Ca6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法

文档序号:537841阅读:272来源:国知局
专利名称:Ca6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法
技术领域
本发明涉及鼠抗-CA6糖表位(glycotope)单克隆抗体及其人源化或表面重构形式(humanized or resurfaced versions)。本发明也涉及抗_CA6糖表位单克隆抗体的表位结合片段(epitope-binding fragments),以及抗-CA6糖表位单克隆抗体的人源化或表面重构形式的表位结合片段。
本发明进一步涉及包含细胞结合剂和细胞毒性试剂的细胞毒性偶联物,包含所述偶联物的治疗组合物,应用所述偶联物来抑制细胞生长和治疗疾病的方法,及包含所述细胞毒性偶联物的试剂盒。具体而言,细胞结合剂为单克隆抗体或其表位结合片段,其识别并结合CA6糖表位或其人源化或表面重构形式。
背景技术
对开发抗癌治疗剂已经有很多的尝试,抗癌治疗剂需要特异性地靶向癌细胞,而不伤害周围的非癌细胞和组织。这样的治疗剂有潜力极大改善在人患者中的癌症的治疗。
一个有前景的方法是连接细胞结合剂例如单克隆抗体与细胞毒性药物(Sela等,在 Immunoconjugatesl89_216 (C.Vogel, ed.1987) ;Ghose 等,在 Targeted Drugsl-22 (E.Goldberg, ed.1983) ;Diener 等,在 Antibody mediated delivery systemsl-23 (J.RodwelI, ed.1988) ;Pietersz 等,在 Antibody mediated delivery systems25-53(J.RodwelI, ed.1988) ;Bumol 等,在Antibody mediated delivery systems55-79 (J.RodwelI,ed.1988)。取决于对细胞结合剂的选择,基于在这样的细胞的表面上所表达的分子的表达情况,这些细胞毒性偶联物可以被设计为仅仅 识别和结合特定类型癌细胞。
细胞毒性药物,例如甲氨蝶呤、柔红霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C和苯丁酸氮芥已被用在这样的细胞毒性偶联物中,其被连接到各种鼠单克隆抗体上。在一些情形中,药物分子通过中间载体分子被连接到抗体分子上,中间载体分子例如血清白蛋白(Garnett 等,46Cancer Res.2407-2412 (1986) ;Ohkawa 等,23Cancer Tmmunol.H-nmunother, 81-86 (1986) ;Endo 等,47Cancer Res.1076-1080 (1980)),葡聚糖(Hurwitz等,2Appl.Biochem.25-35(1980) ;Manabi 等,34Biochem.Pharmacol.289-291 (1985);Dillman 等,46Cancer Res.4886-4891 (1986) ; Shoval 等,85Proc.Nat I.Acad.Sc1.8276-8280(1988)),或聚谷氨酸(Tsukada 等,73J.Natl.Cane.1nst.721-729(1984);Kato 等,27J.Med.Chem.1602-1607(1984) ;Tsukada 等,52Br.J.Cancerl11-116 (1985))。
已经显现出一些前景的特异性偶联物的例子为C242抗体和美登素衍生的DMl的偶联物,C242抗体针对CanAg,CanAg为表达在结肠直肠和胰腺瘤上的抗原(Liu等,ProcNatl Acad Sci USA,93:8618-8623 (1996))。在体外对该偶联物的评价显示,它对表达在细胞表面上的CanAg的结合亲和力很高,其表观Kd值为3X 10_nM,而且它对CanAg阳性细胞的细胞毒性效力(potency)很高,其IC5tl为6 X 10_nM。此细胞毒性是抗原依赖性的,因为细胞毒性作用被过量的非偶联抗体阻断,而且因为抗原阴性细胞对该偶联物的敏感性要低大于100倍。对各自的靶细胞具有高亲和力以及具有高抗原选择性细胞毒性的抗体-DMl偶联物的其它例子包括huN901的偶联物,其为抗人CD56抗体的人源化形式;huMy9_6的偶联物,其为抗CD33抗体的人源化形式;huC242的偶联物,其为抗CanAg Mucl表位的抗体的人源化形式;huJ591的偶联物,其为抗PSMA的脱免疫抗体(deimmunized antibody);曲妥珠单抗,其为抗Her2/neu的人源化抗体;和bivatuzumab,其为抗⑶44v6的人源化抗体。
在不断改进用于治疗癌症患者的方法中,开发特异性识别特定类型癌细胞的其它的细胞毒性偶联物将是重要的。
为了此目标,本发明涉及抗体的开发,所述抗体识别并结合表达在癌细胞表面上的分子/受体,和涉及新型细胞毒性偶联物的开发,所述偶联物包含细胞结合剂例如抗体和细胞毒性试剂,所述细胞毒性试剂特异靶向表达在癌细胞表面上的分子/受体。
更具体而言,本发明涉及位于由癌细胞表达的Mucl粘蛋白受体上的新CA6唾液糖表位(sialoglycotope)的表征,涉及抗体的预备,优选人源化抗体,其识别Mucl粘蛋白的新CA6唾液糖表位,而且在存在细胞毒性试剂的情况下,可以被用来抑制表达CA6糖表位的细胞的生长。
发明概述
本发明包括抗体或其表位结合片段,所述抗体特异性识别并结合Mucl粘蛋白受体的新型CA6唾酸糖表位(sialoglycotope)。在另一个实施方案中,本发明包括人源化抗体或其表位结合片段,其识别Mucl粘蛋白受体的新型CA6唾酸糖表位(“CA6糖表位”)。
在优选的实施方案中,本发明包括鼠抗-CA6单克隆抗体DS6(“DS6抗体”)和DS6抗体的表面重构或人源化形式,其中,在轻链和重链中,抗体或其表位结合片段的暴露于表面的残基被取代,以更接近已知的人抗体 表面。本发明的人源化抗体及其表位结合片段具有改进的性质,因为与完全的鼠形式相比,它们在其被给予的人对象中具有更少的免疫原性(或完全是非免疫原性的)。因此,本发明的人源化DS6抗体及其表位结合片段特异性识别MucI粘蛋白受体上的新型唾酸糖表位,即CA6糖表位,而对人是没有免疫原性的。人源化抗体及其表位结合片段可以与药物例如美登素类(maytansinoid)结合,通过将该药物定向于MuclCA6唾酸糖表位,形成对抗原表达细胞具有特异细胞毒性的药物前体(prodrug)。因此可以使用包含这样的抗体和小的高毒性药物(例如美登素类、紫杉类(taxanes)及CC-1065类似物)的细胞毒性偶联物作治疗剂,用于治疗肿瘤,例如乳房和卵巢肿瘤。
本发明的DS6抗体的人源化形式就以下方面在本文中被完整表征:轻链和重链可变区的各自氨基酸序列,轻链和重链可变区基因的DNA序列,CDRs的鉴定,其表面氨基酸的鉴定和其以重组方式表达的方法的公开。
在一个实施方案中,提供人源化DS6抗体或其表位结合片段,其具有包含CDRs的重链,所述⑶Rs具有SEQ ID NOS:1_3所示的氨基酸序列:
SYNMH (SEQ ID NO:1),
YIYPGNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO:2),
⑶SVPFAY(SEQ ID NO:3),
并具有包含⑶Rs的轻链,所述⑶Rs具有SEQ ID NOS:4_6所示的氨基酸序列:
SAHSSVSFMH(SEQ ID NO:4),
STSSLAS (SEQ ID NO:5),
QQRSSFPLT (SEQ ID NO:6)
也提供了人源化DS6抗体及其表位结合片段,其具有轻链可变区,所述轻链可变区具有这样的氨基酸序列,即,此序列与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性:
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO:7)
EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO:8)。
同样地,提供了人源化DS6抗体及其表位结合片段,其具有重链可变区,所述重链可变区具有这样的氨基酸序列,即,此序列与SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性:
QAYLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFKGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:9)
QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:10)
QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:11)。
在另一个实施方案中,提供了人源化DS6抗体及其表位结合片段,其具有人源化或表面重构的轻链可变区,所述轻链可变区具有对应于SEQ ID NO:8的氨基酸序列:
EIVLTQSPATMSASPGER VTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO:8)。
同样地,提供了人源化DS6抗体及其表位结合片段,其具有人源化或表面重构的重链可变区,所述重链可变区具有分别对应于SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列:
QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:10)
QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:11)。
本发明的人源化DS6抗体及其表位结合片段也可以包括在轻链和/或重链氨基酸残基中的取代,所述取代发生在表I中带星标的残基所定义的一个或多个位置上,所述带星标的残基代表了被发现位于CDR的5埃之内的、需要变为人残基的鼠表面构架残基(murine surface framework residues)。例如,在鼠序列(SEQ ID NO:7)中的第一氨基酸残基Q被E代替(SEQ ID NO:8),以人源化抗体。然而,由于该残基与CDR接近,可能需要回复突变为鼠残基Q,以维持抗体亲和力。
表I
权利要求
1.细胞毒性偶联物,其包含(I)识别和结合Mucl粘蛋白的CA6唾酸糖表位的细胞结合剂和(2)细胞毒性试剂。
2.权利要求1所述的细胞毒性偶联物,其中所述识别和结合Mucl粘蛋白的CA6唾酸糖表位的细胞结合剂是抗CA6抗体或其表位结合片段。
3.根据权利要求2所述的细胞毒性偶联物,其中所述识别和结合Mucl粘蛋白的CA6唾酸糖表位的细胞结合剂是人源化抗CA6抗体或其表位结合片段。
4.根据权利要求2或3所述的细胞毒性偶联物,其中所述细胞结合剂直接地或通过可切割的或不可切割的连接基团与所述抗体或其表位结合片段共价连接。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞毒性偶联物,其中所述识别和结合Mucl粘蛋白的CA6唾酸糖表位的细胞结合剂是包含至少一个重链可变区或其片段和至少一个轻链可变区或其片段的抗体或其表位结合片段,其中所述至少一个重链可变区或其片段包含三个有次序的互补决定区,所述互补决定区分别具有由SEQ ID NO:1、21和3所不的氣基酸序列,和其中所述至少一个轻链可变区或其片段包含三个有次序的互补决定区,所述互补决定区分别具有由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的细胞毒性偶联物,其中所述抗体或其表位结合片段的轻链可变区与由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的氨基酸具有至少90%的序列同一性。
7.根据权利要求5所述的细胞毒性偶联物,其中所述抗体或其表位结合片段的轻链可变区与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性。
8.根据权利要求5所述的细胞毒性偶联物,其中所述抗体或其表位结合片段的轻链可变区具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
9.根据权利要求5所述 的细胞毒性偶联物,其中所述抗体或其表位结合片段的重链可变区与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
10.根据权利要求5所述的细胞毒性偶联物,其中所述抗体或其表位结合片段的重链可变区与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少95%的序列同一'I"生。
11.根据权利要求5所述的细胞毒性偶联物,其中所述抗体或其表位结合片段的重链可变区具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
12.根据前述权利要求任一项所述的细胞毒性偶联物,其中所述识别和结合Mucl粘蛋白的CA6唾酸糖表位的细胞结合剂是人源化DS6抗体或其表位结合片段。
13.根据前述权利要求任一项所述的细胞毒性偶联物,其中所述细胞毒性试剂是紫杉醇、美登素类化合物、CC-1065或CC-1065类似物。
14.根据权利要求13所述的细胞毒性偶联物,其中所述细胞毒性试剂是美登素类化合物。
15.根据权利要求14所述的细胞毒性偶联物,其中所述细胞毒性试剂是美登素化合物DMl 或 DM4。
16.根据权利要求5所述的细胞毒性偶联物,其中所述细胞毒性试剂是美登素化合物DM4。
17.根据权利要求5所述的细胞毒性偶联物,其中所述抗体或其表位结合片段的轻链可变区具有由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,且其中所述抗体或其表位结合片段的重链可变区具有由SEQ ID NO:11所不的氣基酸序列;且 其中所述细胞毒性试剂是美登素化合物DM4。
18.一种治疗组合物,其包含权利要求1-17中任一项所述的细胞毒性偶联物及药学上可接受的载体或赋形剂。
19.权利要求1-17中任一项所述的细胞毒性偶联物或权利要求18所述的治疗组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途,其中所述细胞毒性偶联物是人源化DS6抗体-DMl偶联物、人源化DS6抗体-DM4偶联物或人源化DS6抗体-紫杉烷偶联物。
21.根据权利要求20所述的用途,其中所述细胞毒性试剂是美登素化合物DM4。
22.根据权利要求20所述的用途,其中所述抗体或其表位结合片段的轻链可变区具有由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,且其中所述抗体或其表位结合片段的重链可变区具有由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列; 且其中所述细胞毒性试剂是美登素化合物DM4。
23.试剂盒,包含权利要求1-17任一项所述的细胞毒性偶联物和使用说明。
24.根据权利要求23所述的试剂盒,其中所述细胞毒性偶联物是人源化DS6抗体-DMl偶联物、人源化DS6抗体-DM4偶联物或人源化DS6抗体-紫杉烷偶联物。
25.根据权利要求23所述的试剂盒,其中所述细胞毒性试剂是美登素化合物DM4。
26.根据权利要求23所述的试剂盒,其中所述抗体或其表位结合片段的轻链可变区具有由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,且其中所述抗体或其表位结合片段的重链可变区具有由SEQ ID NO:11所不的氣基酸序列; 且其中所述细胞毒性试剂是美登素化合物DM4。
27.根据权利要求23或24所述的试剂盒,其中所述说明是所述偶联物用于治疗患有癌症的对象的说明。
28.根据权利要求23-27任一项所述的试剂盒,进一步包含用于制备药学上可接受的制剂所必需的成分如稀释剂,如果所述偶联物为冻干状态或浓缩形式的话,和用于施用所述制剂所必需的成分 如稀释剂。
全文摘要
公开了包含细胞结合剂和细胞毒性试剂的细胞毒性偶联物、包含所述偶联物的治疗组合物、使用所述偶联物抑制细胞生长和治疗疾病的方法及包含所述细胞毒性偶联物的试剂盒。特别地,细胞结合剂为单克隆抗体和其表位结合片段,其识别并结合CA6糖表位。本发明也涉及DS6,抗CA6鼠单克隆抗体,及其表位结合片段的人源化或表面重构形式。
文档编号C12P21/06GK103145844SQ201310020230
公开日2013年6月12日 申请日期2004年7月21日 优先权日2003年7月21日
发明者G·佩恩, P·丘, D·J·塔瓦雷斯 申请人:伊缪诺金公司
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