专利名称：一种低聚合度κ-卡拉胶寡糖的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物、酶工程等领域。本发明通过分离天然海洋微生物菌株产生的胞外酶降解K-卡拉胶得到低聚合度的K-卡拉胶寡糖，其主要产物为聚合度为2、6、8的混合物，该方法制备的寡糖组分较为单一，具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒及免疫调节等多种活性。
背景技术：
κ -卡拉月父是由3,6_内酿- a -D-半乳糖和4_硫酸-β -D-半乳糖单位重复组成的一种酸性硫酸多糖。近几年研究发现卡拉胶具有降血脂、抗凝血、抗血栓形成、免疫调节、刺激结缔组织生长等多种生物学活性，在生物医药领域表现出诱人的应用前景。但由于卡拉胶分子量较大，溶解性和可吸收性较差，限制了其应用。K -卡拉胶寡糖是来自卡拉胶的降解产物，分子量较小、溶解性较好，易于吸收，稳定性和安全性都有所改善，同时因分子链上的活性基团充分暴露，使其活性较卡拉胶有显著提高，拓宽了卡拉胶的应用领域。由于其结构，带负电荷等特性，使其具备抗肿瘤，抗菌，抗氧化，增强免疫功能，对放射性损伤的保护等特殊生理活性，已引起人们广泛的关注。卡拉胶寡糖的制备主要有化学降解、物理降解及酶降解三种方式。化学降解主要有酸降解和氧化降解；物理降解主要有辐射降解、微波降解和超声波降解。目前，卡拉胶寡糖的制备方法大都使用酸降解方式。酶降解方法与物理降解、化学降解方法相比，具有较多的优势如:1)反应专一性好，得到的酶解产物分子量分布窄，而酸降解时糖链断裂不均一；氧化降解则可使糖分子发生氧化，相对产生较多的副产物；2)反应条件温和、易控制，不像化学和物理降解方法需要高温、高压和一定强度的微波和辐射波的苛刻条件；3)酶降解的产物相对具有较好的生物学活性；4)通过微生物产生酶去降解卡拉胶更为环保。目前我国卡拉胶的降解方法基本采用化学降解方法。由于化学降解方法反应条件不易控制、产物得率较低、目的产物不易分离，而酶降解法填补了化学降解法的缺点，很大程度上保护了反应底物的活性基团不会在降解过程中受到破坏，该酶解反应条件温和、易于控制、产物易分离。国外的科研工作者已经将目光转移到通过酶解法获取低聚糖这一新的方向，特别是海洋微生物这一极其丰富的自然资源。
发明内容
本发明为应用菌株Cellulophaga lytica strain:N52发酵产物中分离得到的卡拉胶降解酶，这种卡拉胶降解酶为胞外酶，可作用于κ-卡拉胶的β-1，4糖苷键，得到低聚合度的κ-卡拉胶寡糖，该酶的作用位点分别为八糖和六糖，最终产物为二糖重复单位构成的低聚合度寡糖(见图1)。 本发明提供一种降解κ -卡拉胶并得到低聚合度寡糖聚合物的方法，具有生产成本低、效率高、环境污染小、反应条件温和及产物成分单一等特点。本发明中κ_卡拉月父寡糖的结构式由3,6-内醚- a -D-半乳糖和4_硫酸-β-D-半乳糖单位重复组成，聚合度为2、6、8的混合物，其特征是含有硫酸基团作为主要的功能基团。本发明所制备的低聚合度K -卡拉胶寡糖具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗凝血及免疫调节等活性。实现本发明目的的技术手段1.培养基的制备:固体平板培养基(g/L): K -卡拉胶IOg,琼脂10g, FeSO4.7H200.02g，蛋白胨3g，NaC120g,无机盐母液100ml, H20900ml, pH7.0,121°C高温高压灭菌20min。(无机盐浓度:MgSO4.7Η200.05%, CaCl20.02%, KH2PO40.1% ) 发酵及种子培养基(g/L): κ -卡拉胶 lg,FeSO4.7Η200.02g，蛋白胨3g，陈海水lOOOmL，pH自然，121°C高温高压灭菌20min。2.粗酶液的制备将甘油保存的Iml Cellulophaga lytica strain:N5_2的菌液接入液体培养基(50mL/250ml)中活化24h，取Iml菌液加到9ml无菌的生理盐水中，依次进行梯度稀释，然后将10_2到10_7的稀释液各取0.15ml涂固体平板，30°C倒置培养，观察菌的生长情况。挑取固体平板中的单菌落，接入种子培养基中，25°C 35°C，100 200rpm/min摇床培养12h 24h。按I 5%的接种量将种子液接种到装有IOOml发酵培养基的250ml三角瓶中，25°C 35°C, 100 200rpm/min摇床培养12h 24h。将发酵液在4°C条件下，3000 6000rpm/min,离心30min,取上清液即为粗酶液。3.κ -卡拉胶寡糖的制备及纯化将I 5%酶液与0.1 2% κ-卡拉胶底物1:1混合，于25°C 40°C、150r/min降解24h 72h，煮沸lOmin， 终止酶作用，经使用等体积的乙醇与酶解液混合沉淀除酶蛋白，用分子量为500的透析袋以透析的方法去除盐类等小分子杂质，置于4°C以蒸馏水作为透析外液，每8h更换一次透析外液，直至透析外液经AgNO3溶液检测不到白色沉淀，经冷冻干燥得相对纯净的κ-卡拉胶寡糖。
图1卡拉胶降解酶的酶解方式图2κ-卡拉胶寡糖的薄层层析检测。1，乳糖对照；2，3，4，不同相对聚和度的寡糖。图3HPLC(A)和ES1-TOF-MS(B-D)检测卡拉胶酶解产物。a:溶剂峰，b、C、d:不同分子量K -卡拉胶寡糖样品峰。图413C_NMR色谱法检测寡糖的结构。G:β- -半乳糖，A:3，6_内醚-α-D-半乳糖.
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的阐述:实施例1: κ -卡拉胶寡糖的薄层层析(TLC)检测将薄层层析硅胶粉末与羧甲基纤维素钠按1: 3的比例混合，充分研磨，均匀铺于玻璃板，100°c活化2h，存于干燥器内备用。用毛细吸管在制备的硅胶层析板上进行点样，点样原点距离板底部1cm，点样原点间距1cm，用电吹风缓缓吹过点样点，使溶剂迅速挥发。将层析板置于层析缸内在室温下展开，待展开剂(正丁醇:冰乙酸:水为2: I: I)前沿展开至距板上端Icm处取出吹干，以显色剂(苯胺-二苯胺)显色，于100°C烘箱中干燥6min左右。结果:利用薄层层析法检测菌株N5-2酶液降解κ-卡拉胶的产物，其降解产物主要集中为3种相对均一的组分。通过与乳糖纯品对照，产物为聚合度为1、3、4的相对稳定的κ -卡拉胶寡糖，如图1所示。实施例2 =HPLC和ES1-TOF-MS检测卡拉胶酶解产物AgilentllOO型高效液相色谱仪对初步纯化后的样品进行分离。分离条件:流动相A:ACN(乙腈)，流动相B =IOOmM甲酸铵(ρΗ3.0)，梯度:80%~ 60% Α，时间O 20min。κ -卡拉胶寡糖的分子量采用正离子模式的ES1-TOF-MS法(G1969A，Agilent, UN)检测。结果:酶解K -卡拉胶寡糖经初步分离纯化后，经高效液相层析分析，得到的结果如图2，图中所示得到b、C、d三个样品峰，说明κ -卡拉胶降解酶降解产物为三种组分，其中a峰为溶剂峰。ES1-TOF-MS图谱显示κ -卡拉胶寡糖的基本单位为二糖(425.27Da，η = 1，图2Β)，κ -卡拉胶寡糖四糖分子量为1242.95Da(n = 3，图2C)，κ -卡拉胶寡糖八糖分子量为1681.04Da(n = 4，图2D)。因此酶解后的产物分别为二糖、六糖和八糖，分别对应HPLC结果中的b、c、d三个样品峰。实施例3 =13C-NMR色谱法检测寡糖的结构使用德国Bruker AVANCE500MHz核磁共振仪对寡糖进行13C-NMR波谱分析，IOmg样品溶于0.5mL2H20中，检测过程在30°C条件下进行。结果:13C-NMR色谱法用来检测酶解产物的结构，如图3，在102.64ppm处只检测到一个特征性信号，在96.79ppm和95.08ppm处检测到寡糖的A端的碳还原端。核磁共振光谱学对于多糖的结构分析，特别是以相同或相似的嵌段单元构成的多糖分子，能够提供有重要价值的资料。通过13C-NMR分析可以确定κ-卡拉胶降解酶裂解的作用位点及酶解作用方式。如图3所示硫酸κ -卡拉六糖图谱，图谱中显示92和96.79ppm处的两个特征信号，这两个特征信号分别归属于κ-卡拉胶的β-1，4糖苷键被κ-卡拉胶降解酶水解后在还原性末端形成的半乳糖残基C-1a和C-Ιβ。通过以上分析可以得出，Cellulophaga lytica strai η:Ν5_2所产κ -卡拉胶降解酶水解κ -卡拉胶3,6-内醚-D-半乳糖残基和4-硫酸基-D-半乳糖之间的β -1，4糖苷键，产生3，6-内醚-D-半乳糖作为非还原端，D-半乳糖作为还原端的κ -卡拉寡糖。附录A缩略词语表
权利要求
1.一种低聚合度K -卡拉胶寡糖制备,主要包括以下步骤:a:将活化的Cellulophagalytica strain:N5-2菌种涂于固体培养基上，挑取单菌落接入种子培养基中，25-35 °C，100-200rpm/min摇床培养12_24h ；b:按1_5 %的接种量将种子液接种到发酵液中，25-35°C，100-200rpm/min 摇床培养 12_24h ；c:将发酵液在 4°C条件下，3000-6000rpm/min，离心30min，取上清液即为粗酶液；d:将1-5%酶液与0.1-2% κ -卡拉胶底物1:1混合，于25-4(TC、150r/min降解24_72h,煮沸IOmin,终止酶作用；e:经使用等体积的乙醇与酶解液混合沉淀除酶蛋白，用分子量为500的透析袋以透析的方法去除盐类等小分子杂质，置于4°C以蒸馏水作为透析外液，每8h更换一次透析外液，直至透析外液经AgNO3溶液检测不到白色沉淀，经冷冻干燥得相对纯净的κ -卡拉胶寡糖。
2.根据权利要求1所述的一种低聚合度κ-卡拉胶寡糖的制备，其低聚合度κ -卡拉胶寡糖结构式由3，6-内醚- a -D-半乳糖和4-硫酸-β -D-半乳糖单位重复组成，该寡糖是由具有较高κ -卡拉胶降解酶活性菌株Cellulophaga lytica strain:N5_2发酵产物中分离得到的酶对κ -卡拉胶进行降解得到；降解得到的卡拉胶寡糖的聚合度分别为2、6和8:
3.根据权利要求1所述的一种低聚合度κ-卡拉胶寡糖制备，其获得的卡拉胶降解酶为胞外酶，可作用于κ-卡拉胶的β_1，4糖苷键，作用位点分别为八糖和六糖，产物为二糖重复单位构成的低聚合度寡糖。
全文摘要
一种低聚合度κ-卡拉胶寡糖的制备方法，包括κ-卡拉胶的酶解制备，并对降解产物进行分离纯化，得到较纯净的κ-卡拉寡糖混合组分。本发明特征为从海洋微生物Cellulophaga lytica strainN5-2(NCBI，GENBANKD登录号为GU129978)中得到卡拉胶降解酶用于降解κ-卡拉胶得到低聚合度寡糖混合物。该酶为一种胞外酶，可作用于κ-卡拉胶的β-1，4糖苷键，作用位点分别为八糖和六糖，产物为二糖重复单位构成的低聚合度寡糖。本发明的制备方法成本较低，方法简便，相较于化学物理等方法，所得产物较单一，副产物少，便于大规模生产。
文档编号C12P19/14GK103114113SQ20131002122
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月6日 优先权日2013年1月6日
发明者吴海歌, 姚子昂, 于国友, 于丽萍 申请人:威海康博尔生物药业有限公司