专利名称：一组检测尤文氏肉瘤相关基因ewsr1断裂分离的核酸探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤相关基因检测技术领域，更具体涉及尤文氏肉瘤(Ewing, ssamoma)相关基因断裂分离检测技术领域，特别是涉及一组尤文氏肉瘤基因EWSRl断裂分离的检测探针。
背景技术：
尤文氏肉瘤(Ewing' s samoma),是骨科少见的一种恶性肿瘤,属于一种高度恶性的小圆细胞原发肿瘤。在青少年骨肿瘤发病率中占第二位。是人体骨组织第三位易发的恶性肿瘤。1921年Ewing首先描述此原发恶性骨肿瘤。当时取名为“骨的弥漫性血管内皮瘤”。其后0berling(1928年)认为其起源于骨髓网状细胞，称之为“网状肉瘤”。但很久以来，人们对其组织发生意见不统一，文献中一直以姓氏命名。目前尤文肉瘤已被公认是一种独立的骨肿瘤，但对其来源和性质仍存在有不同的意见，如间充质细胞、成骨细胞，但大多数研究者倾向于认为尤文氏肉瘤为神经外胚层细胞起源。现在研究表明，骨外尤文氏肉瘤(extraosseous Ewin g' s sarcoma, E0E)、外周原始神经外胚层瘤(pPNET)和儿童Askin' s瘤(胸壁PNET)等同属于尤文氏肿瘤家族(Ewing' s sarcoma family of tumor,ESFr)，其具有不同程度的神经外胚层分化，是一组发生于软组织的小圆细胞肉瘤，是软组织小圆细胞肿瘤的代表类型。尤文氏肉瘤是软组织肿瘤中第一个确定具有特征性染色体异位并产生融合性基因的肿瘤。在骨外尤文氏肉瘤中存在t(ll ；22) (q24 ;ql2)，产生EWSR1-FLI1融合基因，在外周原始神经外胚层瘤和发生于儿童肺部的Askin瘤中也存在相同的遗传学异常，提示这三种病变在遗传学上具有相同的基础性异常，现这三种肿瘤已统称为EWSRl/pPNET家族。研究显示90% 95%的病例存在t (11 ；22) (q24 ;ql2)，导致llq24上的FLIl基因与22ql2上的EWSRl基因融合，产生EWSRl (5，端7号外显子)-FLIl (3，端，6号外显子I型，或5号外显子II型)融合性基因。EWS是一种广泛表达的功能性RNA结合蛋白。EWS基因的功能尚待阐明。FLIl基因是ETS原癌家族的一员，含有DNA结合域。正常情况下，FLIl在造血细胞中表达。在器官模型中，FLIl参与早期造血、血管和神经外胚层的发育。EffSRl-FLIl使EWSRl的N末端反式激活域与FLIl的C末端DNA结合域融合，融合蛋白起着转录促进子的作用，或者抑制靶基因，如EWSR1-FLI1负调节TGF-BII (TGFBR2)型受体，后者为一潜在的肿瘤抑制基因产物。TGFBR2受到抑制，可使瘤细胞能够避免凋亡。在软组织肿瘤中，有些肿瘤在细胞形态学上和EWSRl/pPNET家族有相似的小圆细胞，常常容易导致误诊。如转移性神经母细胞瘤、分化差的腺泡状横纹肌肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤等。检测EWSRl基因的断裂分离可以排除这些肿瘤的干扰，准确鉴另1J、诊断尤文氏肉瘤(SalvatoreRomeo&AngeloP.DeiTos, Soft tissue tumors associatedwith EffSRl translocation, Virchows Arch(2010)456:219-234 DOI 10.1007/s00428-009-0854-3.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测EWSRl基因断裂分离的核酸探针组合。本发明的目的是通过下列技术方案实现的:一种用于诊断尤文肉瘤EWSRl基因断裂分离的探针组合，该组合为BAC克隆片段CTD-2260D14, CTD-2050C22，CTD-3036013, RP11-155B12。其中 CTD-2260D14，CTD-2050C22定位于EWSRl基因着丝粒一侧，核酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，标记相同的任意一种颜色的荧光，如标记绿色荧光；CTD-3036013，RP11-155B12定位于EWSRl基因端粒一侧，核酸序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，标记相同但与着丝粒一侧标记不同颜色的荧光，如标记红色荧光；标记的荧光颜色可以互换。使用该探针组合检测EWSRl基因断裂分离的步骤如下:(a)样本预处理:将组织切片样本在二甲苯中脱蜡5分钟，再重复I次。然后在95%、85%和70%乙醇中各水化2次，每次5分钟。(b)杂交预处理:将样本在95°C水中水浴15分钟，取出样本用胃蛋白酶消化15-20分钟。转移到2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。取出样本用预冷的75%、85%和95%梯度乙醇脱水5分钟，自然干燥。(c)样本杂交:将探针加到预处理后的样本玻片上，封片。置于杂交仪中82°C变性5分钟，42 °C杂交过夜。(d)洗脱:移去盖玻片，样本用含SSC和NP-40的洗涤液洗脱2次，每次2分钟。用75%、85%和95%梯度乙醇各脱水5分钟，自然干燥。用DAPI覆盖样本，复染20分钟。(e)镜检:在荧光显微镜下观察，选择蓝色、绿色滤镜分别观察绿色、红色信号，利用双通道滤镜观察红绿融合信号。选择背景好，杂交信号强，细胞核大小均一的区域拍照和
ο ο(f)结果判定:正常细胞染色体，可见两个正常融合信号(或红绿紧邻)；在异常细胞染色体，可见一个正常的融合信号(或红绿紧邻)，一对红/绿分离异常信号。当异常信号大于5%时记为阳性。本发明的有益效果在于:本发明的尤文肉瘤EWSRl基因断裂分离FISH检测方法通过对尤文肉瘤组织进行常规处理，然后采用双色断裂分离探针进行荧光原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述EWSRl基因的断裂分离，设计巧妙，操作简单，特异性和敏感性均有大幅提高，可以快速、准确、直观检测出尤文肉瘤EWSRl基因断裂分离，检测结果准确可靠，可为诊断尤文肉瘤作参考依据。适于大规模推广应用。
图1和图2显示了阴性检测结果，可见两个正常融合信号(或红绿紧邻)。图3和图4显示了阳性检测结果，在异常细胞染色体，可见一个正常的融合信号(或红绿紧邻)。
具体实施方式
本发明中，EWSRl基因着丝粒一侧BAC克隆片段为CTD-2260D14、CTD-2050C22，长度265kb，端粒一侧BAC克隆为CTD-3036013、RP11-155B12，长度377kb。这些片段为细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC)克隆,其在人类染色体上的定位已经公开。选择在EWSRl基因每端连接2个标记不同颜色的荧光的BAC克隆片段是为了增强荧光强度及范围。通过试验观察，2个BAC克隆片段的荧光强度及范围已经足够观察，可避免采用多个BAC克隆片段会导致荧光范围分散而产生干扰，还可避免只采用I个BAC克隆片段可能出现荧光强度不够的情形。克隆片段购自Invitrogen公司。探针标记:BAC克隆CTD-2260D14，CTD-2050C22采用FITC标记，生产绿色信号。BAC 克隆 CTD-3036013，RP11-155B12 采用 Tetramethyl-rhodamine 标记，产生红色信号。将两种探针，加上杂交缓冲液(含硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺和SSC)、人类Cot-1 DNA混合备用。本例试验所用样本来南方某三甲医院2003年至2008年间的初软组织肿瘤，样本共59个，其中尤文氏肉瘤样本35个，横纹肌肉瘤样本16个，脂肪肉瘤样本8个。使用该探针组合检测EWSRl基因断裂分离的步骤如下:(a)样本预处理:将上述各组织切片样本在二甲苯中脱蜡5分钟，再重复I次。然后在95%、85%和70%乙醇中各水化2次，每次5分钟。(b)杂交预处理:将样本在95°C水中水浴15分钟，取出样本用胃蛋白酶消化15-20分钟。转移到2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。取出样本用预冷的75%、85%和95%梯度乙醇脱水5分钟，自然干燥。(c)样本杂交:将探针加到预处理后的样本玻片上，封片。置于杂交仪中82°C变性5分钟，42 °C杂交过夜。(d)洗脱:移去盖玻片，样本用含SSC和NP-40的洗涤液洗脱2次，每次2分钟。用75%、85%和95%梯度乙醇各脱水5分钟，自然干燥。用DAPI覆盖样本，复染20分钟。(e)镜检:在荧光显微镜下观察，选择蓝色、绿色滤镜分别观察绿色、红色信号，利用双通道滤镜观察红绿融合信号。选择背景好，杂交信号强，细胞核大小均一的区域拍照和
记录。。(f)结果判定:红绿荧光信号之间的距离大于一个信号宽度时计为分离信号。为排除假阳性和假阴性，每个样本计数100个细胞，正在细胞可见两个黄色信号(或红绿紧邻)，异常细胞可见一个黄色信号和一结红/绿分离信号。当异常信号大于5%时记为阳性。检测结果:
权利要求
1.一组检测尤文氏肉瘤相关基因EWSRl的断裂分离的核酸检测探针，其特征在于该组探针根据NCBI中GeneBank编号为NM_001163286的EWSRl基因核苷酸序列筛选设计。
2.根据权利要求1所述的核酸检测探针，其特征在于探针为BAC克隆片段CTD-2260D14 和 CTD-2050C22，CTD-3036013 和 RP11-155B12，其核苷酸序列分别为 SEQ IDNO:1 和 SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4。
3.根据权利要求2所述的核酸检测探针，其特征在于克隆片段CTD-2260D14和CTD-2050C22位于EWSRl着丝粒一侧，标记一种颜色的荧光；CTD_3036013和RP11-155B12定位于EWSRl端粒一侧，标记与着丝粒一侧不同颜色的荧光。
4.根据权利要求3所述的核酸检测探针，其特征在于克隆片段CTD-2260D14和CTD-2050C22 以 FITC 标记；而 CTD-3036013 和 RP11-155B12 以 Rhodamine 标记。
5.权利要求1-4所述的核酸检测探针组在制备用于诊断尤文氏肉瘤的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及一组检测尤文氏肉瘤相关基因EWSR1断裂分离的核酸检测探针。使用该探针以荧光原位杂交技术检测人组织切片样本，可以快速的、特异性的检测出尤文氏肉瘤相关基因EWSR1基因的断裂分离情况，从而为尤文氏肉瘤的临床诊断提供辅助判断依据。
文档编号C12N15/11GK103074432SQ20131002158
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者不公告发明人 申请人:康盈创新生物技术(北京)有限公司