得反义核酸的研究进入了第二、三代，其中肽核酸的修饰最为引人关注。肽核酸(peptidenucleic acids, PNAs),是一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA类似物，其骨架的结构单元为N (2-氨基乙基)-甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N上。尽管PNA在结构上相对寡核苷酸有了显著的改变，但PNA与互补核酸之间的结合仍遵循碱基互补配对原则，甚至比天然核苷酸具有更高的亲和性。PNA可序列特异性地靶向作用于DNA或RNA，为反义核酸的第二、三代产品。PNA与对应的DNA或RNA形成稳定的PNA-DNA或PNA-RNA结构，这种结构非常稳定，几乎不受环境因素变化的影响，如离子，PH值等。近年来，科研人员对最初开发出的PNA进一步优化，在结构方面作了很大改进(如骨架结构、在N-(2-氨基乙基)甘氨酸上连接手性和非手性的基团、碱基的类型等)，提高其生物学稳定性和利用度、靶结合特性以及药代动力学特性，并将PNA应用于诊断和治疗等方面。壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有来源丰富、无毒、易化学修饰性、生物相容性和可再生性等优越的功能性质和独特分子结构。壳聚糖作为可生物降解材料用于新型给药系统，通过改变给药途径可大大提高药物疗效，具有控制释放、增加靶向性、减少刺激和降低毒副作用以及提高疏水性药物通过细胞膜、增加药物稳定性等作用特点。
煢*糖猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，发病急，流行快，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为主要特征。尽管研制出了抗PEDV的灭活疫苗和弱毒疫苗，但由于近几年PED的流行特点和发病情况出现了很大的变化，给防治工作带来了许多困难，对养猪业造成巨大的经济损失。开发预防和治疗PEDV感染的新手段显得尤为迫切，本发明率先将肽核酸技术与反义核酸技术结合起来，并运用于预防和治疗猪流行性腹泻病 毒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对PEDV (N和S)两种主要蛋白基因的保守区域设计的病毒特异性的反义寡核苷酸序列，采用特定工艺合成、肽修饰及壳聚糖包装反义寡核苷酸，使其具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的疗效。为解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案是该反义核酸选自下列核酸序列中的一组或多组的组合N-1:5，-ttctaaggtacttgcaaataacg _3，
N-2:5’ -ctcctacttcacgtgcaaattca _3’
N-3:5’ -ctcttacgagattacatacaatt -3’
S-1:5，-gtgaaaaccagggtgtcaattca _3，
S-2:5’ -tcgtaattgcctatttaacaaag _3’
S-3:5’ -ttcttaaagtggatacttacaad-3’。反义核酸序列如下表所示
权利要求
1.一种抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，该反义核酸选自下列核酸序列中的一组或多组的组合N-1: 5，-ttctaaggtacttgcaaataacg _3，；N-2: 5’ -ctcctacttcacgtgcaaattca _3’ ；N-3: 5’ -ctcttacgagattacatacaatt -3’ ；S-1: 5，-gtgaaaaccagggtgtcaattca _3，；S-2: 5’ -tcgtaattgcctatttaacaaag _3’ ；S-3: 5’ -ttcttaaagtggatacttacaad’。
2.如权利要求1所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，其特征在于，所述反义核酸制备成肽核酸PM。
3.如权利要求2所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，其特征在于，所述肽核酸PNA与咪唑丙烯酸壳聚糖UAC制成UAC-PNA纳米分子微囊。
4.如权利要求2所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，其特征在于，采用壳聚糖对肽核酸PNA进行化学修饰。
5.如权利要求4所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，其特征在于，采用控释制药工艺将经修饰过后的肽核酸PNA制成结肠溶控释微丸制剂。
6.如权利要求4所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，其特征在于，采用冷冻干燥制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成注射用冻干制剂。
7.如权利要求4所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，其特征在于，采用冻干后再制粒工艺将经修饰过的肽核酸制备成口服用水溶性颗粒剂。
8.如权利要求5飞任一项所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，其特征在于，制剂中还含有可药用载体或赋形剂。
9.如权利要求1所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸在制备动物药物上的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于防控猪流行性腹泻病毒PEDV的特异性抗病毒肽核酸PNA，针对PEDV中N和S的基因保守部分设计高效特异性的反义核酸序列，并采用特定工艺人工合成肽核酸片段，该序列与上述保守性靶基因互补，根据碱基互补原理，反义核酸序列特异性地与PEDV中的N和S对应的靶基因相结合，诱导核酶对靶基因进行降解，从而阻断靶基因的转录与表达，抑制PEDV在机体内复制与装配，以达到防控猪流行性腹泻的目的。本发明还涉及含有该反义核酸序列的药物组合物，及其在动物药物上的用途。本发明无毒副作用，无耐药性，能特异性直接抑制PEDV复制，抗病毒效果好，无药残等食品安全问题。
文档编号C12N15/113GK103060325SQ20131001246
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者韩健宝, 曲向阳, 顾宏伟, 王远孝, 马国辅 申请人:韩健宝