专利名称：一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法
技术领域：
:本发明涉及生物工程动物细胞株领域，具体涉及一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法，更具体的说是一种双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株的建立方法和依照该方法建立的双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株。
背景技术：
: 根据人类基因组突变数据库(HumanGenome Mutation Database, HGMD, http://WWW.hgmd.0rg)2012年权威统计，由于移码突变、选择性剪切或者直接的无义突变，在人类基因组上形成了提前终止密码子(Premature termination codons, PTC), PTC的存在使机体产生截断型的蛋白质或者具有负显性效应的蛋白质，有三分之一的人类遗传疾病是由此导致的；11.2%的人类遗传疾病是由于无义突变直接引发或者是伴随出现的。临床治疗遗传疾病的主要方向之一就是通过对PTC的促通读，从而抑制产生截断型蛋白质，促进产生全长的有活性的蛋白质来缓解和治疗遗传疾病。目前基因内PTC的通读研究是分子细胞生物学的热点之一，对由此导致的遗传疾病的治疗具有潜在应用价值。主要针对的遗传疾病有囊性纤维化病变(cystic fibrosis,CF)、杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)、血友病 A 和 B (hemophiliaA, HA andB, HB)、家族性良性天疱疮(Hailey-Hailey disease, HHD)和粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis, MPS)。药物促PTC通读表达还用于基因无义突变导致的癌症、肿瘤和部分遗传疾病的机理研究，并且取得了长足的进展，取得了一系列有意义的分子学数据和试验结果。研究表明，氨基糖苷类(例如gentamicine)化合物能够结合到核糖体的识别中心(decodingcenter),降低密码子和反密码子配对的准确性，引起mRNA中密码子的错读，在培养的动物细胞和人体细胞中都得到了实验的证实；化合物PTC124，与氨基糖苷类药物结构上不同，而促通读效率很高，已经用于三期临床，商品名Ataluren。目前国内外缺乏高通量的细胞水平药物筛选体系，因此急需建立相应的细胞株供体外筛选由于无义突变导致的疾病的潜在药物，更可用于筛选由于无义突变引发的遗传性疾病的临床治疗药物
发明内容
:本发明旨在解决上述问题，而提供一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法，以及依照该方法建立的双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:一种双荧光基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:1。一种哺乳动物表达载体，含有上述双荧光基因，载体命名为pDsRed-EGFPmtag-。一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法，包括如下步骤:I)利用基因重组技术将DsRed和EGFP基因克隆到pEGFP_Nl哺乳动物表达载体上，构建成pDsRed-EGFP，重组质粒经酶切鉴定；
2)利用PCR快速定点突变方法，将DsRed基因的终止密码子tag突变至tac，并且调整DsRed和EGFP基因至一个阅读框，构建成双荧光表达载体pDsRed-EGFPmtag-；3)利用PCR定点突变的方法，将绿色荧光蛋白EGFP的445氨基酸位置突变为含有一个提前终止密码子，得到双荧光哺乳动物表达载体的突变体pDsRed-EGFPmtag-Y445X ；4)培养非洲绿猴肾细胞Cos-7，培养基为DMEM，添加10%胎牛血清，不添加任何抗生素培养，胰酶消化细胞，按2X IO5CelVmL密度种于6孔板；5)利用脂质体 Lipofectamine 2000 将质粒 pDsRed-EGFPmtag-和pDsRed-EGFPmtag-Y445X分别转染Cos_7细胞，转染8小时后，更换新鲜培养液得到有限细胞株。用促通读药物PTC124处理有限细胞株，48小时后，用激光共聚焦显微镜观察细胞，上样流式细胞仪，实时定量PCR检测药物促通读的效率。本发明建立的有限细胞株含有双荧光哺乳动物表达载体pDsRed-EGFPmtag-及其PTC突变体pDSRed-EGFPmtag-Y445X。本发明的建系方法和建立的双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株，可用于无义突变导致遗传疾病的治疗药物的筛选、PTC通读药物的筛选等。此外本发明建立的有限细胞株还可用于对NMD途径的抑制与药物促PTC通读表达进而用于基因无义突变导致的癌症、肿瘤和部分遗传疾病的机理研究。
:图1是双荧光哺乳动物表达载体pDsRed-EGFPmtag-组成示意2是双荧光哺乳动物表达载体pDsRed-EGFPmtag-鉴定图，其中:泳道I为空白对照；泳道2为PCR鉴定；泳道3为双酶切鉴定
图3是双荧光哺乳动物表达载体pDsRed-EGFPmtag-测序鉴定4是双荧光哺乳动物表达载体PTC突变体pDsRed-EGFPmtag-Y445X测序鉴定5是荧光显微镜下双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体照片，其中:E是A(Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-绿色荧光)和 C (Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-红色荧光)的叠加照片，F 是 B (Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-Y445X 绿色荧光)和 D (Cos-7-pDsRed_EGFPmtag-Y445X红色荧光)的叠加照片图6是本发明的有限细胞株Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-的流式图。图7是本发明的有限细胞株Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-及其PTC突变体Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-Y445X在不同浓度PTC124处理后的流式数据。图8是本发明的有限细胞株Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-及其PTC突变体Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-Y445X在不同浓度PTC124处理后的荧光实时定量PCR数据。
具体实施方式
:I)重组双荧光哺乳动物表达载体的构建利用Xho I和EcoR I对DsRed荧光蛋白基因进行双酶切得到0.8kb的基因片段，电泳回收。哺乳动物高效表达载体PEGFP-Nl也使用Xho I和EcoR I双酶切成线性载体，电泳回收。将其与回收的DsRed荧光蛋白基因片段使用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pDsRed-EGFP，重组质粒经酶切鉴定。(见图2)
设计一对完全互补的突变引物，使用高保真酶以重组质粒pDsRed-EGFP为模板进行PCR扩增，产物经Dpn I消化模板，取IOii L产物转化细菌，挑取克隆提取质粒，测序鉴定(见图3)，得到重组双荧光哺乳动物表达载体pDsRed-EGFPmtag-(见图1)。2)重组双荧光哺乳动物表达载体PTC突变体的构建设计一对完全互补的突变引物，使用高保真酶以重组质粒pDsRed-EGFPmtag-为模板进行PCR扩增，产物经Dpn I消化模板，取10 ii L产物转化细菌，挑取克隆提取质粒，测序鉴定(见图4)，得到PTC突变质粒pDsRed-EGFPmtag-Y445X。3)哺乳动物细胞Cos-7的培养与传代细胞来源于山西大学生物技术研究所，复苏好的细胞培养于25cm2细胞培养瓶中，37°C，5%C02，培养基为DMEM，添加胎牛血清至终浓度为10%。待细胞汇合度达到70%以上即可传代，弃去培养基，用PBS洗2次，弃去PBS，加入0.25%胰酶消化液lmL，将培养瓶至于37°C培养箱预热，待细胞变圆但尚未成片脱落时弃去胰酶，加入含10%胎牛血清的DMEM终止消化，并轻轻吹打细胞使之脱落，而后按照1:3分装于3个培养瓶中加适量培养基培养。4) Cos-7细胞的转染及促通读药物处理a、转染第一天，将Cos-7细胞按2 X 105cell/mL密度种于6孔板中，过夜培养使得次日细胞汇合度达到90-95%。b、转染第二天，在无菌离心管中配制双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体质粒与脂质体混合液，用于转染6孔培养板内培养的Cos-7细胞。溶液A:4 ii g质粒DNA溶于250 ii L无血清培养基中。溶液B: 10 ii L Lipofectamine 2000溶于250 u L无血清培养基中，室温5-25分钟。混合溶液A和溶液B，轻轻混匀，室温20分钟以上。将混匀的溶液500 u L加至6孔培养板的细胞培养基中，轻轻混匀，37°C，5%C02培养24小时。
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C、转染细胞的促通读药物处理转染8小时后，更换新鲜的培养基，加药物PTC124干预，作用浓度分别为1，2，4，8，16,32,64nmol/ml。d、细胞的收获48小时后，激光共聚焦显微镜镜检，Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-有明显的红色(见图5A)和绿色荧光(见图5C)表达，叠加后呈黄色(见图5E)，Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-Y445X绿色荧光明显减弱(见图5B)。弃去培养基，用PBS洗2次，弃去PBS，加入0.25%胰酶消化液lmL，将培养瓶至于37° C培养箱预热，待细胞变圆但尚未成片脱落时弃去胰酶，加入含10%胎牛血清的DMEM终止消化，并轻轻吹打细胞使之脱落。5)双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株的流式细胞术检验及实时定量PCR检测。a、双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株的流式细胞术检测收获的细胞用生理盐水重新悬浮后，在流式细胞仪上进行检测(见图6)，以红色荧光作为内对照，数据分析发现，PTC124有效的促进了双荧光哺乳动物表达载体PTC突变体的通读，而且PTC124的促通读效率在一定范围内有量效关系，在4nmol/ml的浓度下，促通读效率最高，说明双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体的有限细胞株作为促无义突变通读筛选体系，能够高通量的筛选候选药物(见图7)。b、双荧光哺乳动物表达载体及其PTC突变体有限细胞株的实时定量PCR检测
根据绿色荧光蛋白EGFP基因序列，设计一对特异性实时定量PCR引物，以未转染的Cos-7细胞作为阴性对照，以有限细胞株Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-和Cos-7-pDsRed-EGFPmtag-Y445X的mRNA反转录成的cDNA为模板，进行实时定量PCR反应，结果与流式细胞术检测结果相同(见图8)，说明PTC124有效的促进了双荧光哺乳动物表达载体PTC突变体的 通读。
权利要求
1.一种双荧光基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:1。
2.一种哺乳动物表达载体，含有权利要求1所述的双荧光基因。
3.一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法，包括如下步骤:1)利用基因重组技术将DsRed和EGFP基因克隆到pEGFP-Nl哺乳动物表达载体上，构建成pDsRed-EGFP，重组质粒经酶切鉴定；2)利用PCR快速定点突变方法，将DsRed基因的终止密码子tag突变至tac，并且调整DsRed和EGFP基因至一个阅读框，构建成双荧光哺乳动物表达载体pDsRed-EGFPmtag-；3)利用PCR定点突变的方法，将绿色荧光蛋白EGFP的445氨基酸位置突变为含有一个提前终止密码子，得到双荧光哺乳动物表达载体的突变体pDsRed-EGFPmtag-Y445X ；4)在培养基DMEM中添加10%胎牛血清，培养非洲绿猴肾细胞Cos-7，然后加入胰酶消化细胞，按2 X 105cell/mL密度种于6孔板；5)利用脂质 体LipofectamineTM2000 将质粒 pDsRed-EGFPmtag-和pDsRed-EGFPmtag-Y445X分别转染Cos_7细胞，转染8小时后，更换新鲜培养基得到有限细胞株。
全文摘要
本发明公开了一种表达绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(DsRed)的真核生物表达载体；突变体在绿色荧光蛋白EGFP的445氨基酸位置含有一个提前终止密码子，该突变位点能有效的阻止绿色荧光蛋白EGFP的表达。将构建的双荧光表达载体及其突变体导入非洲绿猴肾细胞Cos-7中，经促通读药物PTC124处理，利用流式细胞术对绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达强度进行检测，能高效测定出促通读药物对该载体的促通读效率。另外该表达载体的多克隆位点可以引入不同的无义突变以及其上下游相关序列，从而可以特异性的筛选针对不同无义突变引发的疾病的靶向药物。
文档编号C12N15/12GK103074346SQ20131002338
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者申泉, 李毳, 柴宝峰, 王刚 申请人:山西大学