茄属物种鉴定基因、引物及检测方法
【专利摘要】本发明提出以核基因waxy为主要基因序列，辅以其他叶绿体基因序列如trnS-trnG，ndhF等，用于茄属植物物种鉴定，并提供了核基因waxy的序列合成引物，本发明还进一步提供了进境检疫性4种茄属杂草及其他茄属外来杂草的检测方法。本发明特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为检测茄属物种提供方法，也为防范外来生物提供了保证。
【专利说明】茄属物种鉴定基因、引物及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测【技术领域】，具体地说涉及茄属物种分子鉴定基因序列及其PCR引物和检测方法。
【背景技术】
[0002]茄属全世界有1400余种，大多起源于南美，分布广，适应性强，部分入侵性杂草危害性大，其中有4种已被列我国列为进境检疫性杂草，另外有30余种具有潜在危害性。然而该类群形态变异复杂，物种鉴定极其困难，特别对于外来种的鉴定，问题尤为突出。
[0003]DNA条形码技术可以克服因物种缺乏足够的性状信息和表型可塑性等因素影响物种准确鉴定的问题，因此该技术已经成为物种鉴定最具前景的发展方向。目前在动物鉴定领域一段线粒体COI序列已经成为公认的通用序列应用于实际鉴定。然而，在陆生植物中至今还没有找到可作为通用DNA的分辨力强的可作为条形码的基因序列。主要原因是植物线粒体基因组进化速率慢、遗传变异小，因此线粒体COI序列并不适合于植物；此外，在植物进化历程中的杂交、网状进化以及同一基因在不同类群中进化速率的异质性使植物条形码的研究比动物要复杂的多。近年来，各国诸多学者提出了众多植物DNA条形码的候选序列及其组合，例如叶绿体基因rbcL+matK组合以及核基因ITS被提议作为陆生植物的核心条形码，但它们仅能解决较高阶元(科、属)的鉴定问题，在物种水平分辨率较差，如单个rbcL和matK只能区别不到50%的物种，其组合的分辨力也不足70%。因此目前研究成果的鉴定通用性不理想，都没有达到应用条件。
【发明内容】
[0004]针对上述技术问题，本发明提出了一种PCR扩增引物，其一对核苷酸序列为:
[0005]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ；
[0006]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'。
[0007]根据本发明的另一方面，提出了一种上述核基因waxy在茄属植物物种鉴定中的用途。
[0008]如上所述的用途中，利用核基因waxy与叶绿体基因组中ndhF基因和trnS_trnG基因组合进行茄属杂交种的鉴定和父母本来源的鉴定。
[0009]根据本发明的另一方面，提出了一种茄属物种的检测方法，包括:1.提取样品总DNA ；i1.利用权利I所述引物进行PCR扩增；ii1.扩增得到权利要求2所述核基因waxy序列；iv.经测序分析构建系统发育树；v.根据样品在系统发育树上的位置及聚合、分离状况判定结果；以及v1.当被鉴定样品为杂交种时，利用上述基因组合共同分析判定结果。
[0010]本发明所述基因，其种间变异大于种内变异，可有效检测茄属所有物种；其“引物”扩增效果好，检测方法快速简单，为防范外来生物提供了技术保证。
【专利附图】
【附图说明】[0011]图1是本发明利用waxy序列构建的茄属系统发育树；
[0012]图2是本发明利用waxy序列、ndhF基因和trnS-trnG基因共同构建的爺属系统发育树；
[0013]图3是利用本发明鉴定茄属物种银毛龙葵时构建的系统发育树；
[0014]图4是银毛龙葵与它三种近缘种的遗传距离间隔柱状图。
【具体实施方式】
[0015]下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
[0016]本发明提出了一种植物核基因waxy作为茄属物种鉴定的通用DNA序列，并由此设计了该基因的检测引物，并进一步提出了茄属物种的检测方法，有效解决了茄属物种的鉴定问题，可应用推广。
[0017]针对设计引物。所述的引物由一对正向和反向引物组成，其核苷酸序列分别为正向引物WAXYS和反向引物WAXYA2:
[0018]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ；
[0019]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'
[0020]本发明关于茄属物种的检测方法，包括:以样品总DNA为模板，利用waxy序列的检测引物进行PCR扩增，扩增后的测序结果构建系统发育树，根据样品在系统发育树上聚合、间隔状况判定结果。
[0021]根据本发明的一个实施例，提出了一种PCR扩增引物，其一对核苷酸序列为:
[0022]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG T TG ATCG-3'；
[0023]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'。
[0024]根据本发明的另一个实施例，提出了一种上述核基因waxy在茄属植物物种鉴定中的用途。可选地，在如上所述的用途中，利用核基因waxy与叶绿体基因组中ndhF基因和trnS-trnG基因组合进行爺属杂交种的鉴定和父母本来源的鉴定。
[0025]根据本发明的另一个实施例，提出了一种茄属物种的检测方法，包括:1.提取样品总DNA;i1.利用权利I所述引物进行PCR扩增；ii1.扩增得到权利要求2所述核基因waxy序列；iv.经测序分析构建系统发育树；v.根据样品在系统发育树上的位置及聚合、分离状况判定结果；以及v1.当被鉴定样品为杂交种时，利用上述基因组合共同分析判定结
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[0026]以下根据不同的实施例对本发明的技术方案详细说明。
[0027]理想的物种鉴定通用DNA序列应该种间遗传变异大于种内变异，且自身短小，便于扩增和测序。本发明根据上述原则确定核基因waxy序列为茄属物种鉴定的主鉴定序列。
[0028]图1是利用本发明确定的waxy序列构建的爺属系统发育树。虽然爺属物种上千种，本示例覆盖了茄属9大支系的48个种类，且其中部分种类存在若干重复，可以合理预见其分辨结果对于茄属物种具有很好的鉴定能力。从图1可以看出，包括4种检疫性外来物种在内的68个样品得以成功区分鉴定，重复样品成功聚合在一起，而亲缘种之间存在明显的遗传距离，即waxy序列在茄属种间变异大于种内变异，达到通用检测序列的理想要求。
[0029]当发生种间杂交等特殊情况时，样品仅通过waxy序列系统发育树不能得到准确鉴定。如图1中有3个样品与认为属于相同物种的样品在系统发育树上没有发生聚合，而是产生间隔，这时需辅以叶绿体trnS-trnG和ndhF基因序列构建的系统发育树共同分析。图2中右边是利用本发明构建的waxy序列系统发育树,左边是构建的叶绿体trnS-trnG和ndhF系统发育树。由于叶绿体基因母系遗传、核基因双亲遗传，因此构建的2个系统发育树可对茄属杂交物种及其父母本来源进行鉴定。图1中未能得到准确鉴定的3个样品通过在图2中的位置分析可知S.macrocarpon7是一个母本为S.macrocarpon父本为S.rostratum的杂交种；名为S.virginanum的两个样品均不是杂交种，至少其中之一为错误鉴定样品。
[0030]本发明还进一步针对waxy序列设计引物。所述的引物由一对正向和反向引物组成，其核苷酸序列分别为正向引物WAXYS和反向引物WAXYA2:
[0031]WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ；
[0032]WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3' [0033]实施例
[0034]检疫性杂草银毛龙葵的鉴定
[0035]爺属分子系统学研究表明银毛龙葵属于爺亚属分支(Leptostemonum),该分支有350-450种，在进化关系树上分属于10个亚支，银毛龙葵属于银毛龙葵亚支(Elaeagnifolium Clade)。本发明收集了 5个银毛龙葵不同来源个体及其多个近缘种,共16种26份样品，这些样品覆盖了茄亚属10亚支中的9支(表1)。样品来自口岸截获、口岸周边监测、与国外标本馆交换或从国外种子公司购买。
[0036]表1.实验材料
【权利要求】
1.一种PCR扩增引物，其一对核苷酸序列为:
WAXYS:5/ -ACT GCT ATA AAC GTG GGG TTG ATC G-3/ ； WAXYA2:5/ -TGG AAC CAA CAT AAA ATC AGC-3'。
2.核基因raxy在茄属植物物种鉴定中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，利用核基因raxy与叶绿体基因组中ndhF基因和trnS-trnG基因组合进行茄属杂交种的鉴定和父母本来源的鉴定。
4.一种爺属物种的检测方法，其特征在于: i.提取样品总DNA ； ii.利用权利I所述引物进行PCR扩增； ii1.扩增得到权利要求2所述核基因waxy序列； iv.经测序分析构建系统 发育树； V.根据样品在系统发育树上的位置及聚合、分离状况判定结果； v1.当被鉴定样品为杂交种时，利用权利要求3所述基因组合共同分析判定结果。
【文档编号】C12Q1/68GK103937784SQ201310018341
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月18日 优先权日:2013年1月18日
【发明者】范晓虹, 张伟, 邵秀玲 申请人:中国检验检疫科学研究院