专利名称：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)疫苗重组蛋白抗原i1c及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于人的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原IIC及制备方法和应用。
背景技术：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌指的是对恶唑类青霉素如甲氧西林、苯唑西林和氟氯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌，是一种存在人和动物的体表、鼻咽、会阴部及肠道的革兰阳性菌，通常引发皮肤软组织感染、菌血症以及转移并发症，如肺炎、心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。自1961年被英国学者Jevons首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，其引起的局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20%。因其传播途径广泛，易暴发流行，又由于其致病性强，变异性大，且呈多重耐药而成为临床上治疗的难点，被称为“超级细菌”，这一特点使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。在国外，2005年美国的MRSA感染监控资料显示，美国全年的严重感染人数为9.4万多人，致死病例约为1.9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。在国内，2010年中国CHINET细菌耐药性检测网结果显示，国内主要地区14所教学医院，MRSA平均检出率为51.7%，最高为77.6% ；2008年中国CHINET细菌耐药性监结果显示，国内主要地区12所教学医院MRSA平均检出率为55.9%，最高为77.5%，属于MRSA感染的严重国家之一。以上海为例，2004年该地区14所医院金黄色葡萄球菌中MRSA的平均检出率为63.9%，最高为86.5%，而2006年MRSA的平均 检出率为64.6%，最高达92.5%。由此可见，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌正在全球蔓延，其感染率和死亡率不断攀升，严重威胁人类健康。目前，万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相继被分离出来，可见抗生素的发展远远跟不上细菌耐药性的发展，使得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。目前，美国研发的MRSA疫苗已进入III期临床试验阶段，因此，研发具有自主知识产权的、高效、安全、经济的MRSA疫苗对控制MRSA感染、耐药性发展、生物恐怖防御和提高国际竞争力具有重要意义。由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致病因子包括荚膜多糖、ClfA, IsdB、肠毒素、TSST-U α-溶血素以及凝固酶等数十种，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB是一种外膜蛋白抗原，IsdB不仅是MRSA—个重要外膜锚钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。ClfA是一种调节金葡菌与纤维蛋白素的结合，促进金葡菌同生物材料表面、血块、血小板、内皮表面结合的黏附素。在金葡菌与血小板的结合中ClfA也起着重要的作用，在导管诱导所致金葡菌心内膜炎的动物模型中，其相互作用也很关键。ClfA和IsdB都是MRSA的外膜蛋白成分，具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。由于ClfA全蛋白具有纤维蛋白结合活性，不适宜做为疫苗候选抗原，本研究利用生物信息技术筛选到不能与纤维蛋白结合的结构域C。同时筛选出IsdB的结构域II。通过理论设计及实践优化，选择到能有效将两者结合起来并使融合蛋白具有良好免疫活性的连接肽。最后形成IlC重组蛋白。目前尚未见使用ClfA、IsdB选择一个亚单位的活性功能片段的融合蛋白作为免疫原性材料，制备MRSA双价疫苗的报道。
发明内容
针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性的问题，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组融合蛋白11C，该融合蛋白纯度高，表达量高，便于分离纯化，高效安全。本发明所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组融合蛋白11C，由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的一个活性片段(Il)与ClfA抗原分子的一个活性片段(C)组成，活性片段Il与活性片段C通过连接肽融合而成。重组蛋白IIC的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ IDN0:2所示。活性片段Il的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。活性片段C的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。连接肽氨基酸序列结构为-(GGGGS) η-,或-(GGSGG) η-，或(YAPVDV) η-,或-(YVPVDV) η-,所述 η 为 I。所述连接肽氨基酸序列结构优选-YVPVDV-。上述重组融合蛋白的制备方法包括以下步骤:I)全基因合成编码IlC的DNA序列，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成；2)所合成的目的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；表达载体为pGex系列载体，或pET系列载体，或pQE系列载体，优选为pGeX-6P_2。宿主菌为大肠杆菌XLl-blue、BL21系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌XLl-blue。3)诱导转化后的宿主菌表达IlC重组蛋白。本发明优选采用pGEX-6p_2载体来构建重组表达载体，表达重组蛋白IlC，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体,其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，PGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。上述重组融合蛋白的分子量、N末端及C末端15个氨基酸检测由上海中科新生命生物科技有限公司完成。检测 结果:分子量为34909.6，符合理论预期(附图2) ;N末端及C末端氨基酸序列与理论预期完全一致。本发明还提供一种重组蛋白IlC在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。本发明还提供一种重组蛋白IlC在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。本发明采用基因工程技术克隆表达此截短的保护性抗原成分IlC蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。该重组蛋白Iic可以直接与佐剂(如Al (OH)3佐剂、MF59、A1P04、A1S03、A1S04、不完全弗氏佐齐[J、完全弗氏佐齐[J、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点:I)重组蛋白表IlC达质粒在原核表达系统一大肠杆菌中诱导表达；2)选择pGEX载体系列时,重组蛋白IlC以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；纯化出来的重组蛋白IlC纯度大于 95% ；3)重组蛋白IlC均能够诱导动物产生特异性的抗体。本发明重组蛋白IlC的制备方法简捷、容易放大、重复性好，所述融合蛋白辅以铝佐剂后，可制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗以及制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂盒,通过动物试验验证,可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好抗MRSA感染的免疫保护作用。利用本发明重组蛋白IlC制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感 染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1表示重组融合蛋白IlC纯化结果，其中，泳道M:蛋白分子量标准(Marker)，泳道1:酶切后，在上清获取的目的蛋白；图2是重组融合蛋白IlC的分子量测定结果。
具体实施例方式本发明所使用的菌株与各种试剂如下:1.菌株、质粒金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；菌株XL-1blue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品；BL21 (DE3)，HMS (174)质粒pGEX-6p_2 为美国 GE Healthcare 公司产品；质粒pET_22b为美国Merck公司产品；
2.试剂primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶 BamH I 和 Not 1、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；细菌基因组提取试剂盒、DNA超薄回收试剂盒为天根公司产品；T4DNA Ligase 为 Fermentas 公司产品；谷胱甘妝-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose4B为美国GE Healthcare公司产品O3.实验动物SPF级4 6周龄，雌性BALB/C小鼠，购自北京华阜康公司。实施例1:11C的DNA序列由上海捷瑞生物技术有限公司合成并构建至载体PGEX-6P-2 及 pET22b 上，同时分别转化宿主菌 XL-lblue，BL21 (DE3)，HMS (174)。实施例2 =IlC多亚单位在原核表达系统一大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定1.目的蛋白诱导表达I)取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-1lC/XL-lblue菌液100 μ L加入IOmLAmp抗性的TB培养基中，80rpm37°C过夜培养，分别取过夜培养的菌液400 μ L加入20mLAmp抗性的TB培养基中(余下的菌液保存在4°C 冰箱中备用)，37°C培养2 3h，转速200rpm，二次活化至0D600为0.6 0.8时，加入IPTG40yL，使其终浓度为200 μ M，再置于摇床诱导表达16°C过夜诱导表达。2)将诱导表达后的菌液取出，以6000rpm离心15min,弃去上清,加入ImLlysisbuffer混勻，超声裂解3min (超声6次30s/次)，再4°C 14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。2.处理上清取Glutathione Sepharose4B20 μ I,用PBS洗漆3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose4B中，4°C旋转过夜结合(或室温结合lh)。在4°C下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的GlutathioneSepharose4B 加入 20 μ L5X 蛋白质上样 buffer,煮沸 5min, 14000rpm 离心 30s。3.处理沉淀在沉淀中加入500 μ L lysis buffer重悬菌体,取80 μ L重悬菌液加入20 μ L5 X蛋白质上样buffer,煮沸5min, 14000rpm离心30s。4.SDS-PAGE电泳，将5%浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入12%分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。5.将处理好的上清和沉淀分别取10 μ L上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80ν电泳30min，再调至180v，电泳f 2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果。重组蛋白为可溶性蛋白，且16°C下目的蛋白的表达量最高，其纯度达到95%以上。实施例3:11C抗原的制备
1.放大培养获取蛋白取保存在4°C冰箱中备用的pGEX-6P-2-1lC/XL-lblue菌液400μL加入到 20mL含Amp抗性的TB培养基中进行一次活化，200rpm37°C培养5飞h后，取8mL —次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的TB培养基中进行二次活化，37°C培养3 4h至0D600为0.8时，力口入80M1 IPTG (终浓度为200uM)置于16°C摇床中过夜诱导后，6000rpm离心15min收集菌体，再加20mL lysis buffer重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min (200V)，收集上清与800 μ L用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose4B凝胶珠(beads)结合处理。2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取IlC目的蛋白向余下约800 μ L已结合蛋白的Glutathione Sepharose4B中加入800 μ L PBS和120 μ L PreScission protease(PP酶)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800 μ L PBS洗涤3次，各后取10 μ L样品变性处理后，上样5 μ L进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切前GST融合蛋白分子量在90kDa左右，酶切下来的IlC蛋白分子量在43_55kDa之间，与预期蛋白分子量35kD不符，电泳结果不于图1。实施例4:1IC的质量检定将纯化后的IlC送上海中科新生命生物科技有限公司进行分子量、N端及C端15个氨基酸序列测定。分子量结果如图2所示，为34909，与理论分子量35018是吻合的。N端及C端15个氨基酸序列与预期的完全一致。表明获得了预期蛋白，也表明本蛋白在SDS-PAGE上表现出的分子量不是其真实分子量。 实施例5:感染用金黄色葡萄球菌菌株(国际标准株MRSA-252)标准定量曲线的建将菌株接种于MH平板置于37°C孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37°C恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心IOmin收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光系统下测定各菌液的在600nm处的吸光度(0D600)，并取各个稀释度的菌液100 μ L涂布于MH平板，置于37°C孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的0D600值绘制标准定量曲线。结果:标准曲线公式为Y=2.3065X+0.0051 (109CFU/ml)，相关系数为0.9999。实施例6:脓毒血症动物模型的构建SPF级BALB/C4 6周龄雌性小鼠120只，分成阳性对照组、实验组、阴性对照组、空白对照组，购于北京华阜康公司。1.将菌株接种于MH平板置于37°C孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37°C恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液稀释(或浓缩)为 2.0X10lclCFU/mL、l.5X 1010CFU/mLU.25X 10lclCFU/mL、
1.0X 101(lCFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过尾静脉注射6 8周龄、体重为18 20g的BALB/C小鼠(100 μ I/只)进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察7天并统计各组小鼠的死亡率；2、感染后计时每隔24小时(至感染后7天)采用菌落计数法对细菌定植量进行检测:从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样0.5 lmL，取20 μ L血样用180 μ L肝素稀释10倍后用于细菌计数,取50 μ L涂于平板,置于37°C, 24h后计数克隆数；取完血样后将小鼠处死放入75%酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖，取出脾、肾、肝脏，置于2mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取ImL均浆按照1:10、1:100、1:1000比例进行稀释；每稀释度各取100 μ L轻轻涂布于固体培LB养基上，置于37°C，培养24h，做菌落计数。结果显示于表1:表1MRSA-252最小致死剂量与亚致死剂量的确定
权利要求
1.一种重组融合蛋白11C,其特征在于:该融合蛋白由MRSA铁尚子表面决定蛋白IsdB的一个活性片段Il与ClfA抗原分子的一个活性片段C通过连接肽融合而成。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白I1C，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，核酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3.根据权利要求1所述的重组蛋白I1C，其特征在于，所述活性片段Il的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
4.根据权利要求1所述的重组蛋白I1C，其特征在于，所述ClfA抗原分子活性片段C的核酸序列如SEQ I D NO:5所示,氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
5.根据权利要求1所述的重组蛋白I1C，其特征在于，所述连接肽氨基酸序列结构为-(GGGGS) n-，或-(GGSGG) η-,或(YAPVDV) η_，或-(YVPVDV) η-,所述 η 为 I。
6.根据权利要求5所述的重组蛋白I1C，其特征在于，所述连接肽氨基酸序列结构为-YVPVDV-。
7.权利要求1所述的重组融合蛋白IlC的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)全基因合成，以获得编码IlC的DNA序列； 2)将所获得的IlC基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌，诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白11C。
8.一种表达载体，其特征在于:包含编码权利要求1所述重组蛋白IlC的核酸序列。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是PGex系列载体，或PET系列载体，或pQE系列载体，优选为pGeX-6P-2。
10.一种表达如权利要求8或9所述表达载体的宿主菌。
11.按权利要求10所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XLl-blue或BL21系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌XLl-blue。
12.权利要求1所述的重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。
13.权利要求1所述的重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原I1C的制备方法和应用，该融合蛋白由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的一个活性片段I1与ClfA抗原分子的一个活性片段C通过连接肽融合而成。该融合蛋白纯度高，表达量高，便于分离纯化，高效安全，其制备方法简捷、容易放大、重复性好，所述融合蛋白辅以铝佐剂后，可制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗以及制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，通过动物试验验证，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好抗MRSA感染的免疫保护作用。
文档编号C12N15/62GK103087198SQ20131002121
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者邹全明, 樊绍文, 曾浩, 冯强, 吴翼, 蔡昌芝, 郭鹰 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学