专利名称：一个抑制BMPR-lB基因表达合成的shRNA分子的制作方法
技术领域：
本发明是“七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子”的专利，即申请号为2011103725220的母案专利的分案申请。本发明涉及能够对骨形成蛋白受体-1B(BMPR-1B)基因产生显著抑制作用的小干扰RNA分子的设计、合成和抑制作用在Hek293细胞上的评价方法。
背景技术：
BMPR-1B基因是一种增加排卵率的调控基因，属于TGF-β超家族成员，又称为ALK6基因；ALK6突变是在Booroola母羊(FecB)中发现的第一个点突变，发生在高度保守的胞内激酶区，核苷酸830处(A830G)，引起精氨酸代替了谷氨酰胺(Q249R);其显性表现型为卵泡发育提前以及产多胎。文献检索披露:(l)Biol.Reprod.64，1225-1235作者:ffilson, T.等发表《表现为多胎性状的Booroola羊，在卵母细胞和颗粒细胞表达的ALK6基因的一个突变》文章内容是携带FecB纯合子的母羊其排卵率升高，伴随着大量囊状卵泡比FecB+杂合子的母羊提前成熟并发生排卵；因此，携带FecB纯合子母羊其排卵前卵泡提前达到了最大直径并维持在一定水平，直到排卵，导致最终卵泡生长动力学发生了变化。(2)Repix)duCtiveBiologyandEndocrinology2006, 4:20do1: 1184/1477-7827-4-20 作者 St6phane Fabre 等发表《在哺乳动物中调节排卵率:羊基因模型的作用》文章，内容是BMP15，GDF9, BMPR-1B这三个基因型来理解BMP系统的作用作为卵巢内滤泡生长和成熟的调节最后影响排卵率。(3)Reproduction (2011) 141 643-651作者Wei Wang等发表《RNA分子干扰猪的含有内源性SMAD4的颗粒细胞导致的FSH介导的颗粒细胞的增值和类固醇合成的减少》文章内容是在猪的颗粒细胞上用RNA干扰的方法敲低了 SMAD4，结果显示了 SMAD4_siRNA抑制了 SMAD4的mRNA和蛋白的表达并抑制了 FSH引起的猪颗粒细胞的分化和雌二醇的分泌和细胞周期蛋白的表达。
关于BMPR-1B基因shRNA分子的研究，ALK6基因干扰的小鼠并没有像Booroola母羊一样表现出多胎性状，且卵泡发育和排卵率都表现正常，但其软骨形成受到影响，骨骼肌发育存在缺陷，说明ALK6突变存在种属差异，针对其它家畜品种，如绵羊、山羊、猪等，均未见报道。本发明构思根据绵羊BMPR-1B基因cDNA序列，自行设计合成的shRNA分子，通过功能验证，得到I个对绵羊BMPR-1B基因表达有显著抑制作用的shRNA分子，为绵羊生物学研究拓展了应用领域。
发明内容
本发明的目在于:获得对BMPR-1B基因表达具有显著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制BMPR-1B基因表达效率90%以上。本发明的目的是这样实现的:一个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子，依据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因，即NM-001009431.1序列；设计2条shRNA分子，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上，构建慢病毒干扰RNA质粒，将pLL-BMPR-1B-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T细胞产毒，经荧光定量PCR检测，得到了 I个能显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子；
其中使用的引物:
LV-BMPR-1B-1475上游:
5’ TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’ ；
下游:
5，TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3，；
其中获取shRNA分子的步骤:
其I shRNA慢病毒载体的构建
取IOUL IOuM的两条siRNA寡核苷酸，即为正链和互补链；加入8 μ L IOXannealingbuffer和12 μ L灭菌超纯水，煮沸10分钟后冷却至室温；同时用pLL3.7质粒载体经XhoI和HpaI双酶切后回收质粒，与退火产物4°C过夜连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，LB平板氨苄青霉素，即为lOOug/uL;筛选，用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆，并送上海生工所测序鉴定，提取纯化重组质粒用于转染；
其 2 plex-bmpr-1b、Lv-BMPR-lB-shRNA 慢病毒的制备
铺板，每IOcm面积中 铺5 X IO6个293T细胞；Lipectamine2000脂质体转染，在含有脂质体和DNA复合物的试管中加入1.5ml预热的Opt1-MEM培养基后，加入目的载体及病毒包装载体，其载体的加量分别为:转染载体Iv- bmpr-1b -shRNA 12ug、REV 6ug、pMDL 6ug、VSVG 6ug ； plex-bmpr-1bl2 ug、Pspax2 9ug、PMD2.G3.5 ug,轻轻混勻，室温放置 5 分钟,之后将上述稀释好的DNA与脂质体混合，置于室温孵育20分钟，此时用Opt1-MEM培养基清洗液转染细胞一次；将脂质和DNA复合物加入细胞，置于37°C培养箱，培养4-6小时，换IOmL新鲜DMEM完全培养基，继续培养48_50h，收集病毒，此时的病毒能直接用来转染或置于-70°C备用；
其3重组Lentivirus感染Hek293细胞系的步骤
将滤过的重组0.5 mL Lentivirus和0.5 mL培养液，以体积比1:1混合,加入浓度为10 μ g/mL的聚凝胺I μ L，将病毒加入细胞，置于32°C培养箱14-16h，移回37°C培养箱孵育，4-6h，更换新鲜培养液，在37°C培养箱继续培养，感染48-52h，转入IOOmm培养皿，1-1.5h加入含有浓度为600ng/ mL的Puromycin的选择性培养液；每隔2_3天更换选择性培养液，2-3周获得稳定转染的细胞；
其4 shRNA病毒载体感染转染BMPR-1B基因的Hek293细胞系步骤感染前按每孔4 X IO5个/mL的密度将表达BMPR-1B的Hek293细胞接种于六孔板，用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，24_26h备用；将500 μ L的shRNA干扰病毒与500 μ L含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，以体积比1:1混合，同时加入IuL 10 μ g/mL的Polybrene，24_30h，更换含10%胎牛血清的DMEM完全培养液，再培养24-28h收获细胞；用Trizol法提取总RNA ；
其5 shRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价PCR 反应体系:2 X master mix 10 μ L,上下游，即 10pm，即 0.8 μ L ;cDNA 2μ L ；
PCR反应条件:95°C 10s, 58°C 20s, 72°C 20s，55个循环后进入溶解曲线分析程序:40°C -99°C，即为0.10C /s ;通过定量分析，shl475干扰分子能够有效抑制99.78% BMPR-1B
基因的表达。本发明的实践意义与技术效果:多胎性状是绵羊重要的经济性状之一 ；BMPR_IB基因是小尾寒羊，湖羊等多个绵羊品种的多胎主效基因；本研究应用分子克隆技术，细胞培养技术，荧光定量PCR技术，针对绵羊的BMPR-1B基因序列设计了 I个shRNA干扰分子，并检测了 BMPR-1B基因的mRNA表达量变化，结果显示，该shRNA干扰分子具有显著抑制效果，能够有效抑制99.78%BMPR-1B基因的表达；本发明为阐明BMPR-1B基因的作用机制，培育多胎绵羊品种提供技术支持，彰显技术进步。
具体实施例方式本发明结合实施例作进一步说明。依据GeneBank 中绵羊 BMPR-1B 基因，S卩 NM-001009431.1 序列；设计 2 条 shRNA 分子，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上，构建了慢病毒干扰RNA质粒，将pLL-BMPR-1B-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T细胞产毒，经荧光定量PCR检测，得到了 I个能显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子；所用引物(略)；
I) shRNA慢病毒载体的构建
各取IOUL IOuM的两条siRNA寡核苷酸(正链和互补链)，加入8 μ L IOXannealingbuffer和12 μ L灭菌超纯水，煮沸IOmin后自然冷却至室温，同时pLL3.7质粒载体经XhoI和HpaI双酶切后回收线性化质粒，与退火产物4°C过夜连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，LB平板氨苄青霉素(100ug/uL)筛选；用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆并送上海生工测序鉴定序列正确后，提取纯化重组质粒用于转染。2) plex-bmpr-1b、Lv-BMPR-lB-shRNA 慢病毒的制备 第一日:铺板(上午10-11时)
每IOcm面积中铺3X IO6个293T细胞，保证第二天细胞在完全培养液中汇合度达到80%-90% ；
第二日:Lipectamine2000脂质体转染(下午2-3时)
首先在聚丙烯管内准备脂质体和DNA复合物；
加入1.5ml预热的OPT1-MEMs I培养基后，按比例加入目的载体及病毒包装载体，轻轻混勻，室温放置；其中加入的比例位:转染载体Iv- bmpr-1b -shRNA 12ug、包装质粒REV6ug、pMDL 6ug、包膜质粒 VSVG 6ug、转染载体 plex-bmpr-1b 12 ug、包装质粒 Pspax2 9ug、包膜质粒 PMD2.G 3.5 ug;
在使用Lipictamine2000之前先轻轻混匀脂质体，而后在另一个聚丙烯管中加入
1.5mL预热的OPT1-MEMs I培养基，再加入50uL Lipictamine2000,轻轻混匀后室温放置；在室温放置5分钟后，将上述稀释好的 DNA与脂质体混合，混合物质于室温孵育20min,在此期间可以用OPT1-MEMs I培养基洗待转染的细胞一次；注:由于293T细胞易脱壁，故整个过程中操作须轻缓，可以先将细胞培养板倾斜，将液体沿板壁慢慢加入，再慢慢放正细胞板。然后将脂质和DNA复合物加入细胞，上下倾斜细胞板使液体均匀覆盖在细胞表面，37°C培养4h后，换IOmL新鲜的DMEM完全培养基，继续培养48h后收集病毒，此时的病毒能直接用来转染，或置于_70°C备用。3)重组Lentivirus感染Hek293细胞系的步骤
转染前一天按每孔4X IO5个/mL的密度将Hek293细胞系接种于六孔板，保证转染时汇合度达到60-70%;将滤过的重组0.5 mL Lentivirus和0.5 mL培养液(体积比1:1)混合，同时加入I μ L聚凝胺(polybrene)(终浓度为10yg/mL)，将病毒加入细胞，然后，把细胞置于32°C培养箱14-16h后移回37°C培养箱孵育，4-6h后更换新鲜培养液，37°C培养箱继续培养。感染48h后,转入IOOmm培养皿，Ih后加入Puromycin (终浓度为600ng/ mL)选择性培养液；为了获得稳定整合外院基因的细胞，每隔2-3d更换含PuiOmycin选择性培养液，通常14-21d，即获得稳定转染的细胞。4 ) shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系
感染前一天按每孔4 X IO5个/mL的密度将表达BMPR-1B的Hek293细胞接种于六孔板，用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，24h后细胞达到70-80%汇合度时；将500 μ L的ShRNA干扰病毒与500 μ L含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞(体积比1:1)混合，同时加入I μ L 10 μ g/mL的Polybrene , 24h后,更换为含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，再培养24h后收集细胞，用Trizol法提取总RNA。5) shRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价
上述感染细胞的总RNA经反转录成cDNA后，通过荧光定量PCR对BMPR-1B基因表达进行相对定量分析，评价对BMPR-1B基因表达的抑制效果；定量分析方法如下=Realtime PCR荧光染料SYBR Green I购自TAKARA公司试剂进行Real Time PCR反应体系为:2 X master mix 10 μ L,上下游(10pm)个 0.8 μ L ;cDNA 2yL。PCR 反应条件为:95°C10s, 58°C 20s, 72°C 20s, 55个循环后进入溶解曲线分析程序:40°C -99°C (0.1°C /s)。通过相对定量分析得出:shl475干扰分子能够有效抑制99.78% BMPR-1B基因的表达。本实验选用的Opt1-MEM培养液和DMEM培养液，购自美国Gibco公司；XhoI和HpaI限制性内切酶，购自日本TAKARA公司；pLL3.7载体由周文来，即美国加州大学圣地亚哥分校医学部，霍华德休斯医学研究所提供；Pspax2 ；VSVG由李文蓉，即美国克罗拉大学提供；plex载体购 自美国Openbiosystem公司；包装质粒pMDL, REV, PMD2.G购自美国biosystem 公司。
权利要求
1.一个抑制BMPR-IB基因表达合成的ShRNA分子，其特征在于其碱基序列的上游5’ TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’ ；下游5，TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3，。
全文摘要
本发明提供的一个抑制BMPR-lB基因表达合成的shRNA分子，其碱基序列为上游:5’TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’；下游:5’TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3’。本发明涉及能够对骨形成蛋白受体-lB(BMPR-lB)基因产生显著抑制作用的小干扰RNA分子的设计、合成和抑制作用在Hek293细胞上的评价方法。
文档编号C12N15/113GK103255143SQ20131002598
公开日2013年8月21日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月24日
发明者黄俊成, 林嘉鹏, 汪立芹, 吴阳升, 金贤华, 韩冰, 刘莉, 赵云程 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心