大草蛉p450新基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重要天敌昆虫大草蛉(Chrysopa?septempunctata)P450新基因DNA序列及其编码的蛋白质序列，填补了脉翅目昆虫中P450基因分子信息的缺乏，为P450基因在天敌昆虫抗药性中的作用机制等研究提供了新的基因。在害虫综合防治领域具有良好的应用前景。
【专利说明】大草蛉P450新基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，涉及大草蛉(Chrysopaseptempunctata) P450家族基因的克隆及应用。
【背景技术】
[0002]大草蛉是蚜虫、叶螨、鳞翅目卵及低龄幼虫等多种农林害虫的重要天敌，是害虫生物防治中极具应用价值的一种天敌昆虫。细胞色素P450单加氧酶系,又名多功能氧化酶，是一类具有血红素结合位点的超基因家族蛋白。目前，已发现的昆虫P450主要有两方面的功能:一是催化内源性物质(如蜕皮激素、保幼激素、留醇、脂肪酸及信息激素等)的生物合成和降解，维持生命体的正常功能；二是针对外源性物质(如杀虫剂、植物次生物质及诱变剂前体等)起到解毒与活化的作用。其中细胞色素P450对杀虫剂的代谢作用增强是大多数昆虫对杀虫剂产生抗药性的主要机制。昆虫在长期的进化过程中获得了适应各种复杂环境的能力，在此过程中，解毒酶系(尤其是P450酶系)的诱导，能够帮助昆虫解毒对自身有毒而不利于生存的各种外源和内源化合物，从而增强其自我保护和对外界环境的适应能力。
[0003]化学农药的大量使用，产生抗药性的害虫种类及数量在不断增加，随着分子生物学的飞速发展，昆虫P450基因不断被分离、克隆并实现体外表达，其结构、功能、表达调控及与昆虫抗药性研究的关系不断深入，但是在大敌昆虫中还没有相关的研究。因此本发明以大草蛉为材料，克隆了四种大草蛉P450基因，并对其编码的氨基酸序列、同源性及进化地位进行分析，为研究P450基因家族的功能及进化研究提供新的P450基因片段，为研究P450基因在天敌昆虫抗药性中的作用机制提供了新的基因材料和方法。
【发明内容】
[0004]本发明包括以下内容:
[0005]1.提供了一种克隆大草蛉P450基因的引物及其克隆方法。
[0006]2.本发明从大草蛉幼虫中克隆得到四个新的P450基因片段。
[0007]3.本发明提供了大草蛉P450基因的应用方法。
[0008]有益效果
[0009]本发明以大草蛉幼虫为材料，克隆了大草蛉P450基因cDNA序列4个，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对大草蛉P450基因进行了研究，并对其编码的蛋白序列特征、同源性、进化地位进行了分析，为进一步研究大草蛉P450基因的表达、调控奠定了基础，为P450基因参与昆虫抗药性产生提供参考，同时也为脉翅目昆虫P450基因功能研究和进化研究提供了新材料。同时该系列基因也可应用于天敌昆虫抗药性作用机制等基础研究，为培育抗药性天敌昆虫优势品种及其利用提供理论基础。 [0010]下面将引用非限定性实例对本发明作进一步的说明。
【具体实施方式】[0011]实例I
[0012]大草蛉P450基因中间片段的克隆
[0013]1、提取总RNA:采用Trizol法一步提取大草蛉幼虫的总RNA。
[0014]2、cDNA第一链合成:参考北京全式金生物技术有限公司cDNA第一链合成试剂盒说明书进行，具体为:取总 RNA3y 1、oligo(dT)18 引物 1μ 1、2XTS Reaction MixlOy 1，Transcript RT/RI Enzyme mixlμ I, RNase-free H2O 加至 20 μ I,混匀，42 V 30min,85°C 5min，4°C冷却，_20°C保存备用。
[0015]3、PCR扩增大草蛉P450基因的中间片段:根据昆虫P450基因的保守序列设计简并引物(引物如下)，以cDNA为模板，PCR扩增大草蛉P450基因的中间片段；
[0016]S1:5’ -ACNYTYATGTTYGARGGHCAYGAYAC-3’
[0017]Al:5’ -CDATRCARTTTCKKGRHCCDGC-3，
[0018]链式聚合酶反应(PCR扩增)所用的反应试剂组成及反应条件如下:首先将下述试剂混合在一起，
[0019]模板cDNAlyl
[0020]脱氧核苷 酸底物dNTP4 μ I[0021 ] Ex-Taq DNA 聚合酶 0.5 μ I
[0022]10 X Taq DNA聚合酶缓冲液5 μ I
[0023]正向引物(10μ Μ)2 μ I
[0024]反向引物(10μ Μ)2 μ I
[0025]ddH2035.5 μ I
[0026]总体积50 μ I
[0027]反应条件为:首先94°C预变性3分钟，然后进行如下循环:94°C 30秒，57°C 30秒，720C I分钟，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟，4°C保存备用。
[0028]4、PCR产物纯化:利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自北京天根生物科技公司)对PCR产物回收、纯化，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
[0029]5、PCR产物连接、转化与鉴定:取5μ I上述PCR纯化产物，连接于pMD19-T simple载体(大连宝生物工程有限公司产品)，反应体系如PMD19-T simple载体试剂盒所示，然后转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO，涂布与含Amp的LB平板上于37°C静置培养，挑取单菌落进行培养，使用克隆载体PMD19-T simple上通用引物M13-47和RV-M进行菌液PCR鉴定含P450中间片段的阳性克隆子。
[0030]6、将步骤5所得的阳性克隆子送上海生工生物技术有限公司进行序列测定，将所得序列与GenBank数据库序列进行比较。
[0031]实例2
[0032]吡虫啉对大草蛉P450的诱导
[0033]以吡虫啉对大草蛉三龄幼虫进行诱导，并提取诱导后4h.8h.16h的大草蛉幼虫RNA,经DNA酶消化后反转录成cDNA，用实时荧光定量对不同时间P450mRNA的变化情况进行检测，以actin基因作为内参。用2_Λ Δετ方法计算Ρ450基因的相对表达量，以对照组的表达量设为1，诱导后不同时间的的表达为相对于对照组的变化倍数(表1)。
[0034]表1.诱导后不同时间的的表达为相对于对照组的变化倍数
【权利要求】
1.一种大草蛉4个P450基因的cDNA序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4 所述。
2.权利要求1所述大草蛉4个P450基因，其氨基酸序列如SEQID NO:5_SEQ ID NO:8所述。
3.权利要求1所述大草蛉P450cDNA的克隆方法，包括以下步骤: (1)从大草蛉幼虫中提取总RNA，然后反转录进行cDNA第一链的合成； (2)根据昆虫P450基因家族基因的保守序列设计简并引物:
S1:5’ -ACNYTYATGTTYGARGGHCAYGAYAC-3’
Al:5’ -CDATRCARTTTCKKGRHCCDGC-3’ (3)以cDNA为模板，PCR扩增大草蛉P450基因的中间片段； (4)纯化步骤(3)所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pMD19-Tsimple载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，37°C平板培养，挑取单菌落进行培养，使用克隆载体PMD19-T simple上通用引物M13-47和RV-M进行菌液PCR鉴定含P450中间片段的阳性克隆子。 (5)将步骤4所得的阳性克隆子送上海生工生物技术有限公司进行序列测定，将所得序列与GenBank数据库序列进行比较。
4.权利要求1所述大草蛉P450基因cDNA在大草蛉抗药研究中的应用，用吡虫啉对大草蛉三龄幼虫进行诱导，提 取诱导后4h，8h, 16h的大草蛉总RNA，并用Takara DNA酶去除基因组DNA，并根据这四个P450基因设汁荧光定量引物，运用荧光定量的方法对吡虫啉诱导后这个4个P450基因的转录情况进行了分析，以actin基因作为内参。
【文档编号】C12N9/02GK103966242SQ201310027131
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月25日 优先权日:2013年1月25日
【发明者】曾凡荣, 刘昌燕, 毛建军 申请人:中国农业科学院植物保护研究所